Name: Tüm Kromozomları, Telomerleri ve Gen Locilerini Ortaya Çıkarmak için DNA Halo Preparatlarında Floresan In Situ Hibridizasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Keşfedin, DNA halo preparatları ve floresan in situ hibridizasyon ile kanser ve progeria hücrelerinde nükleoskelet bağlanmalarını yüksek çözünürlükte analiz etme yöntemini. Bu protokol, genomik organizasyonu maliyet etkin şekilde araştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Prof. Michael Bittner'e kromozom kol boyama problarının nazik hediyesi için teşekkür ederiz. LG, AB tarafından finanse edilen EURO-Laminopatiler projesi ve Brunel Progeria Araştırma Fonu tarafından desteklendi.

<ol><li>Berezney, R., Coffey, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+nuclear+protein+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of a nuclear protein matrix.</a> Biochemical Biophysical Research Communications. 60 (4), 1410-1417 (1974).</li>
<li>Haaf, T., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+ordering+of+YAC+contigs+using+extended+chromatin+and+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">High resolution ordering of YAC contigs using extended chromatin and chromosomes.</a> Human Molecular Genetics. 3 (4), 629-633 (1994).</li>
<li>Parra, I., Windle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+visual+mapping+of+stretched+DNA+by+fluorescent+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">High resolution visual mapping of stretched DNA by fluorescent hybridization.</a> Nature Genetics. 5 (1), 17-21 (1993).</li>
<li>Senger, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Released+chromatin%3A+linearized+DNA+for+high+resolution+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Released chromatin: linearized DNA for high resolution fluorescence in situ hybridization.</a> Human Molecular Genetics. 3 (8), 1275-1280 (1994).</li>
<li>Florijn, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+DNA+Fiber-FISH+for+genomic+DNA+mapping+and+colour+bar-coding+of+large+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">High-resolution DNA Fiber-FISH for genomic DNA mapping and colour bar-coding of large genes.</a> Human Molecular Genetics. 4 (5), 831-836 (1995).</li>
<li>Elcock, L. S., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+on+DNA+halo+preparations+and+extended+chromatin+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization on DNA halo preparations and extended chromatin fibres.</a> Methods Molecular Biology. 659, 21-31 (2010).</li>
<li>Heiskanen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+mapping+by+fiber-FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Visual mapping by fiber-FISH.</a> Genomics. 30 (1), 31-36 (1995).</li>
<li>Bensimon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alignment+and+sensitive+detection+of+DNA+by+a+moving+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alignment and sensitive detection of DNA by a moving interface.</a> Science. 265 (5181), 2096-2098 (1994).</li>
<li>Michalet, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+molecular+combing%3A+stretching+the+whole+human+genome+for+high-resolution+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dynamic molecular combing: stretching the whole human genome for high-resolution studies.</a> Science. 277 (5331), 1518-1523 (1997).</li>
<li>Wilson, R. H., Coverley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+DNA+replication+and+the+nuclear+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">Relationship between DNA replication and the nuclear matrix.</a> Genes Cells. 18 (1), 17-31 (2013).</li>
<li>Wilson, R. H. C., Coverley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation-induced+changes+in+the+DNA-nuclear+matrix+interface%2C+revealed+by+high-throughput+analysis+of+DNA+halos%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Transformation-induced changes in the DNA-nuclear matrix interface, revealed by high-throughput analysis of DNA halos.</a> Science Reports. 7 (1), 6475(2017).</li>
<li>Iarovaia, O. V., Akopov, S. B., Nikolaev, L. G., Sverdlov, E. D., Razin, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+transcription+within+chromosomal+DNA+loops+flanked+by+MAR+elements+causes+an+association+of+loop+DNA+with+the+nuclear+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Induction of transcription within chromosomal DNA loops flanked by MAR elements causes an association of loop DNA with the nuclear matrix.</a> Nucleic Acids Research. 33 (13), 4157-4163 (2005).</li>
<li>Tandara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+DNA+integrity+testing%3A+big+halo+is+a+good+predictor+of+embryo+quality+and+pregnancy+after+conventional+IVF%5BTitle%5D)+AND+%22Andrology%22%5BJournal%5D)">Sperm DNA integrity testing: big halo is a good predictor of embryo quality and pregnancy after conventional IVF.</a> Andrology. 2 (5), 678-686 (2014).</li>
<li>Repping, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+spermHALO-FISH+to+determine+DAZ+gene+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">The use of spermHALO-FISH to determine DAZ gene copy number.</a> Mol Human Reproduction. 9 (4), 183-188 (2003).</li>
<li>Bikkul, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Farnesyltransferase+inhibitor+and+rapamycin+correct+aberrant+genome+organisation+and+decrease+DNA+damage+respectively%2C+in+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Farnesyltransferase inhibitor and rapamycin correct aberrant genome organisation and decrease DNA damage respectively, in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts.</a> Biogerontology. 19 (6), 579-602 (2018).</li>
<li>Telenius, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degenerate+oligonucleotide-primed+PCR%3A+general+amplification+of+target+DNA+by+a+single+degenerate+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer.</a> Genomics. 13 (3), 718-725 (1992).</li>
<li>Bridger, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+pKi-67+with+satellite+DNA+of+the+human+genome+in+early+G1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%22%5BJournal%5D)">Association of pKi-67 with satellite DNA of the human genome in early G1 cells.</a> Chromosome Research. 6, 13-24 (1998).</li>
<li>Sales Gil, R., Vagnarelli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ki-67%3A+More+Hidden+behind+a+%27Classic+Proliferation+Marker%27%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Ki-67: More Hidden behind a 'Classic Proliferation Marker'.</a> Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 747-748 (2018).</li>
<li>Bikkul, M. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+elongation+through+hTERT+immortalization+leads+to+chromosome+repositioning+in+control+cells+and+genomic+instability+in+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome+fibroblasts%2C+expressing+a+novel+SUN1+isoform%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Chromosomes+Cancer%22%5BJournal%5D)">Telomere elongation through hTERT immortalization leads to chromosome repositioning in control cells and genomic instability in Hutchinson-Gilford progeria syndrome fibroblasts, expressing a novel SUN1 isoform.</a> Genes Chromosomes Cancer. 58 (6), 341-356 (2019).</li>
<li>Jackson, D. A., Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+a+filamentous+nucleoskeleton+with+a+23+nm+axial+repeat%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Visualization of a filamentous nucleoskeleton with a 23 nm axial repeat.</a> EMBO Journal. 7, 3667-3677 (1988).</li>
<li>Albrethsen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+the+nuclear+matrix+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Unravelling the nuclear matrix proteome.</a> Journal of Proteomics. 72, 71-81 (2009).</li>
<li>Mika, S., Rost, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMPdb%3A+Database+of+nuclear+matrix+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">NMPdb: Database of nuclear matrix proteins.</a> Nucleic Acids Research. 33, 160-163 (2005).</li>
<li>Gavrilov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((of+the+nuclear+matrix-bound+chromatin+hubs+by+a+new+M3C+experimental+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">of the nuclear matrix-bound chromatin hubs by a new M3C experimental procedure.</a> Nucleic Acids Research. 38, 8051-8060 (2010).</li>
<li>Sjakste, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+nuclear+matrix+proteins+in+malignant+transformation+and+cancer+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Oncology%22%5BJournal%5D)">Role of the nuclear matrix proteins in malignant transformation and cancer diagnosis.</a> Experimental Oncology. 26 (3), 170-178 (2004).</li>
<li>Leman, E. S., Getzenberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+structure+as+a+source+of+cancer+specific+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Nuclear structure as a source of cancer specific biomarkers.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 104 (6), 1988-1993 (2008).</li>
<li>Volpi, E. V., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH+glossary%3A+an+overview+of+the+fluorescence+in+situ+hybridization+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">FISH glossary: an overview of the fluorescence in situ hybridization technique.</a> Biotechniques. 45 (4), 385-386 (2008).</li>
<li>Bridger, J. M., Foster, H. A. Senescence and the Genome. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBridger%2C+JM+%22Human+Interphase+Chromosomes%22">Human Interphase Chromosomes</a>. , Springer. New York. Ed. Ivan Iourov (2021).</li>
<li>Foster, H. A., Griffin, D. K., Bridger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interphase+chromosome+positioning+in+in+vitro+porcine+cells+and+ex+vivo+porcine+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Interphase chromosome positioning in in vitro porcine cells and ex vivo porcine tissues.</a> BMC Cell Biology. 13 (1), 30(2012).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

DNA halo yöntemi, nükleoiskelet ve genom arasındaki etkileşimleri analiz ederken mükemmel bir seçim yöntemidir, ancak uyulması gereken bazı kritik adımlar da vardır. En önemli parametrelerden biri, hücre tohumlama yoğunluğunun optimizasyonudur. Hücreler aşırı birleşirse, DNA haleleri komşu hücrelerle üst üste binecek ve bu da analizin yapılmasını imkansız hale getirecektir. CSK ve ekstraksiyon tamponları, biyolojik aktivitelerini korumak için hazırlama işleminin sonunda ekstraksiyon tamponuna spermin, spermidin ve digitonin eklenerek kullanım gününde her zaman taze yapılmalıdır. Halo-FISH yapıyorsanız, probun veya boyanın daha sonra hibritleşmesini sağlamak için DNA halelerinin doğru denatürasyon sıcaklığını kullanmak son derece önemlidir.
Elektron mikroskobu, nükleer matrisi görselleştirmek için kullanılmıştır, filamentli yapılar tanımlanmıştır20. Bununla birlikte, elektron mikroskobu sınırlıdır, çünkü kromatin ile matris ilişkileri kolayca çıkarılamaz. Gerçekten de, DNA Halo yöntemi, elektron mikroskobu ile karşılaştırıldığında daha çok yönlüdür, çünkü spesifik genler, kromozomlar ve hücre durumları incelenebilir. Ayrıca, nükleer matriks proteinlerinin proteomik analizi incelenmektedir21,22. Bu yöntem, özellikle hastalıklı hücreleri karşılaştırırken, nükleer matris bileşenlerini karşılaştırmak için iyidir, ancak standart DNA Halo tekniği tarafından vurgulanan uzamsal dağılımı ve ekleri sağlamaz.
DNA Halo tahlillerinin sınırlamaları vardır. İlk olarak, matris çıkarılırken, bu sadece sabit hücreler üzerinde gerçekleştirilebilir, bu nedenle canlı görüntüleme mümkün değildir. DNA Halo yönteminin gerçekleştirilmesi nispeten hızlı ve kolay olmasına rağmen, hücre kültürü, prob üretimi, Halo-FISH ve analiz dikkate alındığında genel süreç zaman alıcı olabilir.
Süper çözünürlüklü mikroskopi kullanılarak DNA Haloları ve HALO-FISH'in görüntü yakalaması, DNA'ya özgü probların ve antikorların çözünürlüğünü büyük ölçüde artıracaktır. Ek olarak, florokromlar spektral olarak daha kolay çözülebildiğinden, tek bir deneyde bir dizi DNA probu kullanmak mümkün olabilir ve bu da daha fazla bilgi sağlar. Kromozom konformasyon yakalama (3C) gibi moleküler biyoloji tekniklerindeki gelişmeler, gen lokuslarının etkileşimlerini belirlemek ve hücredeki kromatin üzerindeki mekansal organizasyonu analiz etmek için kullanılmıştır. DNA Halo testleri ve 3C, M3C23 olarak bilinen bir terim olan birleştirilebilir ve yine DNA Halo tekniğinin uyarlanabilirliğini gösterir.
Burada sunulan orijinal veriler, genom davranış sorgulaması olanaklarını ve bu verilerin nasıl sunulacağını göstermektir. Bu verilerle, (1) kromozom boyama probları kullanarak genom bağlanmasında önemli farklılıklar belirlemenin mümkün olduğunu gösterdik, bu çalışmada kromozom 18'in analiz edilenlerden en az bağlı kromozom olduğunu ortaya koyduk (Şekil 3); (2) İki gen lokusu arasında önemli farklılıklar gösteren gen lokusları ve (Şekil 4) (3) Telomerler, çoğalan ve yaşlanan hücrelere kıyasla sessiz hücrelere daha az güçlü bir şekilde bağlanırlar (Şekil 5). Proliferasyon yapan ve olmayan hücreler arasında, çözünmez bir protein olan ve bu nedenle artık çekirdeklerle birlikte kalan proliferasyon belirteci Ki67 antijeninin varlığı veya belirli bir zaman periyodu içinde S-fazından geçen hücreleri vurgulamak için nükleotidlerin dahil edilmesi yoluyla ayrım yapabiliyoruz (Şekil 2). Bu teknik aynı zamanda nükleoiskeletlerinde, yani laminopati hücrelerinde tehlikeye giren hücrelerdeki genom davranışını analiz etmemizi sağlamıştır ve burada ve Bikkul ve ark., 2018'de, genomun kontrol hücrelerine kıyasla daha az sıkı bir şekilde bağlanabileceğini ve klasik HGPS hücrelerinde lamin A mutasyonunun etkisini iyileştiren spesifik ilaçlarla tedavi edilirken restore edilebileceğini ortaya koymaktadır15. Bununla birlikte, burada lamin A mutasyonundan yoksun olan, ancak kromozom 13'ün daha az sıkı bir şekilde bağlandığı LINC kompleks proteini SUN119'un alışılmadık bir formunu içeren atipik HGPS AGO8466 hücreleri için yeni veriler gösteriyoruz (Şekil 6).
HALO-FISH, ekstraksiyon prosedüründen çıkarılmayan proteinleri çözmek için dolaylı immünofloresan ile kombinasyon halinde nükleoiskelet ile genomik etkileşimlerin incelenmesini sağlayan benzersiz bir yöntemdir. Nükleoiskeletin bazı kanser tipleri19 gibi çeşitli hastalıklarda modifiye olduğu ve bazı nükleoiskeletle ilişkili proteinlerin tanısal biyobelirteçler olarak öneminin24,25 olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, bu teknik, nükleoiskeletin 15,24,25,27 hastalığında kromatin organizasyonu / düzensizliği üzerindeki etkisini incelemede önemli bir role sahiptir ve insan hücreleri ile sınırlı değildir, diğer hayvanlardan kromozomal boyama probları ile aynı DNA-halo protokolü kullanılabilir 28.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62017">Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci</a>. The Authors section was updated from:
Lauren S. Godwin1 
Joanna M. Bridger1 
Helen A. Foster2 
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London 
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire
to:
Lauren S. Godwin1 
Emily Roberts2 
Joanna M. Bridger1 
Helen A. Foster2 
1Laboratory of Nuclear and Genomic Health, Centre for Genome Engineering and Maintenance, Division of Biosciences, Department of Life Sciences, College of Health, Medicine and Life Sciences, Brunel University London 
2Biosciences, Department of Clinical, Pharmaceutical and Biological Science, School of Life and Medical Sciences, University of Hertfordshire

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62017">Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

"Nükleer matris" ilk olarak 1974 yılında Berezney ve Coffey tarafından tanımlanmıştır1. Sıçan karaciğer çekirdekleri üzerinde yüksek tuz molariteleri ve nükleaz tedavisi ile ekstraksiyonlar yaptıktan sonra, proteinli bir yapısal çerçeve tanımladılar. DNA halo prosedürü daha sonra bu yöntemden uyarlandı ve çözünür proteinlerin uzaklaştırılmasını içerir, böylece sadece nükleer matris (NM) ve NM ile ilişkili proteinler ve kromozomlar devam eder. DNA bağlanma bölgeleri, DNA döngülerinin tabanında bulunur ve sırasıyla yüksek tuz konsantrasyonları ve iyonik deterjan lityum-3,5-diiyodosalisilat (LIS) ile ekstraksiyona dirençli matrise bağlı bölgeler (MAR'lar) veya iskele bağlanma bölgeleri (SAR'lar) olarak adlandırılır. DNA halelerinde, MAR'lar / SAR'larla ilişkili DNA, artık çekirdek içinde bağlanırken, DNA döngüleri bu bölgelerden uzağa uzanır ve DNA halesini oluşturur. Artık genomun lamina ile ilişkili alanlar (LAD'ler) aracılığıyla nükleer laminaya ve nükleolar ilişkili bölgeler (NAD'ler) ve muhtemelen spesifik nükleer cisimler gibi diğer nükleer yapılar aracılığıyla demirlendiğini biliyoruz.
DNA halo yöntemi, DNA'nın, genlerin ve kromozomal bölgelerin fiziksel haritalanması için kullanılabilir, çünkü genişletilmiş DNA ve kromatin daha büyük bir çözünürlük sağlar, çünkü kromatin histonlardan sıyrılır ve DNA 2,3,4,5,6'ya uzatılır. Bununla birlikte, bu uygulama için DNA halelerini kullanırken bazı sınırlamalar vardır. Örneğin, DNA halelerinin artık çekirdekleriyle sıkı sıkıya ilişkili DNA'ya problar tarafından erişilemez, böylece analiz ve fiziksel haritalama6'dan uzak durulabilir. Fiber-FISH 2,4,5,7 ve moleküler tarama 8 gibi diğer teknikler de fiziksel haritalamayı mümkün kılar ve nispeten hızlı ve gerçekleştirilmesi kolay olma avantajına sahiptir. Her ikisi de tercihen DNA haleleri üzerinden genlerin DNA haritalaması için kullanılır. Bu yöntemler, çekirdekten çözücü veya tuz ekstraksiyonları kullanarak kromatin liflerini çıkarır, ancak moleküler tarama daha iyi tekrarlanabilirliğe sahip olma eğilimindedir 8,9.
Nükleoiskeletin, DNA için bağlanma bölgeleri, kromatin yeniden modellemesi, DNA transkripsiyonu, DNA onarımı ve DNA replikasyonu gibi önemli nükleer süreçleri desteklemede rol oynadığına dair artan kanıtlar vardır11,12. Bu nedenle, DNA halo tekniği, bu hücresel aktiviteler sırasında nükleoiskelet ve genom arasındaki etkileşimleri araştırmak için geliştirilmiştir ve araştırmalarda rutin olarak kullanılmış ve rapor edilmiştir. Bu teknik aynı zamanda genom ve nükleoiskelet arasındaki etkileşimleri, nükleer yapıdaki malignite ile ilişkili değişikliklerin tanımlandığı hastalık ilerlemesi ile ilişkili olarak araştırmak için de kullanılmıştır11.
DNA halo tekniği, gelişim ve farklılaşma sırasında genom ve nükleoiskelet arasındaki ilişkiyi araştırmak için de kullanılmıştır12. Bir dizi çalışma, FISH14 ile birleştiğinde halosperm 13 veya SpermHalo-FISHolarak bilinen DNA halo tekniğinin bir varyasyonunu kullanmıştır. Spermatozoa kromatini, protaminler olarak bilinen proteinlere sıkıca bağlanır ve bu teknik, sperm DNA'sına erişimi iyileştirmek için geliştirilmiştir. Halosperm, spermatozoa DNA'sının bütünlüğünü araştırmak ve DNA hasarının olup olmadığını belirlemek için kullanılmıştır. Daha az DNA hasarına sahip spermatozoa, daha büyük bir DNA halo boyutuyla ilişkilidir, oysa parçalanmış ve hasar görmüş DNA seviyelerinin arttığı spermatozoalarda ya küçük haleler vardı ya da hiç yoktu. Böylece halosperm, IVF13 ile embriyo kalitesinin ve başarılı gebeliğin potansiyel prognostik belirteci olarak kullanılabilir. Bu örnek, bu tekniğin potansiyel klinik uygulamalarını vurgulamaktadır. Çalışmamızda, genom davranışındaki değişiklikleri ve erken yaşlanma hastalığı Hutchinson-Gilford Progeria Sendromu'nda (HGPS) spesifik ilaç tedavilerinin etkisini değerlendirmek için HALO-FISH'i kullandık15.
Bunlar ve diğer çalışmalar birlikte, DNA halo tekniğinin tekniğin incelenmesi ve faydası için kullanılabileceği süreçlerin / uygulamaların genişliğini vurgulamaktadır.

<table><tbody><tr><td>10X PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10388739</td><td>DNA haleleri oluşturmak için kullanılır</td></tr><tr><td>5-bromo-2&prime;-deoksi-üridin&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5002-100MG</td><td>Etiketli nükleotid</td></tr><tr><td>5-Floro-2 & prime; -deoksiüridin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503-100MG</td><td>Etiketli nükleotid</td></tr><tr><td>Agar Teknik</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15562141</td><td>BAC klonlarının DNA izolasyonu</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A939-50G</td><td>DOP-PCR ürün boyutunu ve nick çevirisini kontrol edin</td></tr><tr><td>Atipik tip 2 HGPS fibroblastlar (AG08466)</td><td>Coriell Institute</td><td>AG08466</td><td>Cell line</td></tr><tr><td>Bacto tripton</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16269751</td><td>BAC klonlarının DNA izolasyonu</td></tr><tr><td>Biotin-16-dUTP</td><td>Roche Diagnostics&nbsp;</td><td>11093711103</td><td>Etiketli nükleotidler</td>,</tr><tr><td>Kloramfenikol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378-25G</td>, <td>BAC klonlarının DNA izolasyonu</td></tr><tr><td>, Klasik Hutchinson-Gilford progeria sendromu (HGPS), fibroblastlar (AG06297)&nbsp;</td><td>Coriell Institute</td><td>AG0297</td><td>Hücre hattı</td></tr><tr><td>Coplin kavanoz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12608596</td><td>Arka arkaya 5 slayt veya 8 slayt tutar</td></tr><tr><td>Cot-1 DNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15279011</td> HALO FISH DEPC ile arıtılmış suda <td>spesifik olmayan hibridizasyonun</td></tr> engellenmesi <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>693520-1L</td><td>BAC klonlarının DNA izolasyonu</td></tr><tr><td>Dekstran sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4030</td><td>Hibridizasyon karışımı</td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td>Ekstraksiyon tamponu</td></tr><tr><td>bileşeni Digoxigenin-11-dUTP&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11093088910</td><td>Etiketli nükleotidler</td></tr><tr><td>Eşek anti-fare Cy3</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>715-165-150</td><td>İkincil antikor</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td>Ekstraksiyon tamponunun bileşeni</td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td>Ekstraksiyon tamponunun bileşeni</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>443611</td><td>Sondası çökeltme ve HALO BALIĞI</td></tr><tr><td>Fetal sığır sistemi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26140079</td><td>Hücre kültürü serumu</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10523525</td><td>DNA halelerinin 2D BALIĞI</td></tr><tr><td>Cam yünü</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18421</td><td>Spin sütunu</td></tr><tr><td>Ringa balığı spermi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7290</td><td>Prob çökeltme</td></tr><tr><td>HXP ve ticaret; Lamba (metal halojenür mikroskop lambası)</td><td>OSRAM</td><td>HXP-R120W45C VIS</td><td>DNA halelerinin görüntü yakalama</td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10313680</td><td>Mikroskop slaytlarının temizlenmesi</td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516-25ML</td><td>BAC klonlarının DNA izolasyonu</td></tr><tr><td>KAPA HiFi PCR Kiti</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2103</td><td>PCR Kiti</td></tr><tr><td>DFC365 FX kamera ve LAS AF (Sürüm: 4.5.0) görüntü elde etme yazılımı ile Leica DM4000 floresan mikroskop.</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>: DNA halelerinin görüntü yakalaması</td></tr><tr><td>Luria-Bertani agar&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13274843</td><td>BAC klonlarının DNA izolasyonu</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>CSK tamponunun</td></tr> bileşeni <tr><td>Metanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10284580</td><td>Mikroskop slaytlarının temizlenmesi ve sterilize edilmesi</td></tr><tr><td>Fare anti-BrdU antikoru</td><td>BD Pharmingen B2531-100UL</td><td></td><td>BrdU görselleştirme</td></tr><tr><td>Yenidoğan buzağı serumu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16010159</td><td>Hücre kültürü serumu ve bloke edici reaktif</td></tr><tr><td>Nick çeviri kiti</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR sınıfı su</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>693520-1L</td><td>BAC klonlarının PCR ve DNA izolasyonu</td></tr><tr><td>PCR Primerleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1851</td><td>CSK bileşeni ve ekstraksiyon tamponları</td></tr><tr><td>Potasyum asetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1190-100G</td><td>BAC klonlarının DNA izolasyonu</td></tr><tr><td>QuadriPERM&reg; 4 X 12</td><td>SARSTEDT</td><td>94.6077.307</td><td>Kare hücre kültürü kabı, dört bölmeli polisteren. Bu hidrofobik yüzeye sahiptir, sterildir, pirojenik değildir / endotoksin ücreti yoktur ve sitotoksik değildir.</td></tr><tr><td>Tavşan Anti-Ki67 antikoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ZRB1007-25UL</td><td>Proliferasyon belirteci</td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>BAC klonlarının DNA izolasyonu</td></tr><tr><td>Kauçuk çimento</td><td>Halford'un</td><td>101836</td><td>DNA halelerinin 2D BALIĞI</td></tr><tr><td>Sephadex G-50</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6022-25G</td><td>Döndürme sütunu</td></tr><tr><td>Sodyum asetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td>Prob yağışı</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td>CSK bileşeni, ekstraksiyon ve SSC tamponları</td></tr><tr><td>Sodyum sitrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8532</td><td>SSC tamponunun bileşeni</td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat ve nbsp;</td><td></td><td>BAC klonlarının L3771-100G</td><td>DNA izolasyonu</td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td>BAC klonlarının DNA izolasyonu</td></tr><tr><td>Spermidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2626</td><td>Ekstraksiyon tamponunun bileşeni</td></tr><tr><td>Spermin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4264</td><td>Ekstraksiyon tamponunun bileşeni</td></tr><tr><td>Streptavidin-Cy3&nbsp;</td><td>Amersham Life Sciences Ltd, Bilimsel Laboratuvar Malzemeleri</td><td>pa43001</td><td>Prob antikoru</td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>CSK tamponunun bileşeni</td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>CSK tamponu + A66: D68</td></tr><tr><td>SuperFrost ve ticaret; mikroskop slaytları</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12372098</td><td>Mikroskop slaytları: 1 mm kalınlık, 76 mm uzunluk, 26 mm genişlik. Kaplanmamış.</td></tr><tr><td>Domuz anti-tavşan TRITC&nbsp;</td><td>Dako</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TELO-PNA BALIK KİTİ</td><td>Agilent Dako</td><td>K532511-8</td><td>Telomerlerin tanımlanması</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253-100G</td><td>Kolon tamponu</td></tr><tr><td>Triton ve ticaret; X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td>CSK tamponu</td></tr><tr><td>Tripton</td><td>Thermo Fisher Bileşeni</td><td></td><td>BAC klonlarının bilimsel 10158962 DNA izolasyonu</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416- 100ML</td><td></td></tr><tr><td>DAPI içeren Deterjan Vectashield mountant</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-1200</td><td>DNA halelerinin 2D BALIĞI</td></tr><tr><td>Tüm insan kromozom probları</td><td>Calbiochem</td><td></td><td>DNA halelerinin 2D BALIĞI</td></tr><tr><td>Maya özü</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10108202</td><td>BAC klonlarının DNA izolasyonu</td></tr></tbody></table>

tüm kromozomları, telomerleri ve gen locilerini ortaya Çıkarmak için dna halo preparatlarında floresan in situ hibridizasyon

Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

Genom, aktivitesini düzenlemek ve belirli yerlere demirlemek için hücre çekirdeği içindeki çeşitli yapılarla ilişkilidir. Bu yapılar toplu olarak nükleoiskelet olarak bilinir ve nükleer lamina, nükleoller ve nükleer cisimleri içerir. Genomu ve organizasyonunu incelemek için birçok floresan in situ hibridizasyon (FISH) varyantı bulunmasına rağmen, bunlar genellikle çözünürlükle sınırlıdır ve genomun nükleer yapılarla ilişkisi hakkında yetersiz bilgi sağlar. DNA halo yöntemi, genom içindeki bağlanma bölgeleri aracılığıyla çekirdeklerdeki yapılara bağlı kalan DNA döngüleri üretmek için yüksek tuz konsantrasyonları ve iyonik olmayan deterjanlar kullanır. Burada, nükleer matrise sıkıca bağlı olmayan histonlar, lipitler ve DNA gibi çözünür nükleer proteinler ekstrakte edilir. Bu, iç nükleer yapılar ve ekstraksiyona dirençli proteinlerle yakından ilişkili DNA'yı içeren artık bir çekirdeği çevreleyen bağlanmamış bir DNA halesinin oluşumuna yol açar. Bu genişletilmiş DNA iplikçikleri artan çözünürlüğü mümkün kılar ve fiziksel haritalamayı kolaylaştırabilir. FISH ile kombinasyon halinde, bu yöntem, genomun demirlendiği tüm yapılarla genomik etkileşimleri incelemenin ek avantajına sahiptir. HALO-FISH olarak adlandırılan bu teknik, DNA halelerinin gen lokuslarını, tüm kromozomları, alfa uydusunu, telomerleri ve hatta RNA'yı ortaya çıkarmak için nükleik asit probları ile birleştirilebildiği çok yönlüdür. Bu teknik, normal hücrelerde ve kanser gibi hastalık ilerlemesinde nükleer organizasyon ve işlev hakkında bir fikir verir.

Bu DNA halo hazırlama yöntemi, genç ve yaşlı hücrelerdeki genom davranışındaki farklılıkları belirleme çabalarımızda ve aynı zamanda anormal nükleoskelet proteinlerine sahip erken yaşlanma hastalıklarından türetilen hücrelerde bize yardımcı olmuştur15. Şekil 1, artık çekirdeğin kenarını, artık çekirdeğin içinde kalan DNA'yı ve bir DNA halesi oluşturarak çevreye biriken bağlanmamış DNA'yı görmenin mümkün olduğu DNA halelerinin örneklerini göstermektedir. Ayrıca artık çekirdeğin nasıl elde edildiğini gösteren analizi ve NE ve CTE ölçümlerini de göstermektedir. Proliferasyon yapan ve olmayan hücreler arasında, hücreler S-fazındayken BrdU gibi etiketli bir nükleotid ekleyerek veya nükleolleri ortaya çıkaran tanısal proliferasyon belirteci anti-pKi67'yi ve G1 hücrelerinde heterokromatin bölgelerini kullanarak ayırt etmek mümkündür17,18. Yüksek serumda akıcılık sağlanmadan büyüyen, proliferasyon belirteçleri için negatif olan primer hücrelerin yaşlı olduğu varsayılır. Düşük serumda büyüyen veya konfluent hale gelen primer hücreler, yani proliferasyon belirteçleri için negatif olan temas inhibe edilmiş hücreler sessiz kabul edilir ve doğru besinler ve durum göz önüne alındığında proliferatif hücre döngüsüne tekrar girebilirler. Ki67 pozitif ve negatif hücreleri ayırt edebilmek, çoğalan, sessiz ve yaşlanan insan dermal fibroblastları arasındaki farkları belirlememizi sağlamıştır. Şekil 2, DNA replikasyonu sırasında BrdU'nun içine dahil edildiği hücrelerden oluşturulan çoğalan insan dermal fibroblastlarının DNA halelerini, çoğalmayan hücrelerde meydana gelmeyen ve daha sonra anti-BrdU antikoru ile boyanan bir mekanizmayı göstermektedir. Proliferatif belirteç anti-pKi67 antikoru ile boyanma da Şekil 2'de görülmektedir. Bu sağlam bir antijendir ve FISH protokolünden kurtulur ve bu nedenle FISH sonrası ve ön montaj için boyanabilir. Bu nedenle, çoğalan hücreler BrdU için pozitif (kırmızı) ve sol sütunda anti-pKi67 (kırmızı) ve çoğalmayan hücreler, aslında Şekil 2'deki yaşlanan hücreler sağ sütunda gösterilmektedir. Yeşil sinyaller, bir telomer PNA FISH / FITC kiti ile ortaya çıkarılan bireysel telomerlerdir. İmmünofloresansı DNA haleleri ile birleştirmek, çoğalan, sessiz ve yaşlanan hücreleri araştırırken Şekil 2'de gösterildiği gibi farklı hücre durumları sırasında analiz yapılmasını sağlar. Seçilen antikora bağlı olarak, farklılaşma, ışınlama yoluyla DNA hasarı gibi diğer koşullar incelenebilir.
Kromozom bölgeleri, FISH kullanılarak DNA haleleri içinde de görselleştirilebilir. DNA'nın çekirdeklerden dışarı atılmasına izin veren preparat nedeniyle, genomun artık çekirdeğin içindeki ankrajına ve yapılarına bağlı olarak, DNA halesinde bulunan kromozomun daha küçük veya daha büyük miktarları ile kromozom bölgesi şekli bozulabilir. Şekil 3 , kromozom 1, 13, 17 ve 18 için spesifik tam kol kromozomu boyama probları (kırmızı) ile bireysel kromozomların ortaya çıkarıldığı bir DNA haleleri panelini ortaya koymaktadır. Anti-pKi67 (yeşil), çoğalan hücreleri ve aynı kültür içindeki yokluğunu, aynı slayt üzerinde, yaşlanan hücreleri belirtmek için kullanılmıştır. CTE / NE olarak sunulan görüntülerden ve verilerden çok açıktır ki, küçük gen fakir kromozom 18, az sayıda bağlanmaya sahip olan ve artık çekirdeklerden uzakta DNA halesine daha fazla makaralanan ve artık çekirdeklerin merkezinden diğer kromozomlardan önemli ölçüde daha uzakta olan bir kromozomdur. Bununla birlikte, bu kromozom 1 için de geçerlidir. Proliferatif belirteç anti-pKi67'yi kullanarak, aynı kültür içinde ve aynı slaytta yaşlanan hücrelerle çoğalmayı karşılaştırmak da mümkün olmuştur ve bu analiz, bu iki çok farklı hücre durumundaki kromozomların, artık nükleer yapılara bağlanma açısından birbirlerinden önemli ölçüde farklı olmadığını ortaya koymuştur.
İlginçtir ki, genler ayrıca çoğalan ve yaşlanan hücreler arasında, artık bir çekirdek içinde kalma veya DNA Halesinde bulunma açısından istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar göstermektedir. Şekil 4 bunu, kırmızı renkte etiketli BAC probları ve yeşil renkte anti-Ki67 ile tanımlanan gen lokusları ile göstermektedir. Bir DNA Halo preparatından sonra, çoğalan hücrelere karşı yaşlanan hücrelerdeki gen konumları arasında anlamlı bir fark yoktur. Bununla birlikte, DNA halesi içinde, çok az sayıda bulunan siklin D1 CNDD1 lokuslarından önemli ölçüde daha fazla katenin alfa 1 CTNNA1 lokusu vardır. Şekil 5, yeşil renkte telomerlerle DNA halo preparatlarını göstermektedir. Arka plan, telomer sinyallerinin DNA halesi içinde görselleştirilmesini sağlamak için kasıtlı olarak yüksek bırakılmıştır. Bu veri kümesine sessiz hücreler, yani 7 gün boyunca serum açlığı çeken hücreler dahil edilmiştir ve ilginç bir şekilde, sessiz hücrelerde DNA halelerinde bağlanmamış ve yerleştirilmiş, çoğalan ve yaşlanan hücrelerden çok daha fazla telomer vardır. Şekil 5a'da, DNA halesindeki telomerlerin oranı, özellikle 'Deney 2' görüntüsü için gözlemlenebilir. Bu, DNA halesindeki telomerlerin ortalama yüzdesinin sessiz hücrelerde yaklaşık% 17 olduğu Şekil 5b'ye karşılık gelir. Yaşlanan hücrelerdeki tüm telomerlerin bazılarının belki de çok kısa olarak görülemeyeceğine dair bazı kanıtlar vardır.
Bu DNA halo yöntemi, hastalıklı hücrelerdeki çekirdeklerdeki genom etkileşimi değişikliklerini araştırmamız için başarılı olmuştur15. Şekil 6 , primer kontrol fibroblastlarında ve tipik (lamin A mutasyonu) ve atipik Hutchinson-Gilford Progeria Sendromu olan hastalıklı hücrelerde kromozom bağlanmasındaki farklılıkları göstermektedir, farklı bir SUN1 izoformu eksprese eder ve lamin A mutasyonuyoktur 19. Kromozom 1 ve 13, kontrol DNA halelerine kıyasla artık çekirdekler içindeki bağlanmalarında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar göstermektedir. Şekil 6b , tüm kromozom bölgesinin konumunu artık çekirdek ve DNA Halosu ile ilişkilendirir. 1 veya daha düşük değerler, kromozomun artık çekirdek içinde bulunduğunu ve 1'in üzerindeki değerlerin DNA Halosu içindeki kromozomları veya kromozom kısımlarını gösterdiğini gösterir.
Genel olarak, bu, HALO-FISH'in tüm kromozomların, spesifik genlerin ve telomerlerin genomik etkileşimlerini, hücre döngüsünü etkileyen çeşitli koşullar altında (proliferasyon, sessizlik ve yaşlanma) veya hastalık hücreleri içinde, örneğin progeria ve kanser hücre hatları içinde araştırmadaki faydasını vurgulamaktadır. Gerçekten de, bu durumlar arasındaki etkileşimlerdeki farklılıklar, nükleoiskeletin çekirdek içindeki anahtar süreçleri düzenlemede önemli bir role sahip olduğunu ima eder.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig01.jpg"> Şekil 1: Artık çekirdeği ve DNA halesini gösteren HDF ekstrakte edilmiş çekirdek ve analiz yöntemine genel bakış. (a) DNA halo testi ile hazırlanan ve DAPI ile boyanan bir HDF çekirdeği. Parlak lekeli artık çekirdek, nükleoiskelete bağlanmış DNA'yı gösterir ve bu, DNA'nın bir halesini oluşturan bağlanmamış DNA ile çevrilidir. Büyütme = x 100; ölçek çubuğu 10 μm. (b) Mavi kanal, DAPI lekeli çekirdeği ve çevresindeki DNA'yı yakalar. Artık çekirdek ImageJ kullanılarak seçilir ve çıkarılır. Ok, nükleer merkezden artık nükleer kenara (NE) olan mesafeyi göstermektedir. (c) Kırmızı kanal prob sinyalini gösterir. (d) 'Sonuç' olarak gösterilen görüntü, kırmızı kanalın mavi kanal görüntüsünün üzerine bindirilmesinin sonucudur; bu, nükleer merkezden en uzak kromozom bölgesi kenarına (CTE) olan mesafeyi sağlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig02.jpg"> Şekil 2: Proliferasyon ve yaşlanan HDF'lerde telomer PNA FISH ile DNA halo preparasyonu. Telomer PNA FISH DNA halo testine tabi tutulan HDF'lerde. Telomer sinyalleri yeşil (FITC) renkte görselleştirildi, artık ve halo DNA'sı DAPI (mavi) kullanılarak boyandı ve proliferasyon yapan çekirdekler kırmızı (TRITC) dolaylı immünofloresan yoluyla anti-BrdU veya anti-pKi67 antikorları kullanılarak tespit edildi. Büyütme = x 100; ölçek çubuğu 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig03.jpg"> Şekil 3: Nükleoiskelet-kromozom etkileşimleri ve DNA halo testi kullanılarak analiz. (a) DNA halo preparasyonuna tabi tutulan HDF'ler üzerinde 1, 13, 15, 17 ve 18 numaralı kromozomlara özgü problarla 2D-FISH uygulandı. Tüm kromozomlar kırmızıya (Cy3) boyandı ve çekirdekler çoğalan veya yaşlanan olup olmadıklarını belirlemek için pKi67 ile incelendi. Proliferasyon yapan hücreler (pKi67+) yeşil (FITC) ile tanımlanırken, yaşlanan hücreler lekesiz kaldı (pKi67-), yani yeşil sinyal tespit edilmedi. Büyütme = x 100; ölçek çubuğu 10 μm. (b) HALO-FISH geçirmiş olan çoğalan ve yaşlanan HDF'lerde nükleoiskelet tarafından kromozom ankrajı. Ölçümler, çoğalan (pKi67+) ve yaşlanan (pKi67-) hücrelerde 1, 13, 15, 17 ve 18 numaralı kromozomlar için en uzak kromozom bölge kenarının (CTE) ilgili nükleer kenara (NE) oranını göstermektedir. Hata çubukları ± SEM'i temsil eder. (c) Kromozom bölge kenarının (CTE) pKi67+ ve pKi67- çekirdeklerindeki spesifik kromozomların ilgili nükleer kenarına (NE) modifiye kutu grafiği gösterimi. Q1 = alt çeyrek; Min = kaydedilen en düşük değer; Med = medyan; Maksimum = kaydedilen maksimum değer; Q3 = üst çeyrek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig04.jpg"> Şekil 4: HALO-FISH kullanan HDF'lerde genlere özgü etkileşimler. (a) DNA halesi ekstrakte edilen çekirdekler, çoğalan ve yaşlanan hücreler üzerinde NM'ye ankrajlarını araştırmak için gen spesifik problarla (CCND1 ve CTNNA1) araştırıldı. Gen sinyalleri kırmızı (Cy3) ile gösterilir ve anti-pKi67 çoğalan hücreleri gösterir ve sinyal yeşil (FITC) ile görselleştirilir. Çoğalan CCND1 görüntüsü için, artık çekirdek beyaz daire içine alınır ve beyaz ve yeşil daire arasındaki boşluk DNA Halesini gösterir. Büyütme = x 100; ölçek çubuğu 10 μm. (b) CCND1 ve CTNNA1 için genlere özgü sinyaller, artık çekirdek ve DNA halesi arasında ve ayrıca çoğalan ve yaşlanan hücreler arasında karşılaştırılır. Hata çubukları SEM±i temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a> 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig05.jpg"> Şekil 5: Telomer PNA-FISH ile araştırılan sessiz HDF'ler üzerinde DNA halo testi. (a) HDF'lerin sessizleşmesi, 7 gün boyunca düşük serum ortamında kültür tarafından indüklendi. DNA halo testi yapıldı ve PNA-FISH, TELOMERLERIN FITC sinyali (yeşil) ile görselleştirilmesini sağladı ve artık çekirdek ve çevresindeki DNA halesi DAPI (mavi) ile boyandı. Hücreler ayrıca çekirdeklerin çoğalmadığından emin olmak için anti-pKi67 antikoru ile boyandı. Bu iki ayrı durumda tekrarlandı. Büyütme = x 100; ölçek çubuğu 10 μm. (b) Proliferasyon, yaşlanan ve sessiz HDF hücrelerinde DNA halesi içinde lokalize olan telomerlerin ortalama yüzdesinin karşılaştırılması. Hata çubukları SEM± temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a> 
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62017/62017fig06.jpg"> Şekil 6: HGPS hücrelerinde nükleoiskelete tüm kromozom ankrajının HALO-FISH26 kullanılarak incelenmesi. (a) Kontrol HDF (2DD), klasik HGPS (AG06297) ve atipik tip 2 HGPS (AG08466) çekirdeklerine DNA halo hazırlığı ve daha sonra kromozom 1, 13, 15 ve 17 için tüm kromozom boyaları kullanılarak 2D-FISH uygulandı. Tüm kromozomlar yeşil (FITC) ile tasvir edilmiştir ve DNA DAPI (mavi) ile boyanmıştır. Büyütme = x 100; ölçek çubuğu 10 μm. (b) Kromozomların ekstrakte edilen çekirdekler içindeki konumlandırılması, ortalama kromozom bölge kenarının (CTE) nükleer kenara (NE) oranı ölçülerek belirlendi. 1'in üzerindeki bir oran, en uzak CTE'nin DNA halesi içindeki karşılık gelen NE'nin dışında olduğunu gösterirken, 1'in altındaki bir oran, en uzak CTE'nin artık çekirdek içindeki NE içinde bulunduğunu gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62017/62017fig06large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Bileşen</td>
			<td>Hacim (μL)</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>5XDOP-PCRtampon</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>dNTPmix(olmadandTTP)(2mM)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>dTTP(2mM)</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>Biotin-16-dUTPorDigoxigenin-11-dUTP</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>DOPprimer (20μM)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>TaqDNAPolimeraz (1U / μL)</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>PCRgradewater</td>
			<td>12</td>
		</tr><tr><td>Şablon</td>
			<td>5</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: 1x reaksiyon için DOP-PCR bileşenlerini ve hacimlerini gösteren tablo
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Adım</td>
			<td>Döngü</td>
			<td>Sıcaklık (derece Santigrat)</td>
			<td>Saat</td>
		</tr><tr><td>İlk Denatürasyon</td>
			<td>1</td>
			<td>95</td>
			<td>3 dk</td>
		</tr><tr><td>Denatürasyon</td>
			<td rowspan="3">34</td>
			<td>98</td>
			<td>20 saniye</td>
		</tr><tr><td>Astar Tavlama</td>
			<td>62</td>
			<td>1 dk</td>
		</tr><tr><td>Uzantı</td>
			<td>72</td>
			<td>30 saniye</td>
		</tr><tr><td>Son Uzatma</td>
			<td>1</td>
			<td>72</td>
			<td>5 dk</td>
		</tr><tr><td>Soğutma</td>
			<td></td>
			<td>4</td>
			<td>Tutmak</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 2: DOP-PCR döngüsünü, sıcaklığını ve zaman profilini gösteren tablo.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Unsur</td>
			<td>Hacim (μL)</td>
		</tr><tr><td>10x NT tampon (0,5 M Tris-HCl pH 8,50 mM MgCl2, 0,5 mg/ml BSA)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>0.1 M beta-merkaptoetanol</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>10X Nükleotid stoğu (0,5 mM dATP, 0,5 mM dCTP, 0,5 mM dGTP, 0,5 mM dTTP, 0,5 mg/ml biotin-16-dUTP)</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Dnase I (1 ng/ml)</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>DNApolimeraz I</td>
			<td>μg DNA başına 5U</td>
		</tr><tr><td>DNAtemplate (1 μg)</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>DEPC ile arıtılmış su</td>
			<td>50 μL'ye kadar</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 3: Bir prob için nick çeviri bileşenlerini ve ciltlerini gösteren tablo.

DNA halo preparatlarının floresan in situ hibridizasyon ile birleştirilmesi, nükleoiskelet ile genomik etkileşimlerin yüksek çözünürlüklü analizini sağlar. Bağlı genom, artık ekstrakte edilen çekirdeklerin içinde bulunan hibridize floresan sinyallere yol açarken, bağlı olmayan genom, artık çekirdekleri çevreleyen DNA halesindedir.

Tüm Kromozomları, Telomerleri ve Gen Locilerini Ortaya Çıkarmak için DNA Halo Preparatlarında Floresan In Situ Hibridizasyon

The genome is associated with several structures inside cell nuclei, in order to regulate its activity and anchor it in specific locations. These ...

Bu protokol, DamID dizilimini kullanmak yerine nükleoiskelete olan ekleri değerlendirmek için kullanılabilir ve tek bir hücre testidir. Bu yöntemi kullanmanın temel avantajı, uygun maliyetli ve kolay erişilebilir olmasıdır. Genler ve kromozomlar arasındaki normalde diğer görselleştirme teknikleriyle ortaya çıkmayabilecek fonksiyonel farklılıkları vurgulayabilir.Tedavi edilen kanser ve progeria hücrelerinde genom içindeki mekansal ve fonksiyonel organizasyonlar ve yaşlanan hücrelerdeki genomik davranış farklılıkları bu protokol kullanılarak değerlendirilebilir. Bu yöntem, yaşam süresi boyunca ve herhangi bir hastalığın herhangi bir hücre veya doku tipine uygulanabilir. Ayrıca probların mevcut olduğu model organizmalarda da kullanılabilir.Başlamak için, 500 mililitre% 10 hidroklorik asit hazırlayın ve büyük bir beher içine dökün. Mikroskop slaytlarını ayrı ayrı aside bırakın ve iki G.Decant'a ayarlanmış bir çalkalayıcıda oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin ve slaytları musluk suyunda 10 kez yıkayın. Sonra deiyonize suda 10 kez daha.Slaytları metanol içinde iki kez durulayın ve sterilizasyona kadar metanol içinde tutun. Slaytları kurutmak için bir kağıt havluya dökün ve otoklav veya sıcak fırında sterilizasyon için folyoya sarın. Hücreleri uygun ortamda serum ile en az 48 saat boyunca 37 santigrat derecede büyütün ve% 5 karbondioksit ile% 60 ila% 70 akıcılığa ulaşılıncaya kadar.Her hücre tipini toplayın ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Slayt başına 10 mililitre ortamda beş hücreye bir kez 10 kez tohumlayın. Slaytları ve ekli hücreleri içeren kültür kabını inkübatörden çıkarın.Ortamı atın ve slaytları kurşun kalem kullanarak etiketleyin. Daha sonra bunları 50 mililitre buz gibi soğuk sitoiskelet tamponu içeren bir coplin kavanoza yerleştirin. Kavanozu buz üzerinde 15 dakika veya dört santigrat derecede inkübe edin.Hücre iskeleti tamponunu atın ve slaytları tamponla birlikte bir coplin kavanoza batırarak 50 mililitre tek seferlik DNA halo tamponunda üç kez hızlı bir şekilde durulayın. Slaytları 50 mililitre ekstraksiyon tamponu içeren bir coplin kavanoza aktarın ve oda sıcaklığında dört dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra slaytları art arda 50 mililitrede 10 kez, beş kez, iki kez ve her biri bir dakika boyunca bir kez DNA halo tamponunda inkübe edin.İşiniz bittiğinde, slaytları %10, 30, 70 ve %95 etanolden oluşan sıralı bir etanol serisine batırın. Slaytları, her biri beş dakika boyunca sıralı 50 mililitrelik bir etanol serisi olan 70, 90 ve% 100 etanol boyunca alın. Onları bir ısıtma plakasında hava ile kurutun.Sonra 70 santigrat derece fırında beş dakika pişirin. Slaytları, 70 santigrat derecede iki dakika boyunca% 70 formamid iki kez SSC çözeltisine yerleştirerek denatüre edin. Denatüre edilmiş slaytları beş dakika boyunca 50 mililitre buz gibi soğuk% 70 etanol içine yerleştirin.Daha sonra bunları oda sıcaklığında% 90, 95 ve% 100'lük bir etanol serisinden her biri beş dakika boyunca hareket ettirin. İşiniz bittiğinde, slaytları bir ısıtma plakasında hava ile kurutun. DNA problarını sıcak bir blok veya su banyosunda 10 dakika boyunca 75 santigrat derecede denatüre edin.Ardından, uygun slayta 10 mikrolitre pipetlemeden önce 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Probu 21 x 21 milimetrelik bir kapak kayması ile kaplayın ve kauçuk çimento ile kapatın. Slaytları nemlendirilmiş bir hibridizasyon odasında 37 santigrat derecede en az 18 saat boyunca inkübe edin.Kuluçkadan sonra, kauçuk çimentoyu forseps ile dikkatlice çıkarın. Daha sonra slaytları, üç beş dakikalık inkübasyon için 45 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış pH yedide 50 mililitre% 50 formamid iki kez SSC çözeltisinde inkübe edin. Daha sonra, slaytları 60 santigrat dereceye kadar önceden ısıtılmış, ancak 45 santigrat derecelik bir su banyosuna yerleştirilmiş 50 mililitre 0.1 kat SSC çözeltisine yerleştirin.Beş dakika boyunca inkübe edin ve beş dakikalık inkübasyonlar için tamponu iki kez değiştirin. Slaytları oda sıcaklığında 50 mililitre dört kez SSC çözeltisi içeren bir coplin kavanoza yerleştirin ve üç tampon değişimi ile 15 dakika boyunca inkübe edin. Spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek için, her slayta dört kez SSC çözeltisi için 100 mikrolitre% 4 BSA çözeltisi uygulayın ve bir parça parafin film ile kaplayın.Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Daha sonra, etiketli probu tespit etmek için slaytları oda sıcaklığında bir saat boyunca 200'de bir kez seyreltilmiş 100 mikrolitre streptavidin Cy3 ile inkübe edin. Slaytları oda sıcaklığında 50 mililitre dört kez SSC çözeltisi içeren bir coplin kavanoza yerleştirin ve üç tampon değişimi ile 15 dakika boyunca inkübe edin.Kızakları, DAPI içeren bir montaj çözeltisinin 20 mikrolitresine monte edin ve 22 x 50 milimetrelik bir kapak kayması ile bindirin. DNA halelerini ve kromozom bölgelerini, 100X yağ hedefine sahip bir epifloresan mikroskobu kullanarak görselleştirin. DNA halo preparasyonu, artık çekirdeğin kenarını, artık çekirdek içinde kalan DNA'yı ve çevreye biriken bağlanmamış DNA'yı görmeyi mümkün kılar.Proliferasyon yapan insan dermal fibroblastlarının DNA haleleri, BRDU içeren hücrelerden oluşturuldu ve daha sonra anti-BRDU antikoru ile boyandı. Proliferasyon yapan hücreler BRDU ve anti-pKi-67 için pozitifti. Bu protokol, DNA haleleri içindeki kromozom bölgelerini görselleştirmek için kullanıldı.Bireysel kromozomlar, kromozom 1, 13, 17 ve 18 için spesifik tam kol kromozomu boyama probları ile etiketlendi. Anti-pKi-67, çoğalan hücreleri ve aynı kültürdeki yokluğunu işaretlemek için kullanıldı. Yeşil telomerli DNA halo preparatları burada gösterilmiştir.DNA halesindeki telomerlerin oranını, özellikle deney iki görüntüsünde gözlemlemek mümkündür. Sessiz hücrelerde ortalama telomerlerin yüzdesi yaklaşık% 17 idi. Kromozom bağlanmasındaki farklılıklar, primer kontrol fibroblastlarında ve tipik ve atipik Hutchinson-Gilford progeria sendromlu hastalıklı hücrelerde, farklı bir Sun1 izoformu eksprese eden ve Lamin A mutasyonu olmayan tespit edildi.Kromozom bir ve 13, kontrollü DNA halelerine kıyasla, artık çekirdekler içindeki bağlanmalarında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar göstermektedir. Tüm kromozom bölgesinin konumu artık çekirdek ve DNA halesi ile ilişkiliydi. Bu protokolü denerken, hücrelerin doğru yoğunlukta tohumlandığından ve doğru zamanda çıkarıldığından emin olun.Bu işlemi takiben dolaylı immünofloresan ve RNA FISH yapılabilir.

fluorescence-situ-hybridization-on-dna-halo-preparations-to-reveal

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Kromozom replikasyonu zamanlama analizi için nicel bir yöntem tarif edilmektedir. Yöntem floresan ile kombinasyon halinde BrdU eklenmesi...

Floresan ile birlikte Kromozom çoğaltılıyor Zamanlama<em&gt; Yerinde</em&gt; Hibridizasyon

Burada 3D mikroskopi ve analizler (3D immuno-DNA FISH) izledi DNA FISH immünofloresan ve DNA dizileri tarafından histon modifikasyonları eşzamanlı tespiti için bir protokol açıklar.

3D Nükleer teşkilatında değişiklikler Eğitim için 3D-korunmuş Tane Çekirdekle ilgili Kombine İmmünofloresan ve DNA FISH

In situ hibridizasyon (FISH) floresan hücre içinde kendi doğal ortamında nükleik asitlerin saptanmasını sağlar. Burada fare embriyonik kök hücreleri X kromozomu inaktivasyon incelemek için kullanılabilir FISH vasıtasıyla RNA ve DNA birleşik, eş zamanlı olarak saptanması için bir protokol açıklar.

Kombine DNA-RNA Floresan<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH) Farklılaştırılmış Kadın Fare Embriyonik Kök Hücreleri X kromozomu inaktivasyonu Eğitim için

Burada, slayta monte kromozomlar üzerinde tekrarlayan heterokromatik dizileri görselleştirmek için floresan DNA in situ hibridizasyon (DNA ISH) gerçekleştirmek için basit bir yöntem sunuyoruz. Yöntem minimal reaktifler gerektirir ve kısa veya uzun problarla, farklı dokularla kullanım ve floresan veya floresan bazlı olmayan sinyallerle algılama için çok yönlüdür.

Floresan DNA için Basit Bir Yöntem<em&gt; In Situ</em&gt; Ezilmiş Kromozomlar için Hibridizasyon

Tekrarlayan dizileri gözlemlemek ve ölçmek için Caenorhabditis elegans'ın gonadında ve embriyolarında kısa bir floresan in situ hibridizasyon (FISH) prosedürü rapor ediyoruz. Telomer tekrarları ve telomerlerin alternatif uzama şablonu (TALT) olmak üzere iki farklı tekrarlayan diziyi başarıyla gözlemledik ve ölçtük.

Gözlem ve telomer Niceleme ve Tekrarlayan Diziler kullanma Floresan<em&gt; In Situ</emPNA Sondalar&gt; ile hibridizasyon (FISH)<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Bu el yazması Xoluşturmak için ayrıntılı bir yöntem sunuyor-kromozom kol sonda ve kız kardeşi durumunu incelemek için performans gösteren Floresans in situ hibridizasyon (balık) Kromatit uyum içinde prometafaz ve metafaz tutuklandı Drosophila yumurta. Bu iletişim kuralı segregasyonun kol uyum bozulmamış veya kesintiye farklı genotip içinde olup olmadığını belirlemek için uygundur.

Kol uyum içinde prometafaz ve metafaz durumunu izlemek için Floresans In Situ hibridizasyon (balık) kullanarak ben Drosophila yumurta

Bu protokol, kromatin üzerinde kondensatlar oluşturmak için kimyasal olarak indüklenmiş bir protein dimerizasyon sistemini göstermektedir.  Kimyasal dimerizatörlü telomerler üzerinde promiyelositik lösemi (PML) nükleer gövdesinin oluşumu gösterilmiştir. Damlacık büyümesi, çözünmesi, lokalizasyonu ve bileşimi canlı hücre görüntüleme, immünofluoresans (IF) ve floresan in situ hibridizasyon (FISH) ile izlenir.

Telomerlerde Kimyasal Dimerizasyona Bağlı Protein Kondensatları

Genom içindeki lokus kopya sayısını ve konumunu görsel olarak tespit eden bir DNA-FISH metafaz yayılım protokolü rapor ediyoruz. Bu yaklaşım, özellikle ekstrakromozomal DNA içeren ve homojen boyama bölgeleri içeren kanser hücre hatlarında amplifikasyon durumlarının tek hücre çözünürlükünü sağlar.

DNA-FISH Metafazı, İnsan Kanser Hücre Hatlarında Homojen Boyalı Bölgelerden Ekstrakromozomal DNA'yı Ayırt Etmek İçin Yayılır

Bu video in situ hibridizasyon, 2 farklı genler mekansal ve zamansal ifade desen genç civciv embriyolarında görüntülenebilmekte hangi bir yöntem 2-renk tüm montaj göstermektedir. Bu yöntem başlangıçta David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham ve David Ish-Horowicz tarafından tanıtıldı.

Erken Civciv Embriyolar in situ Hibridizasyon Çift Tüm Dağı

In situ hibridizasyon Tüm montaj, gelişim biyolojisi en yaygın olarak kullanılan teknikleri biridir. Burada, tek bir genin kesin ifadelerde desen analiz ve iki genin ifadesi etki çakışma belirlenmesi için çift floresan in situ hibridizasyon protokol yüksek çözünürlüklü sunuyoruz. Biz bir doku organizasyon vurgulamak için propidium iyodür nükleer karşı leke içerir.

Zebra balığı Tüm Dağı Yüksek Çözünürlüklü Çift Floresan Yerinde Hibridizasyon

Keşfedin, DNA halo preparatları ve floresan in situ hibridizasyon ile kanser ve progeria hücrelerinde nükleoskelet bağlanmalarını yüksek çözünürlükte analiz etme yöntemini. Bu protokol, genomik organizasyonu maliyet etkin şekilde araştırır.

Tüm Kromozomları, Telomerleri ve Gen Locilerini Ortaya Çıkarmak için DNA Halo Preparatlarında Floresan In Situ Hibridizasyon

Daha fazla video keşfet