Name: Hücre Delici Peptit ile Membran Dengesizleşmesini Araştırmak için Floresan Sızıntı Tahlil (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Öğrenin, hücre delici peptitlerin membran dengesizleştirme mekanizmalarını floresan sızıntı tahlili ile nasıl araştırılacağını. Bu yöntem, lipozomlar ve floresan boyalar kullanarak hücre içine alım süreçlerini anlamanıza yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, makalenin eleştirel incelemesi için Emilie Josse'ye teşekkür eder. Bu çalışma "La Ligue contre le Cancer", "Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer" ve "Centre National de la Recherche Scientifique" (CNRS) vakfı tarafından desteklendi.

1. Büyük Unilamellar Vezikles (LUVs) hazırlanması
<ol><li>Luv'ları floresan sızıntı tahlilleri için hücre zarı taklitleri olarak kullanımları için hazırlayın.</li>
	<li>Hamilton cam şırıngar fosfatidylcholine (DOPC, 786.11 g/mol), sphingomyelin (SM, 760.22 g/mol) ve Kolesterol (Chol, 386.65 g/mol) ile molar oranında 4:4:2 karıştırın. Lipid çözeltisi, 25 mL'lik cam yuvarlak alt şişede 25 mg/mL'de bir metanol/kloroform (3/1; hacim/hacim) çözücüde çözünen her lipitin stok çözeltisinden elde edilir. 4 μmol DOPC, 4 μmol SM ve 2 μmol Chol'a dayanan lipid çözeltisi, sırasıyla 126 μL, 117 μL ve 31 μL karıştırılarak stok çözeltisinden elde edilir. DİkKAT: Metanol toksik ve yanıcı bir çözücüdür ve kloroform toksik ve kanserojendir. Her ikisi de bir başlık altında uygun koruma ile ele alınmalıdır.</li>
	<li>Kurutulmuş bir lipit filmi oluşana kadar 60 °C'de 45-60 dakika boyunca vakum altında bir döner evaporatör kullanarak metanol / kloroform buharlaştırın.</li>
	<li>İki stok HEPES tampon çözümü hazırlayın. 20 mM HEPES (238,3 g/mol) ve 75 mM NaCl (58,44 g/mol) karıştırarak HEPES tampon 1'i hazırlayın ve pH'ı 7,4'e ayarlayın. 20 mM HEPES ve 145 mM NaCl karıştırarak HEPES tampon 2'yi hazırlayın ve pH'ı 7,4'e ayarlayın. HEPES tamponları 1 ay boyunca 4 °C'de saklanabilir. NOT: Bir kilometre sayacı kullanarak tamponların ozmolaritesinin kontrol etmesi önerilir.</li>
	<li>Membran geçirimsiz floresan boya-quencher çiftini çözerek lipid hidrasyon çözeltisi hazırlayın, HEPES tampon çözeltisinde 8-aminonaftafen-1, 3, 6-trisülfiyonik asit, 12,5 mM'de disodium tuzu (ANTS, 427,33 g/mol) ve 45 mM'de p-ksilen-bispyridinium bromür (DPX, 422,16 g/mol). ANTS'ı DPX ile karıştırmak sarı renkli bir çözeltiye yol açar. 12,5 mM ANTS ve 45 mM DPX konsantrasyonlarına ulaşmak için, 4 mL HEPES tampon 1'de sırasıyla 21,4 mg ve 76 mg çözün. NOT: Lipid hidrasyon çözeltisi, tüpün alüminyum folyo ile sarılmasıyla 4 °C'de 2 hafta saklanabilir.</li>
	<li>Kurutulmuş lipid filmini lipid hidrasyon çözeltisinin 1 mL'si ile yeniden canlandırarak ve kurutulmuş lipid filminin çözünmesine kadar girdaplayarak çokmeller veziklinleri (MLV) yeniden oluşturun. Küçük lipid agregaları önceki adımları olumsuz etkileyeceğinden çözümün tamamen çözündüğünden emin olun. Ayrıca, kalan lipit filmi olmadığından emin olmak için cam yuvarlak alt şişenin duvarını kontrol edin. NOT: Çözelti, çözünürleşmeden sonra opalescent ve açık sarı görünecektir.</li>
	<li>Unilamellar vesicles elde etmek için veziklikleri beş dondurma/çözme döngüsüne tabi edin. Her döngüyü, dondurma adımı için 30 s sıvı nitrojene 30 sn boyunca cam yuvarlak alt şişe koyarak, ardından çözme adımı için 2 dakika boyunca bir su banyosunda bırakarak gerçekleştirin. NOT: Banyo suyunun sıcaklığı lipitlerin erime sıcaklığından 5-10°C daha yüksek olmalıdır.</li>
	<li>Metal ekstrüder kutusuna yerleştirilen her politetrafloroetilen (PTFE) ekstrüder parçasına HEPES tamponu ile ön nemlendirilmiş iki filtre desteği yerleştirerek lipid ekstrüder hazırlayın.</li>
	<li>Bir filtre desteğinin üstüne HEPES nemlendirilmiş polikarbonat membran (0,1 μm gözenek boyutu, 25 mm çapında) koyun.</li>
	<li>İki metal ekstrüder bidonlarını monte edin ve vidalayın.</li>
	<li>Monte edilen ekstrüderi tutucuya yerleştirin ve her politetrafloroetilen ekstrüder parçasının ekstremitesinde uygun deliğe 1 mL şırıngır sokun. Ekstrüzyon, bir şırıncadan diğerine test edilen sıvının polikarbonat membrandan geçişine karşılık gelir.</li>
	<li>Sızıntı veya sorun olmadığından emin olmak için ekstrüderi 1 mL şırınnadan birine yüklenmiş 1 mL HEPES tamponu ile test edin.</li>
	<li>1 mL HEPES tamponu MLV örneği ile değiştirin.</li>
	<li>MLV örneğini bir şırıncadan diğerine polikarbonat membrandan en az 21 kez geçirerek aynı boyutta düzgün SUV'ler elde ederek ekstrüzyon gerçekleştirin. NOT: Ekstrüzyon lipit karışımının erime sıcaklığından daha yüksek bir sıcaklıkta yapılmalıdır.</li>
</ol>2. LUV'ların Saflaştırılması
<ol><li>Kapsüllenmemiş ANTS ve DPX fazlalığını gidermek için bir sütun saflaştırması hazırlayın.</li>
	<li>Sıvı kromatografi sütununda (Luer Lock, Ceketsiz, 1,0 cm x 20 cm, yatak hacmi 16 mL) sütun renksiz kısmının 1 cm altına kadar %0,01 NaN3 (65 g/mol) ile sulu ortamda yeniden sulanan çapraz bağlı dektran jelini (G-50) tanıtın.</li>
	<li>Musluğu açın ve çapraz bağlı dektran jelini yerleştirmek için sıvının akmasına izin verin.</li>
	<li>20 mL HEPES arabelleği 2 ile eluting yaparak sütunu yıkayın ve sütunun çıkış akışını atın.</li>
	<li>Kolonun üzerindeki ölü çözücü hacmi en aza indirildikten sonra (<100 μL) ancak çapraz bağlı dektran jelinin kurumasını önlemek için yeterli olduğunda musluğu kapatın.</li>
	<li>Yeni ekstrüde LUV'ları (sarı) sütuna yerleştirin ve çapraz bağlı dektran jeline girmelerine izin verin.</li>
	<li>LUV saflaştırmasını gerçekleştirmek için sütuna sürekli hepes arabelleği 2 ekleyin.</li>
	<li>Yaklaşık 2 mL HEPES tampon 2'yi boşaltın (çapraz bağlı dektran jelinin kurumasını önlemek için sütunun üst kısmını düzenli olarak doldurmayı unutmayın): serbest sarı ANTS ve DPX çözeltisi lipozomlardan daha yavaş göç eder.</li>
	<li>Saflaştırılmış LUV'ları tüplerde toplamaya başlayın (1,5 mL).</li>
	<li>Sütundan gelen yılan balığı damlalarını gözlemleyin ve opalescent olduklarında lipozomlar içerirler. LUV içeren fraksiyonu kurtarmak için tüpü değiştirin.</li>
	<li>Damlalar artık opalescent olmayana kadar elute (~1 mL). Daha sonra, ayrı bir kesirde 0,5 mL daha elute edin ve sonra kaçmayı bırakın. NOT: Standartlar artık LUV'ların elüasyon hacmini kalibre etmek için kitler veya bireysel moleküler ağırlıklar olarak çok çeşitli moleküler ağırlıklarda mevcuttur.</li>
	<li>Floresan boyasının ağartılmasını önlemek için tüpleri LÜV'lerle birlikte alüminyum folyoya sarın.</li>
	<li>Kolonu 20 mL HEPES tampon 2 ile yıkayın.</li>
	<li>SUV'ler daha sonra 4 °C'de bir hafta saklanabilir. NOT: LUV stabilitesi LUV konsantrasyonuna ve bileşimine ve iyonik mukavemete bağlı olabileceğinden, LUV'lerin boyutu dinamik bir ışık saçılma (DLS) cihazı kullanılarak kontrol edilmelidir (bkz. bölüm 4). LUV Boyutunun ve Homojenliğin Karakterizasyonu) her test öncesi.</li>
</ol>3. LUV konsantrasyonunun ölçülmesi
<ol><li>Kolin konsantrasyonunun değerlendirilmesini sağlayan fosfolipid nicelleştirme kiti ile LUV konsantrasyonunun tahmin edilmesi19. Bu test, polar kafa içeren kolin içeren fosfolipidler önemli olduğunda uygulanabilir (7'lerin% >50'si).</li>
	<li>Sağlanan 3 mL tamponda 18 mg kromojen substratını eriterek renk reaktifini hazırlayın.</li>
	<li>3 mL renkli reaktif ile 10 x 10 x 45 mm'lik bir polistiren cuvette yükleyin.</li>
	<li>Saf renk reaktifini boş koşul olarak kullanın (Boş). 20 μL LUV numunesi (Test) veya 20 μL bilinen kolin konsantrasyonu standart çözeltisi (Standart) ekleyin.</li>
	<li>İyice karıştırın ve 37 °C'de tüm koşullarda (Boş, Test ve Standart) 5 dakika kuluçkaya yatırarak kuluçkaya yatırarak.</li>
	<li>Test numunesinin ve standart çözümün emiciliğini (optik yoğunluk, OD) bir spektrofotometre ile 600 nm'de kontrol olarak boş çözelti ile ölçün.</li>
	<li>BILINEN konsantrasyon standardına kıyasla LUV'ların lipid konsantrasyonu olan C[LUV]'un kolin eşdeğerini tahmin etmeyi sağlayan OD değerlerini kontrol edin.</li>
	<li>Aşağıdaki denklemi kullanarak hesaplamayı gerçekleştirin: C[LUV] (mol / l) = (OD Örneği / OD Standardı) x C[Standart] (mol / l) NOT: Fosfolipid nicelleştirme kiti, C[Standart] = 3.87 mmol/L molar konsantrasyonuna karşılık gelen 54 mg/dL'de Kolin Klorür (139.6 mg/l) standart çözeltisi sağlamıştır.</li>
</ol>4. LUV boyutunun ve homojenliğinin karakterizasyonu
<ol><li>LUV boyutunu (nm cinsinden) ve çok disiplinlilik indeksini (PdI) belirlemek için bir DLS cihazı kullanarak ölçüm gerçekleştirin.</li>
	<li>Çözücü/tamponun ve kullanılan cuvette'in viskozitesini belirterek uygun "standart çalışma prosedürünü" (SÇP) programlayın.</li>
	<li>LUV çözeltisinin 500 μL'sini bir polistiren yarı mikro cuvette yerleştirin.</li>
	<li>Polistiren yarı mikro cuvette'i bir DLS cihazına yerleştirin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında, boyut dağılımını parçacık dağılımının ortalama büyüklüğü (Z-ortalama) ve homojenlik (polidisperlik indeksi, PdI) açısından ölçün.</li>
	<li>Tüm sonuçlar, her biri üç tekrarlayan döngüde gerçekleştirilen iki bağımsız ölçümden elde edilir. NOT: 0,149 ± 0,041 PDI ile 137 ± 7 nm ortalama boyutlarında olacaktır.</li>
</ol>5. Peptit çözeltileri hazırlama
<ol><li>Sızıntı tahlil için analiz edilmesi gereken peptitin bir stok çözeltisini hazırlayın.</li>
	<li>Peptit tozluğunu (%>95 saflıkta) saf suda çözün (örneğin, 500 μL saf suda 1 mg peptit). NOT: Peptitlerin saf suda seyreltilmeleri ve eserleri teşvik edebilecek dimetil sülfit (DMSO) çözünürlüğünden kaçınmanız önerilir (örneğin, membran permeabilizasyonu20).</li>
	<li>Vortex 5 s için peptit çözeltisi.</li>
	<li>Peptit çözeltisini bir su sonikasyon banyosunda 5 dakika ve daha sonra 12.225 x g'da5 dakika santrifüjde sonicate edin. Konsantrasyon tespiti için süpernatant toplayın.</li>
	<li>Emiciliği üç bağımsız peptit seyreltmenin 280 nm'sinde ölçün ve ardından molar yok olma katsayısı ε (peptit dizisindeki triptofan ve tirozin içeriğine bağlı olarak) ve Bira-Lambert kuralını kullanarak peptit konsantrasyonunu hesaplayın. NOT: Peptit triptofan ve tirozin içeriyorsa, molar yok olma katsayısı ε Triptofan ε = 5.690 M-1cm-1 ve Tirozin ε = 1.280 M-1cm-1temel alınarak hesaplanır. Peptit dizisi triptofan veya tirozin içermezse, konsantrasyonu ölçmek için başka kolorimetrik test yapılabilir (örneğin, BCA veya Bradford).</li>
	<li>Peptit çözeltisini saf suda 100 μM'lik nihai bir çözeltiye seyreltin ve 4 °C'de saklayın. NOT: Saf suda, 4 °C depolama sırasında peptit bozulması meydana gelmez. Bununla birlikte, su buharlaşmasının oluşmamasını sağlamak için peptit konsantrasyonu her 2 haftada bir ölçülmelidir.</li>
</ol>6. Floresan sızıntı tahlil
<ol><li>Floresan sızıntı tahlili oda sıcaklığında spektrofluorometre üzerinde ölçülür. Ekscitasyon ve emisyon dalga boyu sırasıyla Ex = 360 nm ± 3 nm ve Em = 530 nm ± 5 nm olarak sabitlenir.</li>
	<li>1 mL HEPES tampon 2'deki LUV'ları kuvars floresan cuvette 100 μM'lik son konsantrasyona seyreltin. Deney sırasında çözeltiyi homojenize etmek için manyetik bir karıştırıcı ekleyin.</li>
	<li>Arka plan floresanlarına erişmek için luv'ları ilk 100 s boyunca t = 0 s ve t = 99 s arasında tek başına ölçün. NOT: Arka plan floresan ve potansiyel sızıntılara erişmek için tüm deney sırasında (15 dk) tek başına LUV'lar da ölçülebilir.</li>
	<li>Bundan sonra, sızıntıyı, sonraki 900 s (15 dk) için peptit çözeltisinin aliquotlarının eklenmesi üzerine floresan yoğunluğunda bir artış olarak ölçün. Bu protokol, 0,1 μM ila 2,5 μM arasında test edilen her peptit konsantrasyonu için gerçekleştirilir.</li>
	<li>Son olarak, 1 μL Triton X-100 (%0,1, v/v) eklenerek LUV'ların çözünmesiyle %100 floresan elde edildi ve bu da t = 1.000 s ile t = 1.100 s arasında tamamen söndürülmemiş prob ile sonuçlandı.</li>
</ol>7. Sızıntının nicelleştirilmesi
<ol><li>Test edilen her koşul için aynı sayıda noktayı korumak için t = 1.090 sn'den sonra elde edilen değerleri bastırın.</li>
	<li>T = 0 s ve t = 49 s (yalnızca LUV'lar) arasında ortalama 50 puan yaparak minimum floresan, Fdk'yı hesaplayın.</li>
	<li>T = 1.041 s ve t = 1.090 s (Triton X-100 ile LUV'lar) arasında ortalama 50 puan yaparak maksimum floresan, Fmaks.</li>
	<li>Aşağıdaki denkleme göre, her zaman noktasında (t = x) sızıntı yüzdesini (%Sızıntı) hesaplayın: %Sızıntı(t=x) = (F(t=x) - Fdk) / (Fmaks . - Fdk) x 100</li>
	<li>Aynı koşul için farklı LUV hazırlığı (n ≥ 2) ile elde edilen değerler için ortalama ve standart sapmayı hesaplayın.</li>
	<li>%Leak(t=x)sızıntı yüzdesini zaman (lar) işlevinde çizin.</li>
</ol>

<ol><li>Langel, U. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLangel%2C+U+%22Handbook+of+Cell-Penetrating+Peptides%22">Handbook of Cell-Penetrating Peptides</a>. , CRC Press. (2006).</li>
<li>Deshayes, S., Morris, M. C., Divita, G., Heitz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptides%3A+tools+for+intracellular+delivery+of+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences+CMLS%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptides: tools for intracellular delivery of therapeutics.</a> Cellular and Molecular Life Sciences CMLS. 62 (16), 1839-1849 (2005).</li>
<li>Richard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptides.+A+reevaluation+of+the+mechanism+of+cellular+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptides. A reevaluation of the mechanism of cellular uptake.</a> The Journal of Biological Chemistry. , (2003).</li>
<li>Jones, A., Sayers, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+entry+of+cell+penetrating+peptides%3A+tales+of+tails+wagging+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release+Official+Journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Cell entry of cell penetrating peptides: tales of tails wagging dogs.</a> Journal of Controlled Release Official Journal of the Controlled Release Society. , (2012).</li>
<li>Tünnemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+analysis+of+cell+penetration+ability+and+toxicity+of+oligo-arginines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Peptide+Science%22%5BJournal%5D)">Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines.</a> Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).</li>
<li>Jiao, C. -Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+and+endocytosis+for+cell-penetrating+peptide+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Translocation and endocytosis for cell-penetrating peptide internalization.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (49), 33957-33965 (2009).</li>
<li>Deshayes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+internalization+mechanism+of+WRAP%3AsiRNA+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta.+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Deciphering the internalization mechanism of WRAP:siRNA nanoparticles.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1862 (6), 183252(2020).</li>
<li>Konate, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+vectorisation+property%3A+A+comparative+study+for+a+secondary+amphipathic+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Optimisation of vectorisation property: A comparative study for a secondary amphipathic peptide.</a> International Journal of Pharmaceutics. 509 (1-2), 71-84 (2016).</li>
<li>Lehto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+trafficking+determines+the+exon+skipping+activity+of+Pip6a-PMO+in+mdx+skeletal+and+cardiac+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular trafficking determines the exon skipping activity of Pip6a-PMO in mdx skeletal and cardiac muscle cells.</a> Nucleic Acids Research. 42 (5), 3207-3217 (2014).</li>
<li>Hoyer, J., Neundorf, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+vectors+for+the+nonviral+delivery+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Peptide vectors for the nonviral delivery of nucleic acids.</a> Accounts of Chemical Research. 45 (7), 1048-1056 (2012).</li>
<li>Milletti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-penetrating+peptides%3A+classes%2C+origin%2C+and+current+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape.</a> Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).</li>
<li>Mueller, J., Kretzschmar, I., Volkmer, R., Boisguerin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cellular+uptake+using+22+CPPs+in+4+different+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Comparison of cellular uptake using 22 CPPs in 4 different cell lines.</a> Bioconjugate Chemistry. 19 (12), 2363-2374 (2008).</li>
<li>Ramaker, K., Henkel, M., Krause, T., Röckendorf, N., Frey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+penetrating+peptides%3A+a+comparative+transport+analysis+for+474+sequence+motifs%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Cell penetrating peptides: a comparative transport analysis for 474 sequence motifs.</a> Drug Delivery. 25 (1), 928-937 (2018).</li>
<li>Maget-Dana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+monolayer+technique%3A+a+potent+tool+for+studying+the+interfacial+properties+of+antimicrobial+and+membrane-lytic+peptides+and+their+interactions+with+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The monolayer technique: a potent tool for studying the interfacial properties of antimicrobial and membrane-lytic peptides and their interactions with lipid membranes.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1462 (1-2), 109-140 (1999).</li>
<li>Alves, A. C., Ribeiro, D., Nunes, C., Reis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysics+in+cancer%3A+The+relevance+of+drug-membrane+interaction+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Biophysics in cancer: The relevance of drug-membrane interaction studies.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1858 (9), 2231-2244 (2016).</li>
<li>Konate, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-based+nanoparticles+to+rapidly+and+efficiently+%22Wrap+%27n+Roll%22+siRNA+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Peptide-based nanoparticles to rapidly and efficiently "Wrap 'n Roll" siRNA into cells.</a> Bioconjugate Chemistry. 30 (3), 592-603 (2019).</li>
<li>Seisel, Q., Pelletier, F., Deshayes, S., Boisguerin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+evaluate+the+cellular+uptake+of+CPPs+with+fluorescence+techniques%3A+Dissecting+methodological+pitfalls+associated+to+tryptophan-rich+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta.+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">How to evaluate the cellular uptake of CPPs with fluorescence techniques: Dissecting methodological pitfalls associated to tryptophan-rich peptides.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. Biomembranes. 1861 (9), 1533-1545 (2019).</li>
<li>Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+helix+of+the+Antennapedia+homeodomain+translocates+through+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (14), 10444-10450 (1994).</li>
<li>Takayama, M., Itoh, S., Nagasaki, T., Tanimizu, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+enzymatic+method+for+determination+of+serum+choline-containing+phospholipids%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%3B+International+Journal+of+Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A new enzymatic method for determination of serum choline-containing phospholipids.</a> Clinica Chimica Acta; International Journal of Clinical Chemistry. 79 (1), 93-98 (1977).</li>
<li>Notman, R., Noro, M., O'Malley, B., Anwar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+Dimethylsulfoxide+%28DMSO%29+action+on+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for Dimethylsulfoxide (DMSO) action on lipid membranes.</a> Journal of the American Chemical Society. 128 (43), 13982-13983 (2006).</li>
<li>Konate, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+cellular+uptake+mechanism+of+a+secondary+amphipathic+cell-penetrating+peptide+for+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Insight into the cellular uptake mechanism of a secondary amphipathic cell-penetrating peptide for siRNA delivery.</a> Biochemistry. 49 (16), 3393-3402 (2010).</li>
<li>Vaissière, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+retro-inverso+cell-penetrating+peptide+for+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">A retro-inverso cell-penetrating peptide for siRNA delivery.</a> Journal of Nanobiotechnology. 15 (1), 34(2017).</li>
<li>Eiríksdóttir, E., Konate, K., Langel, Ü, Divita, G., Deshayes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secondary+structure+of+cell-penetrating+peptides+controls+membrane+interaction+and+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Secondary structure of cell-penetrating peptides controls membrane interaction and insertion.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798 (6), 1119-1128 (2010).</li>
<li>Ziegler, A., Li Blatter, X., Seelig, A., Seelig, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+transduction+domains+of+HIV-1+and+SIV+TAT+interact+with+charged+lipid+vesicles.+Binding+mechanism+and+thermodynamic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein transduction domains of HIV-1 and SIV TAT interact with charged lipid vesicles. Binding mechanism and thermodynamic analysis.</a> Biochemistry. 42 (30), 9185-9194 (2003).</li>
<li>Thorén, P. E. G., Persson, D., Karlsson, M., Nordén, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Antennapedia+peptide+penetratin+translocates+across+lipid+bilayers+-+the+first+direct+observation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The Antennapedia peptide penetratin translocates across lipid bilayers - the first direct observation.</a> FEBS Letters. 482 (3), 265-268 (2000).</li>
<li>Mishra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+HIV+TAT+peptide+and+analogues+induced+by+multiplexed+membrane+and+cytoskeletal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Translocation of HIV TAT peptide and analogues induced by multiplexed membrane and cytoskeletal interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (41), 16883-16888 (2011).</li>
<li>Rouser, G., Fleischer, S., Yamamoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+dimensional+thin+layer+chromatographic+separation+of+polar+lipids+and+determination+of+phospholipids+by+phosphorus+analysis+of+spots%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">Two dimensional thin layer chromatographic separation of polar lipids and determination of phospholipids by phosphorus analysis of spots.</a> Lipids. 5 (5), 494-496 (1970).</li>
<li>Bartlett, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorus+assay+in+column+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphorus assay in column chromatography.</a> Journal of Biological Chemistry. 234 (3), 466-468 (1959).</li>
<li>Stewart, J. C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+determination+of+phospholipids+with+ammonium+ferrothiocyanate%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Colorimetric determination of phospholipids with ammonium ferrothiocyanate.</a> Analytical Biochemistry. 104 (1), 10-14 (1980).</li>
<li>Spinella, S. A., Nelson, R. B., Elmore, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+peptide+translocation+into+large+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (59), e3571(2012).</li>
<li>Wimley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+the+effects+of+membrane-interacting+peptides+on+membrane+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell-Penetrating+Peptides%22%5BJournal%5D)">Determining the effects of membrane-interacting peptides on membrane integrity.</a> Cell-Penetrating Peptides. 1324, 89-106 (2015).</li>
<li>Bárány-Wallje, E., Gaur, J., Lundberg, P., Langel, U., Gräslund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+membrane+perturbation+caused+by+the+cell+penetrating+peptide+Tp10+depending+on+attached+cargo%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Differential membrane perturbation caused by the cell penetrating peptide Tp10 depending on attached cargo.</a> FEBS Letters. 581 (13), 2389-2393 (2007).</li>
<li>van Rooijen, B. D., Claessens, M. M. A. E., Subramaniam, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+permeabilization+by+oligomeric+%CE%B1-Synuclein%3A+in+search+of+the+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Membrane permeabilization by oligomeric α-Synuclein: in search of the mechanism.</a> PloS One. 5 (12), 14292(2010).</li>
<li>Hassane, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+cellular+trafficking+of+splice+redirecting+oligonucleotides+complexed+with+chemically+modified+cell-penetrating+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%3A+Official+Journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Insights into the cellular trafficking of splice redirecting oligonucleotides complexed with chemically modified cell-penetrating peptides.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 153 (2), 163-172 (2011).</li>
<li>Asciolla, J. J., Renault, T. T., Chipuk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examining+BCL-2+family+function+with+large+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Examining BCL-2 family function with large unilamellar vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4291(2012).</li>
<li>Grewer, C., Gameiro, A., Mager, T., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+characterization+of+membrane+transport+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological characterization of membrane transport proteins.</a> Annual Review of Biophysics. 42 (1), 95-120 (2013).</li>
</ol>

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Sunulan floresan sızıntı tahlili, hücreye nüfuz eden peptit ile membran dengesinin bozulmasını gidermek için basit ve hızlı bir yöntemdir. Yapması kolay, aynı zamanda farklı membran etkileşimi olan peptitler veya diğer membran etkileşimi molekülleri arasında dolaylı bir karşılaştırma sağlar. Protokolün kritik adımlarıyla ilgili olarak, bu test taban çizgisi (tek başına LUV'lar) ve maksimum floresan salınımı (Triton durumu) arasında göreceli değerler sağladığından, genellikle LUV'lerin konsantrasyonu, yalnızca LUV'lerin k...

Doksanlı yıllardaki keşiflerinden sonra, plazma membran 1,2aracılığıyla kargoların verimli bir hücresel teslimatını teşvik etmek için hücre nüfuz eden peptitler (CPP'ler) geliştirilmiştir. CPP'ler genellikle çok çeşitli kökenlere sahip, genellikle 8 ila 30 amino asit olan kısa peptitlerdir. İlk olarak "doğrudan translokasyon" taşıyıcıları olarak tanımlandılar, yani plazma zarını geçebildiler ve herhangi bir endositotik yoldan bağımsız olarak hücrelere bir yük aktarabildiler ne enerji gereksinimi ne de reseptör tutulumu. Bununla birlikte, daha fazla araştırma, bu ilk gözlemlerin esas olarak deneysel eser nedeniyle floresan aşırı tahmininden ve / veya metanol3kullanarak sabitleme protokollerinden geldiğini ortaya koydu. Günümüzde, CPP alımının, kargonun doğası, CPP ve kargo arasındaki kullanılanbağlantı,çalışılan hücre hattı vb.
CPP'ler, CPP ile kargosu 8 ,9,10,11arasında kimyasal bir bağlantı (kurevi strateji) veya elektrostatik/hidrofobik etkileşimler (kurda olmayan strateji) içeren iki stratejiye göre transfeksiyon ajanları olarak kullanılabilir. Her iki strateji de birkaç kargonun hücre transferinde verimliliklerini göstermiş olsa da, CPP'ler tarafından içselleştirme mekanizmasının anlaşılması hala tartışma altındadır ve endositoz yolları veya doğrudan penetrasyon arasındaki dengenin ölçülmesi hala zordur12,13. Endosit süreçlerin katılımını net bir şekilde ele almak için bir dizi deneysel araç ve strateji mevcut olsa da, plazma membran bileşenleriyle daha ayrı etkileşimler anlamına gelir, ancak doğrudan translokasyonun karakterize etmesi daha zor görünmektedir. Biyolojik membranlar genellikle fosfolipidlerden membran proteinlerine kadar hücresel tipe ve/veya ortama (stres koşulları, hücre bölünmesi vb.) göre değişebilen çok sayıda bileşenden oluşur. Bu kompozisyon çeşitliliği ve sonuç olarak evrensel bir hücresel membran modelinin bulunmaması çalışmaları tek bir şekilde etkinleştirmez. Bununla birlikte, bu sınırlamaları atlatmak için yapay membran veya membran özleri ile adım adım yaklaşımlar geliştirilmiştir. Küçük unilamellar vesicles monolayer yaklaşımlara kadar, her model açıkça belirli soruları cevaplamak için uygundu14,15. Bunlar arasında, büyük unilameller vesicles (LUVs), peptit / membran etkileşimlerini içselleştirme sürecinde önemli bir nokta olarak incelemek için uygun bir membran taklit modeli oluşturur.
Bu bağlamda, aşağıdaki protokolde hem aniyonik bir floresan boyanın hem de lipozomlarda kapsüllenmiş karşılık gelen poli-katyonik quencher'in izlenmesi yoluyla peptitlerin ve peptit/membran etkileşimlerinin LUVs bütünlüğü üzerindeki etkilerinin araştırılması açıklanmaktadır. Bu araç, doğrudan membran translokasyonu yapıp yapamayacaklarını anlamak için CPP / membran etkileşimlerini incelemek için kullanılır. Genellikle farklı membran etkileşimli peptitleri karşılaştırmak için uygulansa da, bu LUV floresan sızıntı tahlili hem CPP-kargo konjugelerini (kurcalama stratejisi) hem de CPP:cargo komplekslerini (kurvalent olmayan strateji) araştırmak için de kullanılabilir.
Bu nedenle mevcut protokol ilk olarak yakın zamanda geliştirilen triptofan (W) ve arginin (R)- zengin Amfipatik Peptitler (WRAP)16ile örneklenecektir. WRAP, birkaç hücre hattında hızlı ve verimli bir şekilde küçük müdahale RNA 'sı (siRNA) sunmak için peptit bazlı nanopartiküller oluşturabilir16. Wrap peptidinin floresan sızıntı özellikleri tek başına veya siRNA yüklü WRAP bazlı nanopartiküller hücresel içselleştirme mekanizmalarını karakterize etmek için izlendi. İçselleştirme mekanizmalarının esas olarak doğrudan translokasyon içerdiğini gösterdik7. İkinci bir örnekte, WRAP peptidi protein/proteine müdahale eden peptit iCAL36 (WRAP-iCAL36)17'ye eş zamanlı olarak konjuge edildi ve membranların dengesini bozma yeteneği, başka bir CPP olan Penetratin18 (Penetratin-iCAL36) ile birleştirilen iCAL36'ya floresan sızıntısı testinde karşılaştırıldı.
Son olarak, yöntemin avantajları ve sınırlamaları hem teknolojik açıdan hem de biyolojik alaka açısından tartışılacaktır.

<table><tbody><tr><td>25 mL cam yuvarlak tabanlı şişe</td><td>Pyrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8-aminonaftalin-1, 3, 6-trisülfonik asit, disodyum tuzu (ANTS)</td><td>Invitrogen</td><td>A350</td><td>Işıktan koruyun&nbsp;</td></tr><tr><td>Kloroform&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>Kolesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>DOPC (dioleoilfosfatidilkolin)</td><td>Avanti Polar</td><td>850375P</td><td>Havadan koruyun</td></tr><tr><td>Ekstruder</td><td>Avanti Polar</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Florimetre</td><td>PTI Serlabo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 &mikro; L cam şırınga</td><td>Hamilton</td><td>705N</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>LabAssay Fosfolipid ve nbsp;</td><td>WAKO&nbsp;</td><td>296-63801</td><td></td></tr><tr><td>sıvı kromatografi kolonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Carlo Erba</td><td>414902</td><td></td></tr><tr><td>Çekirdek polikarbonat membran (0.1 & mikro; m gözenek boyutu, 25 mm çap)</td><td>Whatman</td><td>800309</td><td></td></tr><tr><td>polistiren küvet, 10 x 10 x 45 mm</td><td>Grener Bio-One</td><td>614101</td><td></td></tr><tr><td>polistiren yarı mikro küvet, DLS</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB55924</td><td></td></tr><tr><td>p-ksilen-bispiridinyum bromür (DPX)</td><td>Invitrogen</td><td>X1525</td><td>Işıktan koruyun&nbsp;</td></tr><tr><td>kuvars floresan küvet</td><td>Hellma</td><td>109.004F-QS</td><td></td></tr><tr><td>rotavapor sistemi&nbsp;</td><td>Heidolph</td><td>Z334898</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50 reçine</td><td>Amersham</td><td>17-0042-01</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum azid (NaN3)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorid (NaCl)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Sonikatör banyosu USC300T</td><td>VWR</td><td>142-6001</td><td></td></tr><tr><td>Sphingomyelin</td><td>Avanti Polar</td><td>860062P</td><td>Havadan koruyun</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp;</td><td>Eromedex</td><td>2000-B</td><td></td></tr><tr><td>Zetaziser NanoZS&nbsp;</td><td>Malvern</td><td>ZEN3500</td><td></td></tr></tbody></table>

hücre delici peptit ile membran dengesizleşmesini araştırmak için floresan sızıntı tahlil

Fluorescent Leakage Assay to Investigate Membrane Destabilization by Cell-Penetrating Peptide

Hücreye nüfuz eden peptitler (CPP'ler), plazma zarını geçebilen ve bir kargoyu hücrelere aktarabilen taşıyıcılar olarak tanımlanır. Bu aktivite için gerekli olan temel ortak özelliklerden biri, CPP'lerin plazma membranı (lipitler) ve daha çok membranın hücre dışı matrisinin bileşenleri (heparan sülfat) ile etkileşimlerinden kaynaklanandır. Nitekim, doğrudan translokasyon veya endositoza bağımlı içselleştirmeden bağımsız olarak, lipid bilayerleri hem plazma zarı seviyesinde hem de hücre içi trafik (endosomal veziküller) düzeyinde içselleştirme sürecine dahil olurlar. Bu yazıda, olası CPP-membran dengesizliğini/etkileşimini tespit etmek ve içselleştirme mekanizmasındaki rollerini ele almak için floresan sızıntı testinde büyük bir unilamellar veziküllerin (LUV' ler) formülasyonu, saflaştırılması, karakterizasyonu ve uygulamasının farklı adımlarını açıklayan ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Plazma membran içeriğini yansıtan lipid bileşimine sahip LUV'lar, hem floresan boyayı hem de bir quencher'ı kapsüllemek için üretilir. Ekstravesiküler ortamda peptitlerin eklenmesi ve OV'ler üzerinde peptit-membran etkileşimlerinin indüksiyonu, böylece bir sızıntıyı ortaya çıkaran floresanlarda doza bağlı bir şekilde önemli bir artışa neden olabilir. Örnekler burada, çeşitli hücre hatlarında hızlı ve verimli bir siRNA teslimatı gösteren yakın zamanda geliştirilen triptofan (W) ve arginin (R) zengin Amfipatik Peptitler (WRAP'ler) ile sağlanmaktadır. Son olarak, bu etkileşimlerin doğası ve lipitlere olan yakınlık, membran translokasyonunu ve/veya endosomal kaçışı anlamak ve iyileştirmek için tartışılır.

Floresan kaçak tahlili prensibi Şekil 1'de gösterilmiştir. Ayrıntılı olarak, floresan bir boyayı ve bir quencher'ı (floresan sinyali yok) kapsülleyen büyük unilameller vesicles (LUV'lar) ilgi çekici biyomolekül ile tedavi edilir. Peptidin lipid zarları ile etkileşimi nedeniyle, membran geçirgenliği, yeniden yapılanma ve hatta yırtılma anlamına gelebilir, floresan boyası ve quencher LUV'lardan salınır. Tampondaki sonraki seyreltmeler floresan sinyalinin artmas...

Floresan sızıntı tahlili, peptit/membran etkileşimlerinin araştırılmasını sağlayan basit bir yöntemdir, böylece çeşitli biyolojik süreçlere dahil olmaları ve özellikle hücre nüfuz eden peptitlerin doğrudan hücresel translokasyon işlemi sırasında fosfolipid bilayerleri rahatsız etme yeteneği.

Hücre Delici Peptit ile Membran Dengesizleşmesini Araştırmak için Floresan Sızıntı Tahlil

Cell-penetrating peptides (CPPs) are defined as carriers that are able to cross the plasma membrane and to transfer a cargo into cells. One of the main ...

Bu floresan sızıntısı testi, biyomoleküller yoluyla membran destabilitesini ele almak için basit bir yöntemdir. Lipozomlar kapsüllenmiş floresan boyalar kullanılarak, farklı zarların etkileşime giren peptitleri karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu yöntem, hücresel içselleştirme mekanizmasını anlamak ve doğrudan membran translokasyonuna katılımlarını değerlendirmek için hücreye nüfuz eden peptitler tarafından membran destabilizasyonunu araştırmak için özellikle yararlıdır.Biyolojik zarlarla karşılaştırıldığında, lipozomlar, plazma, endozomal veya mitokondriyal zarlar gibi farklı lipid değerlerini taklit etmek için fosfolipid bileşiminin kontrolünü sağlar. LUV'leri bir floresan sızıntı testi için hücre zarı taklitçisi olarak kullanımlarına hazırlamak için, fosfatidilkolin, sfingomyelin ve kolesterolü 4: 4: 2 molar oranında karıştırmak için bir Hamilton cam şırınga kullanın. Metanol kloroformu, kurumuş bir lipit filmi oluşana kadar 60 santigrat derecede 46 ila 50 dakika vakum altında buharlaştırmak için döner bir buharlaştırıcı kullanın.Çok katmanlı vezikülleri yeniden oluşturmak için, kurutulmuş lipit filmi bir mililitre lipit hidrasyon çözeltisi ile yeniden süspanse edin ve kurumuş lipit filmi eriyene kadar iyice girdaplayın. Lipidin tamamının dahil edildiğini ve şişenin kenarlarında herhangi bir film kalmadığını onayladıktan sonra, vezikülleri sıvı nitrojen içinde 30 saniye ve döngü başına 30 derecelik bir su banyosunda iki dakika boyunca beş kez dondurun ve çözün. Lipid ekstrüder hazırlamak için, metal ekstrüder teneke kutu içindeki her bir PTFE ekstrüder parçasına iki adet HEPES tampon işlem görmüş filtre desteği yerleştirin ve bir filtre desteğinin üstüne 0.1 mikron gözenekli bir HEPES nemlendirilmiş polikarbonat membran yerleştirin.İki metal ekstrüder bidonunu birbirine vidalayın ve monte edilmiş ekstrüderi tutucuya yerleştirin. Ekstrüderde sızıntı veya başka problemler olup olmadığını kontrol etmek için, PTFE ekstrüder parçasının bir ucundaki uygun deliğe boş bir mililitrelik şırınga ve diğer ekstremitede bir mililitre HEPES tamponu yüklü başka bir mililitrelik şırınga sokun, ardından çok katmanlı vezikül numunesini aynı şekilde ekstrüdere verin ve numuneyi bir şırıngadan diğerine polikarbonat membrandan en az 21 kez itin. tek tip LUV'ler edinin. LUV'leri saflaştırmak için, yeni ekstrüde edilmiş LUV'leri bir sıvı kromatografi kolonuna ekleyin ve veziküllerin çapraz bağlı dekstran jele girmesine izin verin.Sütuna sürekli olarak HEPES tamponu iki ekleyin ve yaklaşık iki mililitre HEPES tamponu iki'yi çıkarmaya başlayın. Serbest sarı ANTS ve DPX çözeltisi, lipozomlardan daha yavaş göç edecektir. Bir mililitre ayrıştırıldıktan sonra, saflaştırılmış LUV'leri 1,5 mililitrelik tüplerde toplamaya başlayın.Eluent damlaları yanardöner hale geldiğinde, LUV içeren fraksiyonu geri kazanmak için tüpü değiştirin. Damlalar artık yanardöner olmadığında, elüsyonu durdurmadan önce ayrı bir fraksiyonda 500 mikrolitre daha elüte edin. LUV boyutunu ve polidispersite indeksini belirlemek için, deneyde kullanılacak polistiren yarı mikro küvet ve dinamik ışık saçılma sistemindeki çözücünün viskozitesini belirtin ve küvete 500 mikrolitre LUV çözeltisi ekleyin, ardından küveti cihaza yükleyin ve partikül dağılımının ortalama boyutu ve homojenlik açısından boyut dağılımını ölçün.Floresan sızıntısını ölçmek için, LUV'leri bir mililitre HEPES tamponu içinde, ikinci kez bir kuvars floresan küvetinde 100 mikromolar nihai konsantrasyona seyreltin ve deney sırasında çözeltinin homojenizasyonunu kolaylaştırmak için manyetik bir karıştırıcı ekleyin. Sonraki 100 saniye boyunca peptit çözeltisinin alikotlarının eklenmesi üzerine floresan yoğunluğunda bir artış olarak sızıntıyı ölçmeden önce arka plan floresansını değerlendirmek için ilk 900 saniye boyunca LUV'leri tek başına ölçün. Pozitif bir kontrol olarak %100 çiçeklenme sızıntısını ölçmek için, vezikülleri çözündürmek için LUV'lere bir mikrolitre Triton X-100 ekleyin, bu da analizin son 100 saniyesinde probun tamamen sönmesine neden olur.Ardından, her bir zaman noktasındaki sızıntı yüzdesini hesaplamak için formülü kullanın. Peptitlerin yokluğunda, LUV'lerden floresan sızıntısı gözlenmez. LUV'lere WRAP eklenmesi, floresansta önemli bir artışa neden olarak önemli bir LUV sızıntısı ve ANTS salınımını ortaya çıkarır.15 dakika sonra, Triton pozitif kontrolüne kıyasla 2.5 mikromolar WRAP varlığında yaklaşık% 67'lik bir sızıntı elde edilir. Buna karşılık, WRAP, peptit bazlı nanopartiküller oluşturmak için küçük enterferans yapan RNA ile aynı konsantrasyonda birleştirildiğinde, sızıntı serbest peptit ile karşılaştırıldığında 1.5 kat daha zayıftır. Konjuge Penetratin-iCAL peptit kullanıldığında, önemli bir floresan artışı tespit edilmezken, WRAP-iCAL peptit ilavesi, aynı 2.5 mikromolar konsantrasyonda çok güçlü floresan sinyali ile karakterize edilen net bir sızıntıya neden olur.Bu sonuçlar, floresan sızıntı testinin, bazı hücreye nüfuz eden peptitlerin, az ya da çok belirgin bir zar geçirgenliğine yol açan peptit zarı etkileşimlerini gerçekleştirme yeteneğini ortaya çıkarmak için kullanılabileceğini göstermektedir. Bu yöntem, hücreye nüfuz eden peptitlerin veya fotojenik veya antimikrobiyal peptitler gibi diğer zar aktif peptitlerin içselleştirme mekanizmasını deşifre etmek için zar peptitlerinin kararsızlaşmasına yol açan etkileşimlerin hızlı bir şekilde tanımlanmasını destekler. Sızıntı indüksiyonu olmadan peptit-lipid etkileşimi durumunda, triptofan floresan deneyleri gibi diğer yaklaşımlar gereklidir.Bu floresan sızıntı testi, CPP alanında yaygın olarak kullanılmaktadır ve hücre translokasyonu veya endozomal kaçış hakkında önemli bilgiler sağlayabilir.

fluorescent-leakage-assay-to-investigate-membrane-destabilization

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu protokol, büyük unilamellar lipid veziküller içine peptid translokasyonu kantitatif ölçmek için bir yöntem. Bu yöntem ayrıca membran translokasyon oranı hakkında bilgi sağlar ve çift katlı lipit katmanını etkin ve kendiliğinden geçtiğini peptidler tanımlamak için kullanılabilir.

Büyük Unilamellar Veziküller Ölçme Peptid Translokasyon

Bu rapor yüzey ekspresyonu, ulaşım yolları ve dışsal olarak ifade edilen, pH-duyarlı GFP-etiketli nöronların plazma membran proteinlerinin kaçakçılığı kinetik belirlemek için canlı hücre görüntüleme ve photobleach tekniklerinin kullanımı anlatılmaktadır.

Kültür Nöronlar Membran Proteinlerin Yanal Difüzyon ve ekzositoz Floresans Kurtarma ve Floresans kaybı Photobleaching kullanarak Değerlendirilen

Bu videoda, transfekte edilmiş memeli hücrelerinin çekirdeğinde eksprese edilen floresan etiketli yanlış katlanmış lusiferaz mutant proteinin bozunma kinetiğini incelemek için in vitro floresan bazlı bir mikroplaka testi açıklanmaktadır. Test, yanlış katlanmış proteinin proteazom aracılı bozunmasını değerlendirmek için floresan mutant proteini eksprese eden hücrelerin bir translasyon inhibitörü ve bir proteazom inhibitörü ile işlenmesini içerir.

Floresan Mikroplaka Bazlı Sikloheksimid Takip Testi: Floresan Nükleer Yanlış Katlanmış Proteinlerin Bozunma Kinetiğini İzlemek İçin Bir Teknik

Bu videoda, hücre zarı taklitleri (büyük unilamellar veziküller veya LUV'ler, bir floresan boya ve bir söndürücü ile kapsüllenmiş) kullanarak hücreye nüfuz eden peptitlerin hücre zarlarıyla etkileşimlerini incelemek için floresan sızıntı testi tartışılmaktadır.

Membran ile Hücreye Nüfuz Eden Peptit Etkileşimini İncelemek için Floresan Sızıntı Testi

Bu video, memeli hücrelerinde plazma zarının yeniden kapatılma verimliliğini incelemek için bir testi göstermektedir. Hücreler, hücre zarında gözenekler oluşturan bakteriyel gözenek oluşturan bir toksine maruz kalır. Hücre dışı kalsiyum iyonlarının varlığında, gözenek kalsiyum akışına neden olur ve zarın yeniden kapanması olaylarına neden olur. Yeniden mühürleme verimliliği, hücrelere yalnızca yeniden kapatılmış bir zar olmadan giren DNA bağlayıcı propidyum iyodür boyası kullanılarak...

Plazma Membranının Yeniden Sızdırmazlık Verimliliğini Ölçmek için İn Vitro Floresan Bazlı Bir Test

Yeşil floresan proteini füzyon göre, Escherichia coli içinde rekombinant zar proteinlerinin ifadesi için tarama için bir aerodinamik bir yaklaşım sunulmuştur.

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

Burada, canlı hücrelerdeki integral zar proteinlerinin oryantasyonunu ve topolojisini belirlemek için bir protokol sunuyoruz. Bu basit protokol, ilgilenilen protein ile GFP arasındaki kimeraların seçici proteaz duyarlılığına dayanır.

Floresan Proteaz Koruma Kullanma Membran Protein topolojisini belirlenmesi (FPP)

Opsin ile sulandırılmış büyük unilameller lipozomlarda fosfolipid karıştırmayı ölçmek için floresan bazlı bir test tarif ediyoruz.

Fosfolipid Scramblase Aktivitesinin bir floresan bazlı analiz

Hücre zarının iki fotonlu lazer ile yaralama membran yeniden mühürlemeden yeteneği değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir ve birden çok hücre türü için uygulanabilir. Burada, vitro canlı İki fotonlu lazer ablasyon takip dysferlinopathy hasta hücrelerde membran yeniden mühürleme, görüntüleme için bir protokol açıklayın.

İki fotonlu lazer mikroskop kullanarak hücre zarı tamir tahlil

Burada biz verimliliği Fluorometrik ve görüntüleme analizleri canlı hücreler aracılığıyla yeniden mühürlemeden plazma zarı ölçer yüksek üretilen iş floresans tabanlı bir tahlil tanımlamak. Bu tahlil uyuşturucu ya da plazma zarı memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden düzenleyen hedef genlerin eleme için kullanılabilir.

Plazma zarı verimliliği memeli hücrelerinde yeniden mühürlemeden yüksek üretilen iş ölçümü

Lipozomal membran geçirgenliğini değerlendirmek için geleneksel tekniklere göre üstün hassasiyet ve çözünürlükle uygun maliyetli bir yöntem sunuyoruz. Yeni bir kapsüllenmiş ligand ikame reaksiyonu kullanan bu teknik, model membranlarda fosfolipaz A2 ile indüklenen değişiklikleri tespit eder. Standart analizlerle kolayca entegre edilen bu erişilebilir yaklaşım, membran biyofiziği ve toksin etkileşimlerini incelemek için çözünürlüğü artırır.

Fosfatidilinositol Fosfat Gruplarının Venom PLA2'nin Membranotropik Etkisi Üzerindeki Etkilerini Araştırmak için Bir Lipozom Membran Geçirgenlik Testi

Öğrenin, hücre delici peptitlerin membran dengesizleştirme mekanizmalarını floresan sızıntı tahlili ile nasıl araştırılacağını. Bu yöntem, lipozomlar ve floresan boyalar kullanarak hücre içine alım süreçlerini anlamanıza yardımcı olur.

Hücre Delici Peptit ile Membran Dengesizleşmesini Araştırmak için Floresan Sızıntı Tahlil

Daha fazla video keşfet