Biyolojik Doku Örneklerinin Seri Blok-Yüz Tarama Elektron Mikroskopisi (SBF-SEM)

Seri blok yüz taramalı elektron mikroskopisi, üç boyutlu doku ultra yapılarının eşi görülmemiş bir görünümünü sağlar ve daha önce imkansız veya takip etmesi son derece zor olan bir dizi soruyu yanıtlayabilir. Bu teknik, minimum doku şarjı ve yapıtlarla üç boyutlu veri kümelerinin hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde üretilmesini sağlar. Ve daha da önemlisi, günlük binlerce görüntünün otomatik olarak yakalanmasını sağlar.

Standart iletim elektron mikroskopisi mükemmel hücresel ultra yapı sağlar. Ancak, bu görüntüler üç boyutlu bağlamdan yoksun ve yorumlanabilir. Seri blok yüz taramalı elektron mikroskopisi, karmaşık süreçlerin yorumlanmasını sağlayan üç boyutlu bağlam sağlar.

Bu protokol güvenilir ve tekrarlanabilir olsa da, belirli adımlar hassasiyet gerektirir ve bu metodolojinin başarısı için kritik öneme sahiptir. Bu video, bu kritik adımları ayrıntılı olarak gösterecektir. Örneklerin % 2,5 glutaraldehit ve iki milimoler kalsiyum klorür içeren 0,1 molar sodyum kakadot tamponunda sabitlendikten sonra, numuneler iki milimetreden daha büyük olmayan bloklar halinde kesilmeli ve iki milimoler kalsiyum klorür içeren 0,1 azı dişi sodyum kakadot tamponu ile yıkanmalıdır.

Doku daha sonra ardışık olarak osmiyum ferrosiyanid, tiyokarbohidrazid ve osmiyum tetroksit ile lekelenir. Osmiyum tetroksit inkübasyonundan sonra, dokuyu bir gecede dört santigrat derecede% 1 sulu uranil asetat ile tedavi edin. Ertesi sabah, 0.03 molar aspartik asit çözeltisinin 10 mililitresinde 0.066 gram kurşun nitratı çözün ve Walton'un kurşun aspartat çözeltisinin pH'ını 5.5'e ayarlamak için normal bir potasyum hidroksit kullanın.

Çözeltiyi fırında ısıttıktan sonra, dokuyu 60 santigrat dereceye aktarmadan önce oda sıcaklığında yıkama başına üç dakika boyunca beş kez yıkayın, çift damıtılmış su, Walton'un kurşun aspartat çözeltisini 60 santigrat derecede 30 dakika ısıttı. Kuluçkanın sonunda, dokuyu yıkayın ve yükselen, buz gibi bir aseton serisinde susuzlaştırın, ardından oda sıcaklığı asetonunda 10 dakikalık bir inkübasyon. Daha sonra dokuyu, dönen bir platformda dört saatlik bir infiltrasyon için asetonda 1:3 oranında sert karışık reçineye yerleştirin, ardından dönen bir platformda 1:1 reçine çözeltisine 1:1 oranında sekiz saatlik veya gece sızma, ardından dönen platformda 3:1 reçine oranında bir gece sızma.

Ertesi sabah, dokuya %100 taze reçineyle 4-8 saat, bir gece ve oda sıcaklığında dönen bir platformda dört saatlik bir sızma için sızın. Ertesi sabah, reçine tozla doyurulana kadar az miktarda reçineyi karbon siyahı tozuyla karıştırmak için ahşap bir çubuk kullanın, ancak hala akışkandır ve grenli olmaz. Konut kalın mürekkebe benzemeli ve görünür kümeler olmadan yavaşça damlatabilmeli Doku örneğini silikon kauçuk kalıba yerleştirin ve reçine bloğu içindeki numune yönünün daha sonra referansı için bir görüntü yakalayın.

Numune yerindeyken, silikon kalıbın ucundaki karbon siyahı doymuş reçinedeki dokuyu, reçinenin karşı ucundaki kalıptaki deneysel ve doku ayrıntılarını gösteren etiketle örtün. Daha sonra, kalıbı yaklaşık bir saat boyunca bir eğimde 65 santigrat derecelik bir fırına yerleştirin. Karbon siyahı aşılanmış reçine yeterince iyileştiğinde, kalıbı fırından çıkarın ve boş bir kuyudan başlayarak, kalıbın geri kalanını net reçine ile doldurun, etiketin görünür kalmasına dikkat edin.

Numune berrak reçine ile kaplandığında, silikon kalıbı bir eğime değil, 65 santigrat derece fırına 48 saat boyunca yerleştirin, ardından kalıbı çıkarın. Bloğu görüntülemeye hazırlamak için, reçine gömülü örneği konik ucu mandrenden yaklaşık beş ila altı milimetre yapışmış bir mikrotome aynaya yerleştirin. Numuneyi ayarlanan vida ile yerine kilitleyin ve numuneyi bir ısı lambasının altına yerleştirin.

Birkaç dakika sonra, mandreni bir stereo mikroskop tutucusuna yerleştirin ve doku görünene kadar blok yüze paralel ince bölümler yapmak için yeni, çift kenarlı bir jilet kullanın, bu da reçinenin dokudan yoksun kısımlarına kıyasla daha az yansıtıcı ve ayrıntılı olacaktır. Kırpma pim tutucusuna bir alüminyum numune pimi sabitleyin ve numuneyi yerinde tutmak için kullanılan tutkal için daha geniş bir yüzey alanı sağlamak için pimin yüzünde birkaç derin, çaprazlama çizikleri yapın. Numuneyi bir ısı lambasının altına yerleştirin ve bloğun yaklaşık üç milimetre çapında iki ila üç milimetre yüksekliğinde olması için doku örneğinden fazla reçineyi kesmek için, bloğa eşit derinlikte ikinci, dik bir kesim yapmadan önce jileti bir ila iki milimetre doğrudan reçine bloğuna itin.

Bu ilk kırpmadan sonra, ısı lambasının altındaki bloğu tekrar ısıtın ve reçine bloğunun üst kısmını tek bir pürüzsüz kesimde kesilmiş kısmın yaklaşık bir milimetre altında kesmek için yeni, çift kenarlı bir jilet kullanın. Kesilmiş alüminyum pim içeren kırpma pim tutucusunun stereomikroskop kabına yerleştirin ve pim yüzüne görünür bir menisküs oluşturmadan pimi tamamen kapacak şekilde ince bir siyanoakrilat tutkal tabakası uygulayın. Kesilmiş doku bloğu parçasını birkaç saniye boyunca numune pim yüzünün ortasına bastırmak için forseps kullanın ve tutkalın birkaç dakika ayarlanabilmesini bekleyin.

Tutkal iyice kuruduğunda, reçine bloğunun yükseltilmiş kısmındaki dokuyu bulun ve doku örneğini içeren reçinenin yükseltilmiş kısmını bir milimetre kareden daha büyük olmayan bir alana kırpmak için çift kenarlı bir jilet kullanın. Yavaşça ve dikkatlice, mümkün olduğunca fazla reçineyi çıkarın, bloğu bir boyutta biraz daha uzun süre bırakın ve doku örneğini içeren yükseltilmiş kısmın dışındaki alandaki fazla reçineyi pimin kenarına doğru açılamak için son bir metal dosya kullanın. Tüm numune bloğu yüzeyine ince bir kat gümüş boya ve altın püskürtme uygulamadan önce hazırlanan numuneden reçine parçacıklarını ve tozları çıkarın.

Kaplamadan sonra, blok yüzeylerinden fazla gümüş boyayı kesin ve monte edilmiş ve kesilmiş bloğu uygun etiket takılı özel yapım bir transfer pipet tüpünün soğanlı ucuna yerleştirin. SBF-SEM görüntüleme kullanılarak, yetişkin fare korneası içinde elastin içermeyen mikrofibril demetlerinden oluşan bir ağ tanımlanmıştır. Bu ağ, keratositlerle yakından ilişkili liflerle, hatta keratosit yüzeyinde sığ invaginasyonlar içinde yatan farklı katmanlarda düzenlenmiştir.

Bu protokolün uygulanması, stromal-epitel sınırdaki bazal epitel hücreleriyle kaynaşan merkezi kornea sinirlerinin daha önce bilinmeyen bir popülasyonunun keşfedilmesine yol açmıştır. Merkezi korneanın SBF-SEM görüntülemesi, 3D rekonstrüksiyon için manuel olarak segmentlere ayırılabilen limbal vaskülat, sinir demetleri ve ilişkili hücrelerin varlığını ortaya koymaktadır. Bu görüntüleme prosedürünün bazı tuzakları, sonraki görüntülerin dalgalı ve bozulmalı olmasına, blok yüzünden küçük elektron deşarjlarına neden olabilecek, çizgilerde hızlı kontrast değişikliklerine, hasarlı bir bıçak nedeniyle blok yüzünde bıçak çiziklerine veya bıçağın kenarında döküntü birikmesine neden olabilen çok uzun bir piksel bekleme süresi kullanmayı içerir. , genişletilmiş bir elektron ışını kaynaklı eserler, numune henüz görüntüleme odasındayken blok yüze odaklanır, yanlış doku fiksasyonu, hücresel yapıların ve bağ dokusunun ayrılmasına yol açan ve doku veya reçine bloğu içinde çok miktarda şarj sonucu görüntü atlayan.

Doku bloğunu keserken, doku bloğun içinde nerede olduğunu iyi anlamak önemlidir, böylece herhangi bir önemli örnek bölgeyi yanlışlıkla kırpmamak için. Belirli hücresel yapıların veya etkileşimlerin daha yüksek çözünürlüklü görüntüleri istenirse, görüntüleme durdurulabilir, blok mikroskoptan çıkarılabilir ve bir iletim elektron mikroskobunda görüntülenebilecekleri bir ultramikrotom üzerinde kesilen bölümler Seri blok yüz taramalı elektron mikroskopisi biyolojik dokuların tamamen benzersiz bir görünümünü sağlar. Bu protokolü kullanarak, kaliteli veri kümelerini hızla elde edebildik ve keşfedebileceğimiz doku yelpazesini genişletebildik.