Fibroblastlardan Nöronal Progenitör Hücrelere Doğrudan Dönüşüm ve Astrositlere Farklılaşma Kullanarak Nörolojik Hastalıklar için İn vitro Modelleme

Bu protokolü hasta cilt fibroblastlarından nöral progenitör hücreler yapmak ve nörolojik ve nörodejeneratif hastalıkları incelemek için kullanıyoruz. Bu protokolün, hız da dahil olmak üzere klasik IPS teknolojisine göre birçok avantajı olduğunu, aynı zamanda bazı durumlarda daha ağır bir hastalık fenotipi elde ettiğimizi hissediyoruz. Nörolojik ve nörodejeneratif hastalıkları inceliyoruz ve cilt örneklerini kullanmak hastaların çeşitliliğini de değerlendirmemizi sağlıyor.

Laboratuvarım özellikle astrositlerin hastalıklardaki rolüyle ilgileniyor ve NPC'lerden yaptığımız astrositleri ilaçları test etmek ve aynı zamanda hastalık mekanizmalarını incelemek için kullanıyoruz, aynı zamanda insan ve fare nöronlarıyla ortak kültürlerde. Bu protokolün bilgilendirici olacağını umuyoruz ve herhangi bir sorunuz varsa lütfen ulaşın. Teşekkürler.

Hücre bankalarından veya cilt biyopsilerinden elde edilebilen birincil insan derisi fibroblastlarını kullanın. %5 CO2 doku kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede kültür hücreleri. Deneyde kullanılmadan önce çözülme sonrası en az bir ila iki pasaj için geçiş hücreleri.

Hücreler hazır olduğunda, oda sıcaklığında 15 ila 20 dakika boyunca PBS'de seyreltilmiş 1:200 konsantrasyonda insan fibronektinli altı kuyulu bir plakanın kuyusunu kaplayın. Fibroblast medyasını tablo 1'de gösterildiği gibi hazırlayın. Hücreler kaplanmaya hazır olduğunda, fibronektinleri tabaktan çıkarın ve hemen hücre çözeltisi veya iki mil fibroblast ortamı ekleyin.

Ortam eklemeden önce yemeğin kurumasına izin vermeyin. Hücrelerin ne kadar hızlı büyüdüğüne bağlı olarak, insan fibronektin kaplı altı kuyu plakasının iki kuyusunda 150.000 ila 200.000 fibroblast plaka. %5 CO2 doku kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede kültür hücreleri.

Tohumlamadan sonraki gün, mikroskop altındaki fibroblastları kontrol edin ve hücre yoğunluğunun dört retroviral vektörle birlikte% 70 ila% 85 Arasında olduğunu doğrulayın:Eki3/4, Klf4, Sox2 ve c-Myc. Hızlı büyüyen için 10 veya yavaş büyüyen fibroblastlar için 15 enfeksiyon çokluğu kullanın. Transdüksiyon verimliliği her vektör için% 70 veya daha fazla pozitif hücreyi aşmalıdır.

Kuyu başına toplam bir mil hacim için viral karışıma düzenli fibroblast ortamı ekleyin. İkinci iyi tedavi edilmemiş bırakın ve bir gecede kuluçkaya yatmak için hücreleri doku kültürü inkübatörüne geri döndürün. Transdüksiyondan sonraki gün, hücreleri PBS ile bir kez yıkayın ve bir mil taze fibroblast ortamı ekleyin.

%5 CO2 doku kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede kültür hücreleri. Ertesi gün, tablo birde gösterildiği gibi dönüştürme ortamı hazırlayın ve artık fibroblast ortamından kurtulmak için pbs ile bir kez hücreleri yıkayın, ardından bir mil dönüştürme ortamı ekleyin. Tedavi edilmeyen kuyunun medyasını da dönüştürme ortamı olarak değiştirin.

Mikroskop altındaki hücreleri gözlemleyin ve morfolojideki değişiklikleri izleyin. Hücre ortamı, dönüştürme işlemi boyunca her gün bir ila iki mil dönüştürme ortamı ve sonraki iNPC kültürü için değiştirilmelidir. Hücrelerin ortamın kalan %30'unda kapalı kalmasını sağlarken% 70 medyayı kuyudan dikkatlice çıkararak ortamı değiştirin.

Bir ila iki mil dönüştürme ortamıyla hücreleri gözlemlemeye ve medyayı günlük olarak değiştirmeye devam edin. Dönüşüm medyasında yaklaşık beş ila altı gün sonra veya hücreler çok yoğun hale geldiğinde, onları bir ila iki veya maksimum bir ila üç arasında iletin. Accutase'yi ısıtın ve oda sıcaklığında 15 ila 20 dakika pbs'de 1:200 seyreltilmiş bir mil toplam fibronektin ile altı kuyulu bir plakada uygun sayıda kuyuyu kaplayın.

Hücreleri, herhangi bir hücreyi ayırmadan PBS ile dikkatlice yıkayın. PBS'yi hücrelere nazikçe uygulamak için kuyunun duvarını kullanın. PBS'yi pipetlerle veya aspirasyon yaparak dikkatlice çıkarın.

500 mikrolitre Accutase ekleyin ve bir doku kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede iki ila üç dakika kuluçkaya yatır. Çoğu hücrenin ayrıldığını doğrulamak için mikroskop altında kontrol edin. Hücreler çıktıysa, iki mil taze dönüştürme ortamı ekleyin ve kümeleri ayrıştırmak için iki ila üç kez yavaşça yukarı ve aşağı pipet ekleyin.

Hücreleri 15 millik bir tüpte toplayın ve Accutase'yi daha da seyreltmek için üç mils ortam ekleyin. Oda sıcaklığında 200 G'da dört dakika santrifüjleyin. Hücre peletinden süpernatant çıkarın ve hücreleri bir mil taze ortamda yeniden biriktirin.

Hücre kümelerini çözmek için iki ila üç kez yavaşça pipet yukarı ve aşağı. Fibronektin kaplamalı altı kuyudan çıkarın ve her kuyuya hemen bir mil taze ortam ekleyin. 1:2'lik bir bölünme oranı için, bir kuyuya 500 mikrolitre, ikinci bir kuyuya da 500 mikrolitre ekleyin.

Kuzey-güney doğu-batı yönünde altı kuyuyu hafifçe sallayarak hücreleri dağıtın ve 37 derece doku kültürü inkübatörü koyun. Ertesi gün mikroskop altındaki hücreleri gözlemleyin ve bir ila iki mil ile ortam değiştirin. Hücreler yeniden bölünmeye hazır olana kadar her gün ortam değiştirin.

FGF içeren NPC medyasını, tablo 1'de görüldüğü gibi EGF veya heparin olmadan daha fazla konsantrasyonda hazırlayın. Bu yeni bölmede, dönüşüm medyasındaki hücrelerin bir kuyusunun tohumunun, diğerinin de NPC medyasında. Bir ila iki mil NPC ortamıyla iNPC'lerin medyasını her gün değiştirmeye devam edin.

Astrosit ortamlarını tablo bire göre hazırlayın. Taze iNPC'lerden astrosit yapmak için, iNPC'leri doğrudan 10 mil astrosit ortamlarında 10 santimetre fibronektin kaplı plakalarda tohumlayın, böylece ertesi gün yaklaşık% 10 iklüzyondurlar. %5 CO2 doku kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede kültür hücreleri.

Kaplamadan üç gün sonra 10 mil astrosit ortamla ortamı değiştirin. Hücreleri beş ila yedi gün boyunca farklı tutun. Deneme için tohumlama için, 2.

Önerilen tohumlama yoğunlukları tablo ikiye dahildir. İndüklenmiş astrositler oluşturmak için iNPC'lerin nasıl bölümlendirılacağına ilişkin yönergeler tablo üç'te bulunur. Dondurulmuş iNPC stoklarından astrosit yapmak için, sıvı azot depolama tankından porsiyon stok dosyasını çıkarın ve 37 santigrat derecede hızla çözün.

Hücreler çözülür çözülmez, beş mil astrosit ortamı içeren 15 millik bir tüpte pipet hücresi çözeltisi. 200 G oda sıcaklığında dört dakika santrifüjleyin. Bir mil taze astrosit ortamında süpernatant ve resuspend çıkarın.

Fibronektin kaplı 10 santimetrelik bir yemeğe dokuz mil taze astrosit ortamı ekleyin ve kuzey-güney doğu-batı hareketinde hücreleri hafifçe dağıtarak bir mil hücre çözeltisi ekleyin. %5 CO2 doku kültürü inkübatöründe 37 santigrat derecede kültür hücreleri. Bu protokol, Yamanaka faktörlerini içeren retrovirüsler kullanarak doğrudan insan derisi fibroblastlarından iNPC'lerin hızlı ve kolay üretilmesini sağlar.

Bu yöntem, kök hücre durumunu ve klon seçimi ihtiyacını atlayarak klonal varyasyonu önlemeye izin verir. Hücreler dönüşüm sürecinden geçerken akılda tutulması gereken önemli adımlar fibroblast tohumlama yoğunluğu, ortam pH'ı ve hücrelerin optimum bir izdiahta tutulmasıdır. Dönüşüm işlemi sırasında optimum izdiah ve morfoloji değişikliklerine örnekler şekil 1'de bulunabilir.

Dönüştürme işlemi tamamlandıktan sonra, NPC'ler fibroblast belirteçlerinin ve morfolojisinin güçlü bir şekilde azaltılmış ifadesini veya ifadesini göstermez ve NPC'ye özgü hücre işaretlerini ifade edecektir. Ayrıca, indüklenmiş nöronlar, oligodendrositler ve astrositler gibi farklı hücre hatları üretmek için de kullanılabilirler. Deneyimlerimize göre, özellikle indüklenmiş astrositler, saf popülasyonlarda tekrarlanabilir çok sayıda üretilebildiği için ilaç ve hastalık mekanizması testi için çok değerlidir.

İndüklenen astrositler, bölme sırasında küçük bir hücre aliquot'u veya daha önce dondurulmuş bir iNPC kısmı alınarak ve doğrudan astrosit ortamlarında kaplama yapılarak iNPC'lerden ayırt edilebilir. Bu işlem sırasında önemli hususlar, yüksek tohumlama yoğunluğunun farklılaşma sürecini engellediği gösterildiği için iNPC'lerin ilk tohumlama yoğunluğunu düşük tutmak ve asitleşmenin sağlıklı astrositleri bile aktive edebileceği için medya pH'ına ek dikkat gösterilmesidir. Özetle, doğrudan dönüşüm protokolü, hasta cilt örneklerinden nöral progenitör hücreler yapabilmek için çok hızlı bir yöntemdir.

Bu, aynı anda daha fazla sayıda hücre örneğini incelemeyi ve hastalık bağlamındaki çeşitliliğe gerçekten bakmayı sağlar. Bunun, nöral progenitör hücreler, nöronlar, aynı zamanda ortak kültürde veya kendileri tarafından uyuşturucu testi veya mekanistik çalışmalar için de kullanılabilecek astrositler yapmak için kullanabileceğiniz çok güçlü bir test olduğunu hissediyoruz.