Name: Zebra Balığı Embriyo Kalplerinde PM2.5kaynaklı DNA Hasarını Tespit Etmek için İmmünofluoresans Kullanma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Öğrenin, immunofluoresans ile Danio rerio embriyo kalplerinde PM2.5 kaynaklı DNA hasarını tespit etme yöntemini. Bu protokol, gelişimsel toksikoloji ve çevresel sağlık araştırmalarında protein ekspresyon değişikliklerini değerlendirmek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe numarası: 81870239, 81741005, 81972999) ve Jiangsu Yükseköğretim Kurumlarının Öncelikli Akademik Program Geliştirilmesi tarafından desteklendi.

Bu çalışmada kullanılan yabani tip zebra balığı (AB), Çin'in Wuhan kentindeki Ulusal Zebra Balığı Kaynak Merkezi'nden elde edilmiştir. Burada özetlenen tüm hayvan prosedürleri Soochow Üniversitesi Etik Kurulu Hayvan Bakım Kurumu tarafından incelenmiş ve onaylanmıştır.
1. PM2.5 örnekleme ve organik bileşik ekstraksiyon
NOT: PM2.5, daha önce açıklandığı gibi 1-7 Ağustos 2015 tarihleri arasında Suzhou, Çin'de kentsel bir alandatoplanmıştı.
<ol><li>Organik bileşenleri çıkarmak için 47 mm kuvars membran filtrelerini 500 °C'lik bir susturma fırınında 2 saat pişirin.</li>
	<li>24 saat kesintisiz örnekleme için PM2.5 örnekleyiciye filtre yerleştirin.</li>
	<li>Filtreyi çıkarın ve oda sıcaklığında 24 saat kurutun.</li>
	<li>Filtreyi analitik bir terazi ile ölçün.</li>
	<li>Solvent olarak dikloromethane kullanarak Soxhlet ekstraksiyonu ile filtreden organik bileşenleri çıkarın19.</li>
	<li>EOM'yi 60 °C su banyosunda ve azot akışında döner buharlaşma ile kurutun. EOM'yi DMSO'da çözün ve -20 °C'de saklayın.</li>
</ol>2. Zebra balığı embriyo toplama ve tedavi
<ol><li>Zebra balığını 28,5 ± 0,5 °C'de, 14 saat açık ve 10 saat koyu fotoperiyod döngüsüne sahip yeniden dolaşımdaki bir su ürünleri sisteminde sakla.</li>
	<li>Sağlıklı yetişkin zebra balıklarını 2:1 erkek-dişi oranında bir tanka yerleştirin.</li>
	<li>Ertesi gün embriyoları toplayın ve sistem suyuyla (yani zebra balığı üreme suyu) yıkayın.</li>
	<li>Normal bir gelişme gösteren zebra balığı embriyolarını (tek tip boyut, tam tahıllar ve yumurta pıhtılaşması yok) 7 cm çapında (tabak başına yaklaşık 50 embriyo) tek tek cam Petri kaplarında 4 gruba ayırın ve rastgele bölün.</li>
	<li>EMBRIYOLARI 2 hpf'den72 hpf'ye kadar 0,25 μM'de NAC varlığında veya yokluğunda PM 2,5 (5 mg/L) ile tedavi edin. DMSO'yu %0,1 (v/v) nihai konsantrasyona araç kontrolü olarak kullanın.</li>
</ol>3. Zebra balığı embriyolarının morfolojik gözlemi ve kardiyak diseksiyon
<ol><li>72 hpf'de embriyoları cam slaytlara aktarın ve stereo mikroskop altında gözlemleyin. Perikardiyal ödem, değiştirilmiş döngü ve küçülme boyutu gibi kalp malformasyonlarını kaydedin.</li>
	<li>Malformasyon oranlarını hesaplayın (toplam canlı embriyolardan kalp kusuru olan embriyoların yüzdesi) ve tek yönlü ANOVA kullanan gruplar arasındaki farklılıkları analiz etmek ve ardından Türkiye'nin Çoklu Karşılaştırma Testi (s < 0.05 = istatistiksel olarak anlamlı).</li>
	<li>Embriyoları cam slaytlarda hareketsiz hale getirmek için 0,6 mg/mL MS-222 ile uyuşturun.</li>
	<li>30 s için kalp atışlarını kaydedin ve ImageJ yazılımı5,20kullanarak kalp atışlarını ölçün.</li>
	<li>Zebra balığı embriyolarındaki kalpleri stereo mikroskop altında tek kullanımlık şırınga iğnesiyle parçalara ayrıştırın. Dikkat: Kalp şeklini tahrip etmekten kaçının.</li>
</ol>4. İmmünofluoresans Tahlil
<ol><li>Zebra balığı embriyolarının kalbinde PM2.5 indüklenen DNA hasarını tespit etmek için bir immünofluoresans testi kullanmak için, temiz bir cam tarafına daire çizmek için hidrofobik bir bariyer kalemi kullanın.</li>
	<li>Fiksatif bir çözüm yapmak için 1,25 mL Fosfat Tamponlu Saline (PBS) 50 μL% 4 paraformaldehit ekleyin.</li>
	<li>3 parçalanmış kalbi bir hidrofobik bariyer kalem dairesine yerleştirin ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatır.</li>
	<li>Çözeltiyi mikroskop altında kurutun ve numuneleri oda sıcaklığında en az 5 dakika kurutun, böylece kalpler cam slaytlara tamamen yapışır.</li>
	<li>Slaytları PBS'de üç kez% 0,1 Ara 20 (PBST) ile yıkama başına 5 dakika boyunca yıkayın.</li>
	<li>%5 BSA çözeltisi elde etmek için 1000 μL PBST'ye 50 μL sığır serum albümini (BSA) ekleyin ve spesifik olmayan antikor bağlamasını engellemek için slaytları nemli bir odada 1 saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Çözeltiyi dekante edin ve numuneleri PBST ile üç kez yıkama başına 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>Çalışan bir birincil antikor kokteyl çözeltisi elde etmek için 296 μL PBST'de 8-OHdG'ye karşı 2 μL fare monoklonal antikorunu ve φH2AX'a karşı 2 μL tavşan poliklonal antikorunu seyreltin.</li>
	<li>Kalp örneklerini 8-OHdG ve φH2AX'a karşı birincil antikor kokteyl çözeltisinin 50 μL'si ile oda sıcaklığında veya gece boyunca 4 °C'de en az bir saat boyunca nemlendirici bir odada kuluçkaya bırakın (Gecelik inkübasyon sinyal yoğunluğunu artırabilir).</li>
	<li>Çözeltiyi dekante edin ve numuneleri PBST ile üç kez yıkama başına 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>Çalışan ikincil antikor kokteyl çözeltisi elde etmek için 498 μL PBST'de 1 μL FITC etiketli keçi anti-fare ikincil antikor ve 1 μL cy3 keçi anti-tavşan ikincil antikor seyreltin ve örnekleri karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat boyunca ikincil antikorlarla (PBST'de 1:500) kuluçkaya bırakın.</li>
	<li>Çözeltiyi dekantlayın ve numuneleri pbs ile üç kez ışıktan korunan yıkama başına 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca nükleer boyama için örneklere 20 μL DAPI (4',6-diamidino-2-fenilol) ekleyin.</li>
	<li>Kurumasını ve hareket etmesini önlemek için oje ile kaydırmak ve mühürlemek için bir kapak kılıfı uygulayın. Ardından örnekleri floresan mikroskop altında görüntüleyin ve ImageJ yazılımını kullanarak kalp bölgesinin floresan sinyalini ölçün. Göreli değişiklikleri DMSO denetim örneklerinin ortalamasıyla hesaplayın. Verilerin istatistiksel önemini adım 3.2'deki gibi belirleyin.</li>
</ol>

<ol><li>WHO. Ambient (outdoor) air quality and health . World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/">http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/</a> (2018).</li>
<li>Zhang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Exposure+to+Air+Pollution+and+Risk+of+Congenital+Heart+Defects%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects.</a> European Journal of Pediatrics. 175, 1520(2016).</li>
<li>Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C., Ho, Y. L., Guo, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prenatal+exposure+to+PM2.5+and+Congenital+Heart+Diseases+in+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22The+Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Prenatal exposure to PM2.5 and Congenital Heart Diseases in Taiwan.</a> The Science of the Total Environment. 655, 880-886 (2019).</li>
<li>Mesquita, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+assessment+of+urban+atmospheric+particle-bound+PAHs%3A+relevance+of+composition+and+particle+size+in+Barcelona+%28Spain%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Pollution%22%5BJournal%5D)">Toxic assessment of urban atmospheric particle-bound PAHs: relevance of composition and particle size in Barcelona (Spain).</a> Environmental Pollution. 184, 555-562 (2014).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+between+AhR+and+wnt%2Fbeta-catenin+signal+pathways+in+the+cardiac+developmental+toxicity+of+PM2.5+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology%22%5BJournal%5D)">Crosstalk between AhR and wnt/beta-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos.</a> Toxicology. 355-356, 31-38 (2016).</li>
<li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-organ+toxicity+induced+by+fine+particulate+matter+PM2.5+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29+model%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Multi-organ toxicity induced by fine particulate matter PM2.5 in zebrafish (Danio rerio) model.</a> Chemosphere. 180, 24-32 (2017).</li>
<li>Lorda-Diez, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+senescence%2C+apoptosis+and+DNA+damage+cooperate+in+the+remodeling+processes+accounting+for+heart+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Cell senescence, apoptosis and DNA damage cooperate in the remodeling processes accounting for heart morphogenesis.</a> Journal of Anatomy. 234, 815-829 (2019).</li>
<li>Kouassi, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+damage+induced+in+A549+cells+by+physically+and+chemically+characterized+air+particulate+matter+%28PM2.5%29+collected+in+Abidjan%2C+Cote+d%27Ivoire%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Oxidative damage induced in A549 cells by physically and chemically characterized air particulate matter (PM2.5) collected in Abidjan, Cote d'Ivoire.</a> Journal of Applied Toxicology. 30, 310-320 (2010).</li>
<li>Gualtieri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+A549+cells+exposed+to+Milan+PM2.5%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of A549 cells exposed to Milan PM2.5.</a> Toxicology Letters. 209, 136-145 (2012).</li>
<li>Li, S. Y., Sigmon, V. K., Babcock, S. A., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+glycation+endproduct+induces+ROS+accumulation%2C+apoptosis%2C+MAP+kinase+activation+and+nuclear+O-GlcNAcylation+in+human+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Advanced glycation endproduct induces ROS accumulation, apoptosis, MAP kinase activation and nuclear O-GlcNAcylation in human cardiac myocytes.</a> Life Sciences. 80, 1051-1056 (2007).</li>
<li>Yamashita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+biochemistry+and+physiology.+Part+B%2C+Biochemistry+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in zebrafish development.</a> Comparative biochemistry and physiology. Part B, Biochemistry & Molecular Biology. 136, 731-742 (2003).</li>
<li>Moazzen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Acetylcysteine+prevents+congenital+heart+defects+induced+by+pregestational+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Diabetology%22%5BJournal%5D)">N-Acetylcysteine prevents congenital heart defects induced by pregestational diabetes.</a> Cardiovascular Diabetology. 13, 46(2014).</li>
<li>Sun, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acetylcysteine%2C+reactive+oxygen+species+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biology+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">N-acetylcysteine, reactive oxygen species and beyond.</a> Cancer Biology & Therapy. 9, 109-110 (2010).</li>
<li>Tu, S., Chi, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+in+cardiac+development+and+congenital+heart+birth+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects.</a> Differentiation. 84, 4-16 (2012).</li>
<li>Asnani, A., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+tool+to+identify+novel+therapies+for+human+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a tool to identify novel therapies for human cardiovascular disease.</a> Disease Models & Mechanisms. 7, 763-767 (2014).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxic+effects+of+polychlorinated+biphenyls+on+cardiac+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+Reports%22%5BJournal%5D)">Toxic effects of polychlorinated biphenyls on cardiac development in zebrafish.</a> Molecular Biology Reports. 41, 7973-7983 (2014).</li>
<li>Massarsky, A., Prasad, G. L., Di Giulio, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+particulate+matter+from+cigarette+smoke+disrupts+vascular+development+in+zebrafish+brain+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Total particulate matter from cigarette smoke disrupts vascular development in zebrafish brain (Danio rerio).</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 339, 85-96 (2018).</li>
<li>Ren, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AHR-mediated+ROS+production+contributes+to+the+cardiac+developmental+toxicity+of+PM2.5+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22The+Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos.</a> The Science of the Total Environment. 719, 135097(2020).</li>
<li>van Berlo, J. H., Molkentin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+emerging+consensus+on+cardiac+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">An emerging consensus on cardiac regeneration.</a> Nature Medicine. 20, 1386-1393 (2014).</li>
<li>Yue, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+folic+acid+on+PM2.5-induced+cardiac+developmental+toxicity+in+zebrafish+embryos+by+targeting+AhR+and+Wnt%2Fbeta-catenin+signal+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Protective effects of folic acid on PM2.5-induced cardiac developmental toxicity in zebrafish embryos by targeting AhR and Wnt/beta-catenin signal pathways.</a> Environmental Toxicology. 32, 2316-2322 (2017).</li>
<li>Zhao, X., Ren, X., Zhu, R., Luo, Z., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+oxide+nanoparticles+induce+oxidative+DNA+damage+and+ROS-triggered+mitochondria-mediated+apoptosis+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Zinc oxide nanoparticles induce oxidative DNA damage and ROS-triggered mitochondria-mediated apoptosis in zebrafish embryos.</a> Aquatic Toxicology. 180, 56-70 (2016).</li>
<li>Zhao, X., Wang, S., Wu, Y., You, H., Lv, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+ZnO+nanoparticles+exposure+induces+developmental+toxicity%2C+oxidative+stress+and+DNA+damage+in+embryo-larval+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Acute ZnO nanoparticles exposure induces developmental toxicity, oxidative stress and DNA damage in embryo-larval zebrafish.</a> Aquatic Toxicology. 136-137, 49-59 (2013).</li>
<li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+and+effects+on+glutathione-S-transferase+activity+induced+by+atrazine+exposure+in+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Toxicology%22%5BJournal%5D)">DNA damage and effects on glutathione-S-transferase activity induced by atrazine exposure in zebrafish (Danio rerio).</a> Environmental Toxicology. 26, 480-488 (2011).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Zebra balığı, embriyo kalbinin küçük boyutu nedeniyle çevresel kimyasalların kardiyak gelişimsel toksisitesini incelemek için mükemmel bir omurgalı modeli olmasına rağmen, batı leke analizi için yeterli protein elde etmek zordur. Bu nedenle, PM2.5'emaruz kalan zebra balığı embriyolarının kalplerindeki DNA hasarı biyobelirteçlerinin protein ekspresyon seviyelerini ölçmek için hassas bir immünofluoresans yöntemi sunuyoruz.
Diseksiyon sırasında kalbin bütünlüğünü sağlam tutmak önemlidi...

Hava kirliliği artık dünyanın karşı karşıya olduğu ciddi bir çevre sorunudur. Hava kalitesinin en önemli göstergelerinden biri olan ortam ince partikül maddesi (PM2.5),çok sayıda zararlı madde taşıyabilir ve kan dolaşım sistemine girerek insan sağlığına ciddi zararlar verebilir1. Epidemiyoloji çalışmaları PM2.5 maruziyetinin doğumsal kalp kusurları (CHD)2,3riskinin artmasına yol açabileceğini göstermiştir. Hayvan deneylerinden elde edilen kanıtlar, PM2.5'in zebra balığı embriyolarında ve farelerin yavrularında anormal kardiyak gelişime neden olabileceğini göstermiştir, ancak PM2.5'in kardiyak gelişimsel toksisitesinin moleküler mekanizmaları hala büyük ölçüde bilinmemektedir4,5,6.
DNA hasarı hücre döngüsünün tutuklanmasına neden olabilir ve apoptoza neden olabilir, bu da progenitör hücrelerin potansiyelini büyük ölçüde yok edebilir ve sonuç olarak kalp gelişimini bozabilir7). PM2.5de dahil olmak üzere çevresel kirleticilerinoksidatifstres mekanizmaları 8,9aracılığıyla DNA'ya saldırma potansiyeline sahip olduğu iyi belgelenmiştir. Hem insan hem de zebra balığı kardiyak gelişimi oksidatif strese karşı hassastır10,11,12. 8-OHdG oksidatif bir DNA hasar belirtecidir ve φH2AX sinyali DNA çift iplikçik kırılmalarının bir işaretidir. Hücre içi sistein ve glutatyonun sentetik öncüsü olan N-asetil-L-sistein (NAC), yaygın olarak anti-oksidatif bileşik olarak kullanılmaktadır. Bu çalışmada, PM2.5'teoksidatif stresin rolünü araştırmak için NAC kullanıyoruz - indüklenmiş DNA hasarı13.
Zebra balığı bir model omurgalı olarak kardiyak gelişimi ve insan kardiyovasküler hastalıklarını incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır, çünkü kardiyak gelişim mekanizmaları omurgalılar arasında yüksek oranda korunmaktadır14,15. Zebra balıklarını model olarak kullanmanın avantajları arasında küçük boyutları, güçlü üreme yetenekleri ve düşük beslenme maliyeti bulunur. Bu çalışmaların özellikle ilgisini çeken zebra balığı embriyoları erken gelişim sırasında dolaşım sistemine bağlı değildir ve şiddetli kalp malformasyonunda hayatta kalabilir14. Ayrıca, saydamlıkları tüm vücudun doğrudan mikroskop altında gözlemlenmesine izin verir. Bu nedenle, zebra balığı embriyoları, çeşitli çevresel kimyasallara maruz kalmanın bir sonucu olarak kardiyak gelişimsel toksisitenin indüksiyonunda yer alan moleküler mekanizmaları değerlendirmek için olağanüstü bir fırsat sağlar5,16,17. Daha önce PM2.5kaynaklı oksidatif stresin DNA hasarına ve apoptoza yol açtığını ve zebra balıklarında kalp malformasyonlarına neden olduğunu bildirmiştik18. Bu çalışmada zebra balığı embriyolarının kalbinde pm2.5kaynaklı DNA hasarının araştırılması için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

<table><tbody><tr><td>8-OHdG Antikoru</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji, ABD</td><td>sc-66036</td><td>Birincil antikor</td></tr><tr><td>Analitik denge</td><td>Sartorius, Çin</td><td>BSA124S</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Solarbio, Pekin, Çin</td><td>SW3015</td><td>DAPI'yi engellemek için</td></tr><tr><td></td><td>Abcam, ABD</td><td>ab104139</td><td>Nükleer karşı boyama için.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Solarbio, Pekin, Çin</td><td>D8371</td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroskobu</td><td>Olympus, Japonya</td><td>IX73</td><td>Floresan sinyallerini görüntülemek için /</td></tr> <tr><td>Keçi Anti-Tavşan IgG Cy3</td><td>Carlsbad, ABD</td><td>CW0159</td><td>İkincil antikor</td></tr><tr><td>Keçi Anti-Tavşan IgG FITC</td><td>Carlsbad, ABD</td><td>RS0003</td><td>İkincil antikor</td></tr><tr><td>N-Asetil-L-sistein (NAC)</td> <td>Adamas-Beta, Şangay, Çin</td><td>616-91-1</td><td></td></tr><tr><td>Orbital çalkalayıcı</td><td>QILINBEIER, Çin</td><td>TS-1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma, Çin</td><td>P6148</td><td>Fiksasyon için% 4 paraformaldehit yapın.</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Su HyClone</td><td>, ABD</td><td>SH30256.01</td><td>Yıkama için PBS'de% 0.1 Tween hazırlayın.</td></tr><tr><td>PM2.5 örnekleyici</td><td>TianHong, Wuhan, Çin</td><td>TH-150C</td><td>24 saat kesintisiz PM2.5 örneklemesi için.</td></tr><tr><td>Yeniden dolaşımdaki su ürünleri yetiştiriciliği sistemi</td><td>HaiSheng, Şangay, Çin</td><td></td><td>Zebra balığı içinde tutuldu.</td></tr><tr><td>Soxhlet çıkarıcı</td><td>ZhengQiao, Şangay, Çin</td><td>BSXT-02</td><td>Organik bileşenlerin çıkarılması için.</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon, Kanada</td><td>SMZ645</td><td>Zebra balığı embriyolarından kalp diseeksiyonu için.</td></tr><tr><td>Trikain metansülfonat (MS222)</td> <td>Sigma, Çin</td><td>E10521</td><td>Zebra balığı embriyolarını anestezi altına almak için</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma, Çin</td><td>P1379</td><td></td></tr> <tr><td>ve gama; H2AX Antikoru</td><td>Abcam, ABD</td><td>ab26350</td><td>Birincil antikor</td></tr></tbody></table>

zebra balığı embriyo kalplerinde pm2.5kaynaklı dna hasarını tespit etmek için İmmünofluoresans kullanma

Using Immunofluorescence to Detect PM2.5-induced DNA Damage in Zebrafish Embryo Hearts

Ortam ince partikül madde (PM2.5)maruziyeti kardiyak gelişimsel toksisiteye yol açabilir, ancak altta yatan moleküler mekanizmalar hala belirsizdir. 8-hidroksi-2'deoksijenaz (8-OHdG) oksidatif DNA hasarının bir belirtecidir ve φH2AX DNA çift iplikçik kırılmaları için hassas bir belirteçtir. Bu çalışmada zebra balığı embriyolarının kalbindeki PM2.5kaynaklı 8-OHdG ve φH2AX değişikliklerinin immünofluoresans tahlilini kullanarak tespit edilmesi amaçlanmıştır. Zebra balığı embriyoları,2 saat sonra döllenme (hpf) sırasında antioksidan N-asetil-L-sistein (NAC, 0.25 μM) varlığında veya yokluğunda PM 2.5'ten 5 μg/mL'de çıkarılabilir organik konularla (EOM) tedavi edildi. DMSO araç kontrolü olarak kullanıldı. 72 hpf'de kalpler şırınga iğnesi kullanılarak embriyolardan parçalandı ve sabitlendi ve permeabilize edildi. Bloke edildikten sonra, örnekler 8-OHdG ve φH2AX'a karşı primer antikorlarla araştırıldı. Numuneler daha sonra ikincil antikorlarla yıkandı ve inkübe edildi. Elde edilen görüntüler floresan mikroskopisi altında gözlemlendi ve ImageJ kullanılarak ölçülmedi. Sonuçlar, PM2.5'ten EOM'nin zebra balığı embriyolarının kalbinde 8-OHdG ve φH2AX sinyallerini önemli ölçüde artırdığını göstermektedir. Bununla birlikte, reaktif bir oksijen türü (ROS) çöpçü olarak hareket eden NAC, EOM kaynaklı DNA hasarına kısmen karşı koydu. Burada, zebra balığı embriyolarının kalplerindeki çevresel kimyasal kaynaklı protein ekspresyon değişikliklerinin tespitine uygulanabilecek PM2.5kaynaklı kalp kusurlarında DNA hasarının rolünü araştırmak için bir immünofluoresans protokolü sunuyoruz.

Bu immünoresans tahlili, çevresel kimyasallara maruz kalan zebra balığı embriyolarının kalplerindeki protein ekspresyon değişikliklerini ölçmek için hassas ve spesifik bir yöntemdir.
Bu temsili analizde, antioksidan NAC'nin yokluğunda veya varlığında PM2.5'e maruz kalan embriyolar kalp malformasyonlarının varlığı açısından değerlendirildi (Şekil 1). Gözlendiği gibi, PM2.5'ten E...

Bu protokol, zebra balığı embriyolarının parçalanmış kalplerinde PM2.5kaynaklı DNA hasarını tespit etmek için bir immünofluoresans testi kullanır.

Zebra Balığı Embriyo Kalplerinde PM2.5kaynaklı DNA Hasarını Tespit Etmek için İmmünofluoresans Kullanma

Ambient fine particulate matter (PM2.5) exposure can lead to cardiac developmental toxicity but the underlying molecular mechanisms are still unclear. ...

Bu yöntem, zebra balığı kalbindeki hedef proteinlerin ekspresyonunun doğru ve kolay bir şekilde tespit edilmesi için kullanılabilir. Hedef proteindeki değişim immünofluoresans ölçümü ile doğrudan tespit edilir. Metin el yazmasında açıklandığı gibi zebra balığı embriyo toplama ve tedavi gerçekleştirin.Döllenmeden 72 saat sonra embriyoları cam slaytlara aktarın ve stereo mikroskop altında gözlemleyin. Perikardiyal ödem, değiştirilmiş döngü ve küçülme boyutu gibi kalp malformasyonlarını kaydedin. Malformasyon oranlarını hesaplayın ve tek yönlü ANOVA kullanarak gruplar arasındaki farklılıkları analiz edin ve ardından Türkiye'nin çoklu karşılaştırma testi.Embriyoları mililitre MS222 başına 0,6 miligram ile uyuşturuyorktan sonra, 30 saniye boyunca kalp atışlarını kaydedin ve Image J yazılımını kullanarak kalp atışlarını ölçün. Stereo mikroskop altında tek kullanımlık şırınga iğnesi ile zebra balığı embriyolarından kalpleri dikkatlice inceleyin. Temiz bir cam kaydırağa daire çizmek için hidrofobik bir bariyer kalemi kullanın.Fiksatif bir çözüm yapmak için 1,25 pbs mikrolitresine% 4 paraformaldehitin 50 mikrolitresini ekleyin, ardından üç parçalanmış kalbi bir hidrofobik bariyer dairesine yerleştirin ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın. Çözeltiyi mikroskop altında kurutun ve numuneleri oda sıcaklığında en az beş dakika kurutun. Slaytları PBST'de yıkama başına beş dakika boyunca üç kez yıkayın.%5 BSA çözeltisi elde etmek için 1.000 mikrolitre PBST'ye 50 mikrolitre BSA ekleyin ve spesifik olmayan antikor bağlamasını engellemek için slaytları nemli bir odada bir saat kuluçkaya yatırın. Çözeltiyi dekante edin ve numuneleri PBS ile üç kez yıkama başına beş dakika yıkayın. Çalışan bir birincil antikor kokteyl çözeltisi elde etmek için 8-hidroksideoksiguanosin'e karşı iki mikrolitre fare monoklonal antikorunu ve 296 pbst mikrolitresinde gama-H2AX'a karşı iki mikrolitre tavşan poliklonal antikorunu seyreltin.Kalp örneklerini, oda sıcaklığında veya dört santigrat derecede gece boyunca nemlendirilmiş bir odada 50 mikrolitre birincil antikor kokteyl çözeltisi ile kuluçkaya yatırın. Çözeltiyi dekante edin ve numuneleri PBST ile üç kez yıkama başına beş dakika yıkayın. Çalışan bir ikincil antikor kokteyl çözeltisi elde etmek için 500 pbst mikrolitresinde fitc etiketli keçi anti-fare ikincil antikorunun bir mikrolitresini ve bir mikrolitre psy-3 keçi anti-tavşan ikincil antikorun seyreltin.Örnekleri sekonder antikorlarla karanlıkta oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın. Çözeltiyi dekante edin ve numuneleri PBS ile üç kez yıkama başına beş dakika yıkayın. Nükleer boyama için numunelere 20 mikrolitre DAPI ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.Slayda bir kapak kayması uygulayın ve kurumasını ve hareketi önlemek için oje ile kapatın. Örnekleri floresan mikroskop altında görüntüleyin ve ImageJ yazılımını kullanarak kalp bölgesinin floresan sinyalini ölçün. DMSO denetim örneklerinin ortalamasını kullanarak göreli değişiklikleri hesaplayın ve verilerin istatistiksel önemini belirleyin.Antioksidan, N-asetil-L-sistein veya NAC'nin yokluğunda veya varlığında PM 2.5'e maruz kalan embriyolar kalp malformasyonlarının varlığı açısından değerlendirildi. PM 2.5'ten EOM, DMSO kontrolü ile tedavi edilen kalplere kıyasla perikardiyal ödem, değiştirilmiş döngü ve küçülme boyutu gibi kardiyak teratogenezde önemli bir artışa mal oldu. EOM'ye maruz kalan embriyolarda da kalp atış hızı önemli ölçüde azaldı.NAC zayıflatılmış EOM kaynaklı kalp kusurlarının eklenmesi. EOM ile tedavi edilen dokularda DNA hasarının boyutunu değerlendirmek için immünoresans testi kullanıldı. EOM ile tedavi edilen zebra balığı embriyolarının kalplerinde 8-hidroksideoksiguanosin ve gama-H2AX ekspresyozin düzeyleri önemli ölçüde artmış, bu da sırasıyla oksidatif DNA hasarında ve DNA çift iplikçik kırılmalarında artış olduğunu gösterir.EOM kaynaklı DNA hasarı NAC takviyesi ile kısmen etkisiz hale bırakıldı. Bu protokolü denerken, örnekleri PBS ile yıkarken dikkatli olun, çünkü zebra balığı kalbi slayttan soyulabilir.

using-immunofluorescence-to-detect-pm25-induced-dna-damage-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Zebra balığı embriyonik kalp immün yapmak için hızlı bir şekilde açıklanmıştır. Tüm montaj immün yaklaşımı ile karşılaştırıldığında, bu yöntem, çok daha az işlem süresi içinde kalp hücre / hücre içi yapıları ortaya yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde sağlayan antikorlar, penetrasyon önemli ölçüde artırır.

Zebra balığı Embriyonik Kalp Dissected, immün

Bu video, sırasıyla DNA hasarını ve çift sarmallı DNA kırılmalarını gösteren 8-OHdG ve γH2AX seviyelerini ölçerek zebra balığı embriyolarının kalplerinde PM2.5'in neden olduğu oksidatif hasarı tespit etmek için oldukça hassas bir immünofloresan tabanlı testi göstermektedir.

Balık Embriyolarında PM2.5 Aracılı DNA Hasarını Tespit Etmek için İmmünofloresan Testi

Bazı genetik bozulmalar veya toksinlere maruz kalma, belirli hücre tiplerinin ölümüne yol açan normal gelişimsel süreçleri bozabilir. Zebra balığı embriyolarında tam montajlı immünofloresan ile aktive edilmiş Kaspaz 3'ün analizi, spesifik olarak apoptoz geçiren hücrelerin evre ve dokuya özgü lokalizasyonunu ortaya koymaktadır.

Aktif Kaspaz 3 Algılama Tüm montaj immünofloresans tarafından Zebra balığı Embriyolar Apaptozun Analizi

Zebra balığı embriyolarının dokuya özel floresans yarı otomatik görüntüleme için bir protokol aşağıda tarif edilmiştir.

Zebra balığı Embriyolar Doku spesifik Floresans yarı otomatik Görüntüleme

Zebra balığı kalp gelişimi sırasında kalp gen ekspresyon profillerini analiz etmek, toplam RNA izole kalpleri elde edilecek olan. Burada, biz kalp-özel mRNA elde etmek Zebra balığı embriyolarının gelen hızlı manuel diseksiyon ile işlevsel / yenerek kalpleri toplamak için bir protokol mevcut.

Transkripsiyonal Analiz Büyük ölçekli Zebra balığı Embriyonik Kalp Diseksiyon

Hücre ve dokularda protein seviyeleri, çoğu zaman sıkı bir şekilde protein üretimi ve temizlenmesi dengesi ile düzenlenir. Fotoçevrim (FDAP) sonra floresans Bozunma kullanan proteinlerin temizlenme kinetiği deneysel in vivo olarak ölçülebilir.

Fotoçevrim sonra Floresans Bozunma kullanarak Oturma balığı Embriyolar protein stabilitesi ölçümü (FDAP)

Bu protokolün amacı, embriyonik zebrabalıklarında segmental kardiyak fonksiyonun hem fizyolojik hem de patolojik koşullarda değerlendirilmesi için yeni bir yöntemin ayrıntılarını vermektir.

Miyokardiyal Mekanik Deformasyonun Yer Değiştirme Analizi (DIAMOND) Embriyonik Zebrabalığında Kardiyak Fonksiyonun Segmental Heterojenliğini Ortaya Çıkarır

Zebra balığı kalbinin in vivo ışık tabakası floresan mikroskopisi ile incelenmesi için optimize edilmiş araçlar açıklıyoruz. Özellikle, parlak kardiyak transgenik çizgiler öneriyoruz ve gelişimsel ve kalp kusurlarını önleyen yeni nazik gömme ve hareketsizleştirme teknikleri sunuyoruz. Kardiyak görüntülemeye uyarlanmış olası bir veri toplama ve analiz boru hattı da sağlanmaktadır.

Zebra Balığı Embriyolarında Hızlı Kardiyak Dinamiklerin Işık Tabakası Mikroskopisi

Sinyal yollarının optogenetik manipülasyonu, gelişim, rejenerasyon, homeostaz ve hastalıkta sinyalleşmenin nasıl çözüldüğünü araştırmak için güçlü bir strateji olabilir. Bu protokol, erken zebra balığı embriyosunda ışık-oksijen-voltaj algılama alanı tabanlı Nodal ve kemik morfojenik protein (BMP) sinyal aktivatörlerinin kullanılması için pratik yönergeler sağlar.

Zebra Balığı Embriyolarında Optogenetik Sinyal Aktivasyonu

Bu çalışma, bireysel zebrafish embriyonik kalplerinde küresel DNA metilasyonunu nicelikten ölçemek için hassas bir immünoflüoresans tabanlı görüntüleme yöntemi oluşturmaktadır. Bu yaklaşım, sınırlı doku materyali zorluğunu aşar ve bisülfit dönüşümü ihtiyacını atlar.

Zebrafish Larvalarının Kalplerinde Küresel DNA Metilasyonu Tespiti

Öğrenin, immunofluoresans ile Danio rerio embriyo kalplerinde PM2.5 kaynaklı DNA hasarını tespit etme yöntemini. Bu protokol, gelişimsel toksikoloji ve çevresel sağlık araştırmalarında protein ekspresyon değişikliklerini değerlendirmek için kullanılır.

Zebra Balığı Embriyo Kalplerinde PM_2.5kaynaklı DNA Hasarını Tespit Etmek için İmmünofluoresans Kullanma

Daha fazla video keşfet