Name: Fırıncı Maya saccharomyces cerevisiae Mitokondriyal Genom İfade Ürünlerinin Etiketlenmesi ve Görselleştirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Keşfedin, Saccharomyces cerevisiae mitokondriyal genom ürünlerinin radyoaktif etiketleme ve jel elektroforezi ile görselleştirilmesi yöntemini. Bu protokol, mitokondriyal protein biyosentezini incelemek için hızlı ve etkili bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu araştırma, 18-29-07002 numaralı Hibe numarası olan Rusya Temel Araştırma Vakfı tarafından finanse edildi. P.K., Rusya Federasyonu Bilim ve Yükseköğretim Bakanlığı Devlet Ataması, AAAA-A16-116021660073-5 hibe numarası ile desteklendi. M.V.P., Rusya Federasyonu Bilim ve Yükseköğretim Bakanlığı tarafından 075-15-2019-1659 (Kurchatov Genom Araştırmaları Merkezi Programı) hibe numarası ile desteklendi. Çalışma kısmen Moskova Devlet Üniversitesi Kalkınma Programı çerçevesinde satın alınan ekipmanlar üzerinde yapıldı. I.C., S.L., ve M.V.B. ayrıca Moskova Devlet Üniversitesi tarafından "Önde Gelen Bilim Okulu Nuh'un Gemisi" tarafından desteklendi.

1. Maya kültürü hazırlığı
<ol><li>Donmuş stok kültürlerinden uygun ortama sahip taze tabaklarda maya serin. Plakaları 24-48 saat boyunca 30 °C'de bir kültür inkübatöre koyun. NOT: Sıcaklığa duyarlı mutantların izin verilen sıcaklıkta büyümesine izin verin.</li>
	<li>Maya kültürlerini 15 mL tüplerdeki taze çizgiden 2 mL YPGal ortamında (%2 pepton, %1 maya özü, %2 galaktoz) aşılayın ve 30 °C'de 200 rpm'de ajite ederek bir gecede kuluçkaya bırakın.</li>
	<li>Kültürün optik yoğunluğunu 600 nm (OD600)dalga boyunda ölçün.</li>
	<li>Steril tüplerde 0,2 absorbans ünitesine karşılık gelen hacmi, oda sıcaklığında 30 s için 9.000 x g'da pelet maya hücrelerini alın ve üstnatant atın.</li>
	<li>Hücreleri 5 sn boyunca girdaplayarak 0,5 mL steril su ile yıkayın. Oda sıcaklığında 30 s için 9.000 x g'da pelet maya hücreleri ve süpernatant atın. Hücreleri 2 mL taze YPGal ortamında seyreltin.</li>
	<li>OD 600 1,5–1,9 değerlerine ulaşana kadar200 rpm ve 30 °C'de ajitasyon yapan kuluçkalayın. NOT: Maya büyüme oranları değişir, bu yüzden beklemeye hazır olun. Sabahın erken saatlerinde 1.3–1.6 adımlarını atmak mantıklıdır. Genellikle 4-5 saat sürer, ancak daha uzun sürebilir.</li>
</ol>2. Radyoaktif izotop şirketleşme
<ol><li>Bir mikrosantrifüj tüpünde bir optik üniteye eşdeğer kültür hacmini aktarın. Tüpleri 1 dakika boyunca 3.000 x g'da döndürün ve süpernatant atın. 5 sn boyunca girdap yaparak 0,5 mL steril su ile yıkayın.<ol>
<li>Oda sıcaklığında 30 s için 9.000 x g'da pelet maya hücreleri ve süpernatant atın. Maya hücrelerini 0,5 mL steril çeviri tamponunda yeniden biriktirin. Süspansiyonu 15 mL'lik bir tüpe yerleştirin. NOT: Çeviri tamponu, pH 6.0 ile %2 galaktoz (w/v) ve 50 mM potasyum fosfat içeren bir çözeltidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücre süspansiyonuna 0,2 mg/mL'lik son konsantrasyona kadar sikloeximid ekleyin. Sitosolik çeviriyi inhibe etmek için 200 rpm ve 30 °C'de 5 dakika ajitasyon için kuluçkaya yatırın. NOT: Cycloheximide çözeltisi (etanolde 20 mg/mL) deneyden önce taze olarak hazırlanmalıdır. Kloramfenikol aynı konsantrasyonda anisomycin ile başarıyladeğiştirilebilir 7.</li>
	<li>Hücre süspansiyonu için 25-30 μCi 35S-metiyonin ekleyin ve 200 rpm ve 30 °C'de 30 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. NOT: 35S-metiyonin ve 35S-sistein karışımı da kullanılabilir. Saf 35S-methionine en güçlü sinyal ve en iyi sinyal-gürültü oranı ile sonuçlanır. Genellikle, metiyonin sisteinden daha etkilidir, çünkü bu amino asidin mitokondriyal proteinlerdeki içeriği daha yüksektir. Bununla birlikte, EasyTag 35S-metiyonin ve sistein karışımı daha ucuzdur ve karşılaştırılabilir sonuçlar verir7. DİkKAT: 35S-metiyonin radyoaktiftir. Radyoaktif maddelerin kullanımı için olağan güvenlik uygulamalarını takip edin. NOT: Radyoaktivitenin birleştirilmesinin, toplam sinyallerin zaman içinde seviye atladığı bir sınıra ulaştığı iyi bilinmektedir. Bu sınıra ulaşıldıktan sonra, farklı çeviri ürünlerinin sentezlenme oranlarını belirlemek neredeyse imkansızdır. Mitokondriyal çeviri oranını analiz etmek için, doğrusal bir şekilde 35S-metiyonin ile inkübasyon süresi ile sinyal yoğunluğunun arttığı bir durumda olmak zorunludur. Yaygın laboratuvar vahşi tipi suşlar için sinyal, 30 dakikadan çok daha kısa kuluçka süreleri için zaten doymuş durumdadır. Çevirisel mutantlar çok farklı davranabilir. En azından yeni bir suşla çalışırken radyoaktivite birliğinin kinetiğini ve dolayısıyla çeviri oranını belirlemek için bir zaman kursu yapılmalıdır. Bunun için birkaç dakika (örneğin, 2,5, 5,0, 7,5, 10 ve 20 dk) aralıklarla numune almanızı öneririz.</li>
	<li>Etiketlemeyi durdurmak için etiketsiz "soğuk" metiyonin (son konsantrasyon 20 mM olmalıdır) ve puromisin (son konsantrasyon 1–10 μg / mL olmalıdır) ekleyin. 200 rpm ve 30 °C'de 10 dakika ajitasyon için kuluçkaya yaslanın. NOT: Bu adım ribozomlara peptitleri çevirmeyi bitirmeleri için zaman vermek için kritik öneme sahiptir. Aksi takdirde, tam boydan daha kısa tüm polipeptitler farklı bir boyutta tespit edilecektir. Mitokondriyal çeviri ürünlerinin stabilitesini belirlemek için bu adımda bir zaman kursu deneyi (nabız takibi) yapılabilir. Bunun için 30 dakika (örneğin, 30, 60, 90 ve 120 dk) aralıklarla numune almaya devam edin.</li>
</ol>3. Maya hücre lizisi ve proteinlerin çıkarılması
<ol><li>Maya hücrelerini 30 s için 9.000 x g'da santrifüjleme ile toplayın. Hücreleri 5 sn boyunca girdaplayarak 0,5 mL steril su ile yıkayın. Oda sıcaklığında 30 s için 9.000 x g'da pelet maya hücreleri. Üstnatant atın. Not. Protokol burada duraklatılabilir. Numuneleri -20 °C'de saklayın.</li>
	<li>5-10 sn boyunca pelet ve girdap için 75 μL lizis tamponu ekleyin. NOT: Lizis tamponu suda 1,8 M NaOH, 1 M β-mercaptoethanol ve 1 mM PMSF çözeltisidir. Proteinlerin alkali hidrolizine yol açan lizis tamponu ile aşırı inkübasyondan kaçının. Hemen 3.3 adımına geçin.</li>
	<li>pH 6.8 ile 500 μL 0.5 M Tris-HCl tampon ekleyin. Kısaca Girdap.</li>
</ol>4. Proteinlerin çökelttiri
DİkKAT: Metanol ve kloroform organik çözücülerdir. Organik maddelerin kullanımı için olağan güvenlik uygulamalarını takip edin.
<ol><li>Numuneye 600 μL metanol ekleyin. 5 sn için girdap.</li>
	<li>Numuneye 150 μL kloroform ekleyin. 5 sn için girdap.</li>
	<li>Numuneleri 12.000 x g'da 2 dakika santrifüj edin. Üst fazı bir örnekleyici ile dikkatlice atın.</li>
	<li>Numuneye 600 μL metanol ekleyin. Tüpü birkaç kez ters çevirerek dikkatlice karıştırın.</li>
	<li>Numuneleri 12.000 x g'da 2 dakika santrifüj edin. Üstnatant atın.</li>
	<li>Peletin hava ile 80 °C'de 2 dakika kurutun. NOT: Tüm sıvı buharlaşmalıdır. Pelet yetersiz kurutulmuşsa jeldeki proteinlerin sapkın bir şekilde ayrılması riski vardır. Bununla birlikte, peletin aşırı kurutılması mümkün değildir, bu nedenle bir gecede 4 ° C'de bile saklanabilir.</li>
	<li>Çökülen proteinleri 60 μL 1x Laemmli numune tamponunda çözün.</li>
	<li>40 °C'de 10 dakika ısıtın. NOT: Numuneleri 95 °C'de kaynatmaktan kaçının, çünkü bu toplama neden olur. Agregalar hala oluşuyorsa, örnekleri 2 dakika boyunca 12.000 x g'da döndürün ve süpernatant toplayın. Numuneler -20 °C'de saklanabilir. Protokol burada duraklatılabilir.</li>
</ol>5. SDS SAYFASI
<ol><li>%17,5 Laemmli SDS-poliakrilamid jelini atın. NOT: Daha iyi atp8 ve atp9 çözmek için jel içine 6 M üre eklenebilir. Degrade %15-%20 jeller de daha iyi çözünürlük sağlayabilir.</li>
	<li>Ceplerdeki her numunenin 15 μL'sini (40-50 μg) yükleyin. NOT: OD600 değerleri 1.6. Değilse, deterjan uyumlu reaktiflerle tahlil kullanarak protein konsantrasyonlarını ölçün.</li>
	<li>Mavi boya jel uzunluğunun yaklaşık% 65'ine ulaşana kadar jeli soğuk bir odada çalıştırın. NOT: Kullanılan sistem için (örneğin, Protean II xi hücresi), iki moddan birini kullanırız: 5 V/cm'de 16-17 saat veya 15 V/cm'de 5 saat. Hiçbir protein bromofenol mavi boyasından daha hızlı çalışmaz, ancak uzun çalışma atp8 ve atp9 sinyallerinin bulanıklığına neden olabilir.</li>
	<li>Jeli Coomassie parlak mavi ile lekelendirin ve yükleme kontrolü olarak gerekli olan bir tarama veya fotoğraf yapın. NOT: Yükleme kontrolü yapmanın alternatif bir yolu, örneğin porin 1 gibi mitokondriyal "ev tutma" genine karşı bir antikor ile immünblottingdir.</li>
</ol>6. Otoradyografi
<ol><li>Jeli bir jel kurutucuda kurutun. 3-5 gün boyunca bir depolama fosfor ekranı ile kasette saklayın. NOT: Kurutulmuş jelin taranmasının bir alternatifi, proteinlerin elektro-şişkinlik ve daha sonra taranarak nitroselüloz bir zara aktarılmasıdır. Daha güçlü sinyaller ve daha keskin bantlarla sonuçlanır.</li>
	<li>Ekranı fosforimager üzerinde tarayın. NOT: Fosfor görüntülemeye alternatif olarak, sinyalleri ortaya çıkarmak için X-ışını filmi de kullanılabilir.</li>
</ol>

<ol><li>Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+mutations+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA mutations in human disease.</a> Nature Reviews. Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).</li>
<li>Park, C. B., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+mutations+in+disease+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA mutations in disease and aging.</a> The Journal of Cell Biology. 193 (5), 809-818 (2011).</li>
<li>Goffeau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+with+6000+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Life with 6000 genes.</a> Science. 274 (5287), 546-563 (1996).</li>
<li>Westermann, B., Herrmann, J. M., Neupert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+translation+products+in+vivo+and+in+organello+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial translation products in vivo and in organello in yeast.</a> Methods in Cell Biology. 65, 429-438 (2001).</li>
<li>Foury, F., Roganti, T., Lecrenier, N., Purnelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+sequence+of+the+mitochondrial+genome+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The complete sequence of the mitochondrial genome of Saccharomyces cerevisiae.</a> FEBS Letters. 440 (3), 325-331 (1998).</li>
<li>Desai, N., Brown, A., Amunts, A., Ramakrishnan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+yeast+mitochondrial+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structure of the yeast mitochondrial ribosome.</a> Science. 355 (6324), 528-531 (2017).</li>
<li>Sasarman, F., Shoubridge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radioactive+labeling+of+mitochondrial+translation+products+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Radioactive labeling of mitochondrial translation products in cultured cells.</a> Methods in Molecular Biology. 837, 207-217 (2012).</li>
<li>Kuzmenko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aim-less+translation%3A+loss+of+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondrial+translation+initiation+factor+mIF3%2FAim23+leads+to+unbalanced+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Aim-less translation: loss of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial translation initiation factor mIF3/Aim23 leads to unbalanced protein synthesis.</a> Science Reports. 6, 18749(2016).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Keil, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxa1-ribosome+complexes+coordinate+the+assembly+of+cytochrome+c+oxidase+in+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Oxa1-ribosome complexes coordinate the assembly of cytochrome c oxidase in mitochondria.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (41), 34484-34493 (2012).</li>
<li>Singhal, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coi1+is+a+novel+assembly+factor+of+the+yeast+complex+III-complex+IV+supercomplex%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Coi1 is a novel assembly factor of the yeast complex III-complex IV supercomplex.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (20), 2609-2622 (2017).</li>
<li>Mick, D. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coa3+and+Cox14+are+essential+for+negative+feedback+regulation+of+COX1+translation+in+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Coa3 and Cox14 are essential for negative feedback regulation of COX1 translation in mitochondria.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (1), 141-154 (2010).</li>
<li>Bietenhader, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+relocation+of+the+mitochondrial+ATP9+gene+to+the+nucleus+reveals+forces+underlying+mitochondrial+genome+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Experimental relocation of the mitochondrial ATP9 gene to the nucleus reveals forces underlying mitochondrial genome evolution.</a> PLoS Genetics. 8 (8), e1002876(2012).</li>
<li>Couvillion, M. T., Churchman, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ribosome+%28mitoribosome%29+profiling+for+monitoring+mitochondrial+translation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ribosome (mitoribosome) profiling for monitoring mitochondrial translation in vivo.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 119, 4.28.1-4.28.25 (2017).</li>
<li>Suhm, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+system+to+monitor+mitochondrial+translation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell%22%5BJournal%5D)">A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast.</a> Microbial Cell. 5 (3), 158-164 (2018).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Gen ekspresyasyonu incelemeleri modern yaşam bilimlerinde merkezi bir yer kaplar. Bu karmaşık süreç hakkında fikir veren çok sayıda yöntem geliştirilmiştir. Burada, fırıncı mayası S. cerevisiae mitokondrisinde protein biyosentezine erişmeye izin verme yöntemini tanımladık. Genellikle mutant maya suşunun mitokondrilerindeki mRNA'ların çeviri verimliliklerini, çalışılan mutasyonun sonuçlarına erişmek için vahşi tipe karşı karşılaştırmak için uygulanır. Bu, araştırmacıların mitokondriyi etkilediği önerilen mutasyon...

Mitokondriler, ökaryotik bir hücrenin metabolizmasında derinden yer alan organellerdir. Elektron transfer zincirleri hücreye birden fazla biyokimyasal yolda kullanılan ana enerjik para birimi olan ATP'yi sağlar. Ayrıca, apoptoz, yağ asidi ve heme sentezi ve diğer süreçlerde yer almaktadırlar. Mitokondri disfonksiyonu iyi bilinen bir insan hastalığı kaynağıdır1. Organellerin yapısal veya düzenleyici bileşenlerini kodlayan nükleer veya mitokondriyal genlerdeki mutasyonlardan kaynaklanabilir2. Fırıncı mayası Saccharomyces cerevisiae, çeşitli nedenlerden dolayı mitokondriyal gen ekspresyonunu incelemek için mükemmel bir model organizmadır. İlk olarak, genomları tamamensıralanmıştır 3, iyi açıklamalı ve bu organizma ile yürütülen uzun araştırma geçmişi sayesinde literatürde büyük miktarda veri zaten mevcuttur. İkincisi, nükleer genomları ile yapılan manipülasyonlar, hızlı büyüme hızları ve yüksek verimli homolog rekombinasyon sistemleri nedeniyle nispeten hızlı ve kolaydır. Üçüncüsü, fırıncı mayası S. cerevisiae, mitokondriyal genomlarla manipülasyonların geliştirildiği birkaç organizmadan biridir. Son olarak, fırıncı mayası, fermente edilebilir karbon kaynakları içeren medyada büyüyebilecekleri için solunum kusurlu mutantların izolasyonu ve incelenmesine izin veren aerobe-anaerobe öğretim üyesi bir organizmadır.
Çeviridüzeyindebaker mayası S. cerevisiae'nin mitokondriyal gen ekspresyonunu inceleme yöntemini açıklıyoruz. Ana prensibi çeşitli gözlemlerden gelir. İlk olarak, maya mitokondriyal genom sadece sekiz proteini kodlar: sitokrom c oksidazın üç alt bireyi (Cox1p, Cox2p ve Cox3p), ATP sintazının üç alt bölümü (Atp6p, Atp8p ve Atp9p), ubiquinol-sitokrom c oksitodoreductase enziminin bir alt bölümü, sitokrom b (Cytb) ve mitokondriyal ribozomal protein Var1p5. Bu sayı küçüktür ve hepsi uygun koşullarda tek bir jel üzerinde elektroforezi ile ayrılabilir. İkincisi, mitokondriyal ribozomlar ökaryotik6yerine prokaryotik sınıfa aittir ve bu nedenle maya sitoplazmik ve mitokondriyal ribozomlar için antibiyotiklere duyarlılık farklıdır. Etiketli amino asidin(35S-metiyonin) sadece mitokondriyal çeviri ürünlerine dahil edildiği koşulları sağlayarak sikloseksüel ile sitoplazmik çevirinin inhibisyonunu sağlar. Sonuç olarak, deney, sekiz ürünün her biri için mitokondriyal çevirinin genel verimliliğini yansıtan, sentezlenen de novo sentezlenen mitokondriyal proteinlerde amino asit indüklenme oranı hakkında bilgi verir.

<table><tbody><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Akrilamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9099</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum persülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Bakteriyolojik</td><td>agar Sigma-Aldrich</td><td>A5306&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Biyodalga Hücre Yoğunluk Ölçer CO8000</td><td>BIOCHROM US BE</td><td>80-3000-45</td><td></td></tr><tr><td>MARKA standart tek kullanımlık küvetler</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z330361</td><td></td></tr><tr><td>kloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>sikloheksimid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1988&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Galaktoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5388&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>dijital blok ısıtıcı</td><td>Thermo Scientific</td><td>88870001</td><td></td></tr><tr><td>EasyTag L- [35S] -Metionin, 500 & mikro; Ci (18.5MBq), Stabilize Sulu Çözelti</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG709A500UC</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Santrifüj 5425</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-864-457</td><td></td></tr><tr><td>GE Depolama Fosfor Ekranları</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE29-0171-33</td><td></td></tr><tr><td>L-metiyonin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9625&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>N, N, N ve asal;, N ve prime;-Tetrametiletilendiamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>N, N ve asal;-Metilenbisakrilamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7279</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 44 / 44R Çalkalayıcı İnkübatör</td><td>New Brunswick Bilimsel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pepton et, bakteriyolojik</td><td>Millipore</td><td>91249 &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetansülfonil florür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 660nm Protein Test Kiti</td><td>Thermo Scientific</td><td>22662</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Temel Güç Kaynağı</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Protean II xi hücresi</td> Streptomyces <td></td> alboniger <td></td> Sigma-Aldrich P8833'ten Bio-Rad 1651802 <td></td></tr><tr><td>Puromisin dihidroklorür</td><td></td> Sodyum hidroksit <td>Sigma-Aldrich</td> 221465 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Storm 865 fosfor görüntüleyici</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizma tabanı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93352&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Vakumlu Isıtmalı Jel Kurutucu</td><td>Cleaver Scientific</td><td>CSL-GDVH</td><td></td></tr><tr><td>Maya özü</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625 & nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

fırıncı maya saccharomyces cerevisiae mitokondriyal genom İfade Ürünlerinin etiketlenmesi ve görselleştirilmesi

Labelling and Visualization of Mitochondrial Genome Expression Products in Baker's Yeast Saccharomyces cerevisiae

Mitokondriler, aerobik solunum yapabilen ökaryotik hücrelerin temel organelleridir. Dairesel genom ve gen ifade aparatı içerirler. Fırıncı mayasının mitokondriyal genomları sekiz proteini kodlar: sitokrom c oksidazın üç alt bireyi (Cox1p, Cox2p ve Cox3p), ATP sintazının üç alt bölümü (Atp6p, Atp8p ve Atp9p), ubiquinol-sitokrom c oksitodoreductase enzimi, sitokrom b (Cytb) ve mitokondriyal ribozomal protein Var1p'nin bir alt bölümüdür. Burada açıklanan yöntemin amacı, bu proteinleri özellikle 35S metiyonin ile etiketlemek, elektroforez ile ayırmak ve sinyalleri ekranda ayrık bantlar olarak görselleştirmektir. Yordam birkaç adım içerir. İlk olarak, maya hücreleri geç logaritmik büyüme aşamasına ulaşana kadar galaktoz içeren bir ortamda kültürlenir. Daha sonra, sikloeximide tedavisi sitoplazmik çeviriyi engeller ve sadece mitokondriyal çeviri ürünlerinde 35S metiyonin birleştirilmesine izin verir. Daha sonra, tüm proteinler maya hücrelerinden çıkarılır ve poliakrilamid jel elektroforez ile ayrılır. Son olarak, jel kurutulur ve depolama fosfor ekranı ile inkübe edilir. Ekran, bantları ortaya çıkaran bir fosforimager üzerinde taranır. Yöntem, bir mutant maya suşunun mitokondrilerindeki tek bir polipeptitin biyosentez oranını, mitokondriyal gen ekspresyon kusurlarını incelemek için yararlı olan vahşi tiple karşılaştırmak için uygulanabilir. Bu protokol, tüm maya mitokondriyal mRNA'ların çeviri oranı hakkında değerli bilgiler verir. Bununla birlikte, uygun sonuçlara varmak için çeşitli kontroller ve ek deneyler gerektirir.

Yukarıda açıklanan protokolün ardından, iki S. cerevisiae suşundan mitokondriyal çeviri ürünleri atadık: vahşi tip (WT) ve AIM23 geninin ( AIM23Δ ) silinmesini taşıyan bir mutant), kodlama mitokondriyal çeviri başlatma faktörü 3 (Tablo 1)8. Mitokondriyal çeviri ürünleri radyoaktif olarak etiketlendi ve SDS-PAAG9'da ayrıldı. Örnekler, bir zaman kursu oluşturmak için doygunluk öncesinde her 2,5 dakikada bir toplanmıştı (Şekil ...

Baker mayası mitokondriyal genom sekiz polipeptid kodlar. Mevcut protokolün amacı, hepsini etiketlemek ve daha sonra bunları ayrı bantlar olarak görselleştirmektir.

Fırıncı Maya saccharomyces cerevisiae Mitokondriyal Genom İfade Ürünlerinin Etiketlenmesi ve Görselleştirilmesi

Mitochondria are essential organelles of eukaryotic cells capable of aerobic respiration. They contain circular genome and gene expression apparatus. A ...

Mitokondriler, aerobik solunum yapabilen ökaryotik hücrelerin temel organelleridir. disfonksiyonları iyi bilinen bir insan hastalığı kaynağıdır. Baker mayası mitokondrileri sekiz proteini kodlayan dairesel genom içerir.Bu videoda, translojiyel ürünlerin radyoaktif etiketlemesi ve daha sonra jel elektroforez ile ayrılması yoluyla maya mitokondrisinde protein biyosentezini test etmek için kullanılan protokolü anlattık. Yordam birkaç önemli adım içerir. Donmuş stok kültürlerinden gelen mayayı uygun ortama sahip taze tabaklarda çizin.Plakaları 24 ila 48 saat boyunca 30 derecede kültür inkübatörüne koyun. Bu kültürleri 15 mililitrelik bir tüpteki taze çizgiden iki mililitre orta derecede aşılayın ve 30 derecede 200 RPM'de ajite ederek bir gecede kuluçkaya yatırın. 600 nanometre dalga boyunda kültürün optik yoğunluğunu ölçün.Steril tüplerdeki 0,2 emiciliği birimine karşılık gelen hacmi alın Oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 9.000 G'de maya hücrelerini palet edin. Bu süpernatant atın. Hücreleri beş saniye boyunca girdaplayarak 0,5 mililitre steril su ile yıkayın.Maya hücrelerini oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 9.000 G'de paletle. Üstnatant atın. Hücreleri iki mililitre taze silme agar ortamında seyreltin.Optik yoğunluk 1,5 ila 1,9 arasında 1,5 ila 1,9 değerlerine ulaşana kadar 200 RPM ve 30 derecede alınan inkübte kenarı. Mikro santrifüj tüpündeki bir optik üniteye eşdeğer kültür hacmini aktarın. Tüpleri bir dakikalığına 3000 G'de döndürün.Üstnatant atın. Hücreleri beş saniye boyunca girdaplayarak 0,5 mililitre steril su ile yıkayın. Oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 9.000 G'de maya hücrelerini paletle süpernatant atın.Maya hücrelerini 0,5 mililitre steril çeviri tamponunda yeniden askıya alın. Süspansiyonu 15 mililitrelik tüpe yerleştirin. Sitosolik çeviriyi engellemek için 200 RPM ve 30 derecede alınan beş dakikalık kenar için mililitre başına 0,2 miligramlık son konsantrasyona kadar hücre süspansiyonuna sikloeximide ekleyin.25'ten 30'a ekleyin S35 metiyonin S35 metiyonininin 25 ila 30 mikrokülerini hücre süspansiyonuna ekleyin ve 200 RPM ve 30 derecede alınan 30 dakika kenar boyunca kuluçkaya yatırın. 200 RPM ve 30 derecede alınan 10 dakikalık kenar için Incubate etiketlemesini durdurmak için etiketsiz soğuk metiyonin ve borymycin ekleyin. Maya hücrelerini 30 saniye boyunca 9.000 G'de santrifüjleme ile toplayın.Hücreleri beş saniye boyunca girdaplayarak 0,5 mililitre steril su ile yıkayın. Maya hücrelerini oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 9.000 G'de paletle. Üstnatant atın.Palete ve girdaplara beş ila 10 saniye boyunca 75 mikrolitre lizis tamponu ekleyin. pH 6.8 ile 0.5 molar tris tamponunun 500 mikrolitresini ekleyin. pH 6.8 ile.Kısaca Girdap. Numuneye 600 mikrolitre metanol ekleyin. Beş saniyeliğine girdap.Numuneye 150 mikrolitre kloroform ekleyin. Beş saniyeliğine girdap. Numuneleri 12.000 G'de iki dakika santrifüjleyin.Opaface'i bir örnekleyici ile dikkatlice atın.Numuneye 600 mikrolitre metanol ekleyin. Tüpü birkaç kez ters çevirerek dikkatlice karıştırın. Santrifüj örnekleri 12.000 G.Discard supernatant'ta iki dakika boyunca.Paleti 80 derecede iki dakika kurutun. Çökemiş proteinleri 60 mikrolitre Laemmli numune tamponunda çözün. Numuneleri 14 derecede 10 dakika ısıtın.Neden 17.5% Laemmli SDS poliakrilamid jel. Ceplere her numuneden 15 mikrolitre yükleyin. Mavi boya jel lenfin yaklaşık% 65'ine ulaşana kadar jeli soğuk odada çalıştırın.Jel Kumasi parlak mavi ile leke ve yükleme kontrolü olarak gerekli tarama veya fotoğraf yapmak. Jeli jel kurutucuda kurutun. Üç ila beş gün boyunca depolama fosfor ekranı ile kasette saklayın.Fosfor görüntüleyicilikte ekranı tarayın. Yukarıda açıklanan protokolün ardından, iki Saccharomyces cerevisiae suşundan mitokondriyal çeviri ürünleri atadık. Vahşi tip ve mutant varyantı silinmesi Aim23 gen kodlaması mitokondriyal çeviri başlatma faktörü üç.Mitokondriyal çeviri ürünleri zaten aktif olarak etiketlenmiş ve denatüre poliakrilamid jelde ayrılmıştır. Örnekler, zaman seyrini oluşturmak için doygunluğa iki buçuk dakikada bir toplandı. Jel, beş günlük sergiden sonra lekelendi, kurutuldu ve tarandı.Başarılı bir deneme durumunda, resim standart desene göre atanan sekiz bandı gösterir. Bununla birlikte, bireysel bantların yoğunlukları zorlanmaya ve deneysel koşullara bağlı olarak oldukça değişken olabilir. Her bant bir çeviri ürününe karşılık gelir.Veriler, mutant suşunun mitokondriyal protein sentezi yapabileceğini göstermektedir, çünkü vahşi tipte görünen tüm ürünler bu mutantta görülebilir. Bununla birlikte, bantların yoğunlukları vahşi tipten farklıdır, yani Aim23'ün bu silinmesi mitokondriyal gen ekspresyonını etkiler. Kumasi mavi leke ile demlenir ve yükleme kontrolü görevi görür.Verilerdeki sonuç, Image G veya Image Quan yazılımı kullanılarak suşlar veya deneysel koşullar arasındaki farkları belirlemek için ölçülebilir. Bunlar için her ürüne karşılık gelen sinyalin toplam sinyale oranı hesaplanır. Ortalama değerler ve standart sapmalar en az üç bağımsız deneyde hesaplanır.Sentezlenen proteinin kinetiği geçen yılki deneyde incelenmiştir. Numuneler, etiketleme reaksiyonun soğuk methionin ve borymycin tarafından durdurulmasından sonra belirtilen zaman noktalarında toplanır. Bu kontrol, ürünün kararlılığını tahmin etmek için gereklidir.Anti-Porin ile immün boyama bir antikor yükleme kontrolüdür. Maya mitokondrisinde protein biyosentezini incelemek için sıklıkla kullanılan yöntemi tanımladık. Bu protokol nispeten basit ve gerçekleştirilmesi hızlıdır.Aynı zamanda, son derece avantajlı olan dört mayalı mitokondriyal mRNA'nın çeviri oranı hakkında değerli bilgiler elde etmeyi sağlar. Bununla birlikte, ek deneyler gerektiren çeşitli sınırlamalara sahiptir ve bu eyaletler arası protein ve mRNA seviyelerinde yatmaktadır. Mitokondriyal çeviri sisteminde bu fonksiyonlar hakkında bilgi sağlayabilir, ancak mekanizmayı keşfetmek için daha gelişmiş teknikler kullanılmalıdır.

labelling-visualization-mitochondrial-genome-expression-products

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

GFP-füzyon proteinleri yaygın konfokal mikroskobi organelleri görselleştirmek için kullanılır. Ancak, genellikle bireysel mutagenez organellerin morfolojisini etkileyen mutasyonlar için tarama gerektirir ve zaman alıcıdır. Burada, neredeyse 5.000 maya gerekli olmayan genlerin aynı anda organel-GFP işaretleri dahil etmek için bir yöntem göstermektedir.

S. cerevisiae &quot;adlı organel morfolojisi küresel çalışma yüksek verimli bir yöntem

Mikroarray Analizi için Saccharomyces cerevisiae</em

Bozulma ve geri dönüşüm için maya vakuol asidik lümen organelleri teslim izlemek için sağlam bir yaklaşım açıklanmıştır. Bu yöntem, genetik olarak kodlanmış çift emisyon floresan pH biyosensör ve floresan mikroskobu kullanarak tek tek hücrelerin görselleştirme hedef organellerin özel etiketleme dayanmaktadır.

Maya İzleme Mitophagy Floresan Mikroskopi Testi Saccharomyces cerevisiae

Bu protokol, Flüoresans gerçekleştirmek için deneysel bir işlem...

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Akış sitometrisi ve mikroskopiye dayanan iki yardımcı yöntem mayada bir MAPK yolağının aktivasyonu ile uyarılan gen ekspresyonunun dinamiklerinin tek hücre düzeyinde miktarının, ki olanak sunulmaktadır.

Tek Maya Hücreleri MAPK İsteyerek İfade zamansal Kantitasyonu

Burada açıklanan protokolü yeni sentezlenmiş mRNA 4-thiouracil ile etiketli Maya hücrelerinden saf genom çapında miktar temel alır. Bu yöntem mRNA decay edilişi mRNA sentezi ölçmek için sağlar ve böylece, RNA polimeraz II transkripsiyon doğru bir ölçüm sağlar.

Saccharomyces cerevisiae Metabolik 4-thiouracil ve bir miktar ile etiketleme yeni mRNA RNA polimeraz II etkinlik için bir Proxy olarak sentezlenmiş

Protokol, mitokondriyal nükleoidlerin ticari olarak kullanılabilen DNA jeli lekesi ile özel etiketlemesini, süper çözünürlüklü yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SR-SIM) ile zaman atlamalı canlı etiketli hücrelerin zaman atlamalı serilerinin edinimini ve nükleoid hareketinin otomatik olarak izlenmesini açıklar.

Hızlandırılmış Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskomu için Mitokondriyal Nükleoidlerin Özel Etiketlemesi

Son gelişmelere rağmen, birçok maya mitokondriyal protein hala işlevleri tamamen bilinmemektedir. Bu protokol, moleküler işlevlerinin aydınlatılması için temel olan proteinlerin boyunkondriyal lokalizasyonunu belirlemek için basit ve güvenilir bir yöntem sağlar.

Tomurcuklanan Maya Sakkaromices cerevisiae'de Submitochondrial Protein Lokalizasyonunun Değerlendirilmesi

Hidrojen peroksit (H2O2) hem oksidatif hasar kaynağı hem de bir sinyal molekülüdür. Bu protokol, canlı mayada genetik olarak kodlanmış bir oransal biyosensör olan mitokondri hedefli HyPer7 (mtHyPer7) kullanılarak mitokondriyalH2O2'ninnasıl ölçüleceğini açıklar. Ücretsiz olarak kullanılabilen yazılımı kullanarak görüntüleme koşullarının nasıl optimize edileceğini ve kantitatif hücresel ve hücre altı analizin nasıl gerçekleştirileceğini ayrıntılarıyla açıklar.

Mitokondriyal Peroksit için Oransal Bir Biyosensör olan mtHyPer7'nin Canlı Maya Hücrelerinde Görüntülenmesi

Bu çalışma, maya mitokondrisinin biyolistik bir yöntem kullanılarak nasıl dönüştürüleceğini açıklamaktadır. Ayrıca, transformantların nasıl seçileceğini ve saflaştırılacağını ve mitokondriyal genom içinde hedef pozisyonda istenen mutasyonun nasıl tanıtılacağını da gösteriyoruz.

Baker'da Mitokondriyal Dönüşüm

Keşfedin, Saccharomyces cerevisiae mitokondriyal genom ürünlerinin radyoaktif etiketleme ve jel elektroforezi ile görselleştirilmesi yöntemini. Bu protokol, mitokondriyal protein biyosentezini incelemek için hızlı ve etkili bir yaklaşım sunar.

Fırıncı Maya saccharomyces cerevisiae Mitokondriyal Genom İfade Ürünlerinin Etiketlenmesi ve Görselleştirilmesi

Daha fazla video keşfet