Moleküler Bileşiklerin Hücrelere Daha İyi Teslimi İçin Akostofluidik Bir Cihazın Montajı ve çalışması

Bu protokol, çeşitli araştırma ve hücre tabanlı terapötik uygulamalar için biyomolekülleri verimli bir şekilde sunabilen akostofluidik bir sistemin montajını ve çalışmasını açıklar. Bu sistemin en büyük avantajı, biyomoleküllerin canlılıklarını korurken hücrelere hızlı bir şekilde ulaştırılmasını sağlar. Kanser tedavisi gibi çeşitli hücresel terapötik uygulamalar için hücrelerin dönüştürülmesini sağlayan bir platform teknolojisidir.

Bir fincanda 54 gram PDMS tabanı ve altı gram kür maddesini birleştirerek başlayın. En az bir dakika boyunca bir spatula ile kuvvetlice ve iyice karıştırın, ardından PDMS çözeltisi ile fincanı yaklaşık 30 dakika boyunca veya kalıntı hava kabarcıkları çıkarılana kadar bir kurutucuya yerleştirin. 150 milimetrelik petri kabına yukarı bakacak desenli fotoresist kaplı bir gofret yerleştirin, ardından PDMS çözeltisini kalıbın üzerine dökün.

Gerekirse, Petri kabını bir kurutucunun içine yerleştirin ve kalıntı hava kabarcıkları kaybolana kadar vakum uygulayın. Petri kabını bir laboratuvar fırınına aktarın ve PDMS'yi iyileştirmek için 60 santigrat derecede iki saat pişirin. Kürlemeden sonra, gofretin kenarlarını jiletle keserek PDMS'yi Petri kabından dikkatlice çıkarın.

Her bir cihazı bir bıçak veya jilet kullanarak kesin, ardından 2,5 milimetrelik biyopsi zımbası kullanarak giriş ve çıkış bağlantı noktalarında delikler açın. PDMS cihazını oksijen plazması ile tedavi ettikten sonra, her cihazı derhal cam yüzeye bakan kanallarla temiz bir soda kireç cam mikroskop kaydırağı üzerine yerleştirin. Cihazların oda sıcaklığında gece boyunca bağlanmasına izin verin.

Bir santimetre çapındaki piezo dönüştürücünün yüzeyine bir ila iki milimetre kalınlığında silikon uygulayın, ardından dönüştürücüsü eşmerkezli bir spiralle dikkatlice hizalayın ve cam mikroskop slaytının altına hafifçe bastırın. USB A-B kablosu kullanarak bir mikrodenetleyiciyi bilgisayara bağlayın. Yeşil güç LED göstergeleri yanmalıdır.

Sekiz megahertz sinyal üreten bir program yüklemek için bilgisayardaki ilişkili yazılımı kullanın. PZT dönüştürücüserdeki her telin sonuna bir inç 22 kalibrelik bir tel lehimleyin. Ardından, PZT dönüştürücüslerinin negatif terminal telini bir GND pimine bağlamak için kullanın.

PZT dönüştürücünün pozitif terminal telini lehimli tel aracılığıyla çıkış pimine bağlayın. Tygon PVC yumuşak plastik borunun üç ila altı inç bölümlerini kesin ve boruyu giriş ve çıkış bağlantı noktalarına itin. Açıklığa oturana kadar basınç uygularken boruyu döndürmek gerekebilir.

İsteğe bağlı olarak, PDMS ve boruyu birbirine yapıştırmak için kavşakta tutkal uygulanabilir. İsteğe bağlı olarak, akostofluidik cihazı ve mikrodenetleyiciyi 3D baskılı bir kasaya monte edin. Mikroakışkan rezervuarı üreticinin talimatlarına göre monte edin.

1/16 inç iç çaplı tygon PVC yumuşak plastik borunun üç ila altı inçlik bir bölümünü kesin ve mikroakışkan rezervuar çıkışından 1/32 inç iç çaplı borunun üzerine itin. İsteğe bağlı olarak, sızıntıyı önlemek için kavşağı parafin filmi ile sarın. Mikroakışkan rezervuarın yan tarafında 60 mililitrelik bir şırıngayı ortam havasıyla doldurun.

Kontrast madde çözümlerini akostofluidik cihazdan saatte 50 mililitre hacimsel akış hızında itmek ve cihazın çıkışından alınan numuneleri 50 mililitre santrifüj tüpüne toplamak için şırınna pompasını saatte 200 mililitre hıza ayarlayın. 25 miligram DSPC, 11,6 miligram DSEPC, 0,26 miligram DSPG ve 0,88 miligram polioksitililen40 stearat ekleyerek 20 mililitrelik bir scintillation şişesinde bir phopholipid çözeltisi hazırlayın. Tüm fosfolipidler çözülene kadar kloroform ekleyin.

Kuru bir lipit filmi oluşturmak için 48 saat boyunca bir kurutucuda kloroform buharlaştır. Köpüğü 10 mililitre steril PBS ile yeniden sulayın, ardından lipid çözeltisini katyonik bir misel çözeltisi oluşturmak için% 40 genlikte üç dakika boyunca sonicate edin. Sonikasyondan sonra, phopholipid çözeltisi bir aya kadar iki ila altı santigrat derecede saklanabilir.

Ultrason kontrast ajanları hazırlamak için, iki mililitre cam septum şişesine 600 mikrolitre steril PBS'de 200 mikrolitre katyonik misel çözeltisi ekleyin. Kapağı kırparak şişeyi kapatın. Şişe kafası alanını 30 saniye boyunca kafeinsiz gazla doldurmak için 1,5 inç 20 kalibrelik bir iğne kullanın.

Şişeyi bir araya toplayarak perflorobütane gaz dolu ultrason kontrast ajanları oluşturur. Bir mililitre hücre çözeltisi başına 25 mikrolitre ultrason kontrast maddesi çözeltisi ekleyin. Ardından, birleşik kontrast maddesini ve hücre karışımını hemen akostofluidik cihaz üzerinden pompalayın.

Bu protokol, birden fazla hücre hattında hücre içi moleküler teslimatı geliştirmek için kullanılabilecek bir akostofluidik sistem üretir. Floresan bileşik floresan bir bileşiğin floresan olarak primer insan T hücrelerine intraselüler olarak verilmesi, tedavi edilmemiş bir kontrol grubuna kıyasla akostoflüidik tedavi ile iyileştirildi. T hücrelerinin floresan yoğunluğu tedaviden sonra beş kat artarak floresanin gelişmiş doğumunun arttığını gösterir.

Akoşofluidik bir tedaviden sonra hücre canlılığı biraz azaldı, ancak %80 Akostofluidik tedavinin üzerinde kaldı koruyucu bileşik trehalozun insan A549 akciğer karsinom hücrelerine tek başına akmasına ve tedavi edilmeyen kontrol grubundaki hücrelere karşı hücre içi doğumunu artırdı. Katyonik mikrobubbles hücre çözeltisine eklenmesi kritik öneme sahiptir. Biyomoleküllerin hücre içi teslimatı, çözeltideki katyonik mikrobubbles olmadan sınırlanacaktır.

Bu platform, araştırma veya terapötik amaçlar için hücresel işlevi değiştirebilen çeşitli biyomoleküllerin hücre içi teslimini sağlar. Bu prosedürü tamamladıktan sonra, çeşitli biyomoleküllerin tesliminin etkisini değerlendirmek için ek hücresel karakterizasyon yapılabilir.