Birbirine Bağlı Nöronların Mikron Ölçekli Organizasyonu için Manyetik Platformların İmalatı

Yaklaşımımız, manyetik manipülasyonlar kullanarak sinir ağı oluşumunu kontrol etmeyi mümkün kılar. Bu, ağların in vitro çalışmaları için etkili bir araçtır ve biyointerör cihazları için yeni terapötik yön sunar. Bu teknikle hem hücrenin konumunu hem de mikron ölçeğindeki büyümesini kontrol edebilir, manyetik desenin ve dolayısıyla ağ organizasyonunun esnek bir şekilde tasarlanmasını sağlayabiliriz.

Verimli ve toksik olmayan manyetik nanopartikül steriloptik çok önemlidir. Başarılı olmak için uygun manyetik nanopartiküllere ihtiyaç vardır. Önemli özellikler boyut, kaplama ve durum manyetizasyon değeridir.

Prosedürleri gösterenler Reut Plen ve Dafna Levenberg olacak, laboratuvarımın yüksek lisans öğrencileri. Başlamak için, cam slaytları bir katip kalemi kullanarak ikiye iki santimetreye bölün. Cam slaytları aseton ve ardından izopropanol bir ultrasonikasyon banyosunda her biri beş dakika temizleyin.

Daha sonra ultra yüksek saflıkta azotla kurutun. Camı 1,5 mikrometre kalınlığına elde etmek için 60 saniye boyunca 6.000 RPM'de spin kaplaması kullanarak fotoresistle kaplayın ve 60 saniye boyunca 100 santigrat derece pişirin. İstenilen deseni elde etmek için fotomask veya maskesiz litografi kullanarak örneği bir ışık kaynağına maruz bırakın.

Üreticinin talimatlarına göre damıtılmış suda seyreltilmiş bir geliştiricide numuneyi 40 saniye boyunca geliştirin. Daha sonra 45 saniye suda yıkayın ve UHP azot gazı ile kurutun. Deseni optik mikroskop altında inceleyin.

Numuneyi biriktirme sisteminin yük kilidi haznesine yerleştirin ve baz basıncını bekleyin. Numuneyi ana bölmeye aktarın ve numuneyi biriktirme için uygun yüksekliğe ayarlayın. İstenilen oran elde edilene kadar her hedefteki gücü artırın.

Dönüşü açın, ardından sırasıyla hedef panjurları açıp kapatarak kobalt, demir ve paladyum hedefleri arasında değişen ferromanyetik çok katmanlıyı yatırın. 14 bilayer kobalt demir paladyum biriktirin ve ek bir paladyum kapak tabakası ile bitirin. Biriktirme tamamlandıktan sonra, örneği biriktirme sisteminden boşaltın.

Numuneyi asetonda 30 dakika bekletin ve izopropanol ile durulayın. Daha sonra UHP azot ile kurutun ve mikroskop altında inceleyin. Kullanıma kadar temiz ve kuru bir ortamda saklayın.

Ferromanyetik çok katmanlılarla birleştirilmiş 100 mikrometre genişliğinde çapraz şekilli manyetik çubuklu bir cam slayt kullanın. Örneği çift taraflı bant kullanarak tutucuya takın. Çapraz elektrodun her bacağında bir tane olmak üzere numuneye dört tel yapıştırmak için bir tel yapıştırıcı kullanın.

Numune tutucuyu ve numuneyi manyetik alanla taşıma ölçüm sisteminin içine ayarlayın, böylece manyetik alan örneğe dik olacak şekilde ayarlayın. Metin el yazmasında açıklandığı gibi enine voltaj ölçümleri yapın. Manyetik alanı süpürün ve alanın bir fonksiyonu olarak enine voltajı ölçün.

Filmdeki dik manyetizasyonla orantılı anormal Hall sinyalini belirlemek için enine direnci manyetik alanın bir işlevi olarak çizin. Metin el yazmasında açıklandığı gibi PC12 hücre kültürü için temel büyüme ortamı ve farklılaşma ortamı hazırlayın. Tedavi edilmeyen bir kültür şişesinde 10 mililitre temel büyüme ortamı ile hücreleri büyütün ve her iki ila üç günde bir şişeye 10 mililitre orta ekleyin.

Sekiz gün sonra hücreleri alt kültüre edin. Hücresel alım için, hücre süspansiyonu 200 G ve oda sıcaklığında sekiz dakika santrifüjleyin, ardından süpernatantı atın. Hücreleri üç mililitre taze temel büyüme ortamında yeniden biriktirin.

Hücreleri beş dakika boyunca tekrar santrifüjleyin, sonra süpernatantı atın ve hücreleri üç mililitre taze farklılaşma ortamında yeniden biriktirin. Hücre kümelerini parçalamak için bir şırınga ve iğne kullanarak hücreleri 10 kez epire edin, ardından hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve normal, kaplamasız 35 milimetrelik bir tabakta bir milyon hücreyi tohumlayın. İstenilen MNP konsantrasyonunu elde etmek için çanağa hesaplanan MNP süspansiyon ve farklılaşma ortamını ekleyin.

Hücreleri, MNP'leri ve farklılaşma ortamını karıştırın, ardından kabı 24 saat boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit nemlendirilmiş inkübatörde kuluçkaya yatırın. Desenli substratı % 70 etanol ile temizleyin ve kaputtaki 35 milimetrelik bir kültür kabına yerleştirin. Desenli substratın altına bir dakika boyunca büyük bir mıknatıs yerleştirin, ardından kabı yukarı ve uzağa hareket ettirerek ve mıknatısı kaputtan çıkararak çıkarın.

Ultraviyole ışığını 15 dakika açın. Kollajen kaplı bir cam substrat hazırlamak için, kollajen tip bir% 30 etanolde bir ila 50 oranında seyreltin. Camı çözelti ile örtün.

Tüm çözelti buharlaşana kadar kabı kaputta dört saat açık bırakın, ardından steril PBS'de üç kez yıkayın. Hücreleri inkübatörden çıkarın, hücre süspansiyonu 200 G'de beş dakika santrifüjleyin ve süpernatantı atın. Hücreleri bir mililitre taze farklılaşma ortamında yeniden biriktirin ve hemositometre kullanarak hücreleri sayın.

35 milimetrelik bir kültür çanasında alt tabakanın üstündeki beş hücreye 10 tohum ve iki mililitrelik farklılaşma ortamı ekleyin. Kültürü 37 santigrat derecede %5 karbondioksit nemlendirilmiş inkübatörde kuluçkaya yatırın. 24 saat sonra, hücrelere bir ila 100 taze murine beta-NGF ekleyin.

Farklılaşma ortamını yenileyin ve her iki günde bir taze beta-NGF ekleyin. Hücreleri iki günde bir ışık mikroskopisi kullanarak görüntüleyin ve ağ oluşumundan sonra hücreler üzerinde immünostaining gerçekleştirin. Farklı geometrik şekillere sahip manyetik platformlar imal edilmiş ve floresan demir oksit MNP'ler çekirdeklenme ile sentezlenmiştir.

MNP'lerin manyetometrik ölçümleri, manyetizasyon eğrisinin histegenez, düşük doygunluk alanı ve nispeten yüksek manyetizasyon doygunluğu olmadığını göstermektedir. PC12 hücreleri, demir oksit floresan MNP'lerle karıştırılarak orta derecede inkübe edildi ve manyetik birimlere dönüştürüldü. MNP'ler hücrelere içselleştirildi'soma, ama çekirdekte değil.

Ortadaki MNP konsantrasyonundaki artışla hücrelerin içindeki demir konsantrasyonu arttı. MNP yüklü PC12 hücrelerinin farklı MNP konsantrasyonları için uygulanabilirliği, Shoal analizi kullanılarak MNP yüklü hücrelerin morfolojik parametreleri karşılaştırılarak kontrol hücrelerinden hiçbir fark gösterilmeyerek değerlendirildi. XTT ve Resazurin bazlı tahliller, değerlendirilen MNP konsantrasyonlarının hücrelere karşı anlamlı bir sitotoksiklik göstermediğini doğruladı.

MNP tedavisi olan ve olmayan PC12 hücreleri manyetik bir substrat üzerinde büyütülüp farklılaştırılarak farklılaştırıldırıldı. Mıknatıslı hücrelerin manyetik desenlere bağlanıp desenlere göre dalları büyüttkleri, MNP tedavisi olmayan hücrelerin ise manyetik cihazlara hiçbir yakınlığı olmadan büyüdükleri tespit edildi. Hücrelerin altıgen geometriye sahip bir alt tabaka üzerinde konumlandırılması burada gösterilmiştir.

MNP yüklü hücre gövdelerinin %75'i manyetik çizgilerle temas halindeyken, sünnetsiz hücrelerin sadece %35'i çizgiler üzerinde bulunuyordu. Hücre konumlandırma etkisine ek olarak, bu manyetik platformların büyüyen nötralizlerin yönünü kontrol ettiği bulunmuştur. Nöronal büyüme yönlülüğü üzerindeki manyetik etkiyi değerlendirmek için, nötraller ve manyetik şeritler arasındaki açı ölçüldü ve manyetik çizgilerin yönelimi ile önemli bir korelasyon gösterdi.

Bu prosedür, ilaçlar gibi aktif bileşikleri manyetik nanopartiküllere yönlendirdikten sonra yönlendirmek için kolayca uyarlanır. Yüksek verimli ilaç tarama testlerine veya dokular içinde lokal tedaviye çevrilebilir. Bu yeni yaklaşım, manyetik çekici yapılar ekleyerek diğer substratları veya cihazları işlevselleştirmek için yeni olanaklar açar.

Şu anda, geliştirilmiş biyouyumlu nöron çip arayüzleri geliştiriyoruz.