Yeni bir İnsan Organotipik Retina Kültürü Tekniğinin Karakterizasyonu

Bu teknik, tüm retina katmanlarını ve hücre tiplerini yerinde koruyarak hayvan ve in vitro modellere kıyasla klinik olarak daha alakalı hale getirir. Bu protokolün temel avantajı, sağlıklı ve hastalıklı retinayı karşılaştırırken gerekli olan doku elleçleme sırasında retina bütünlüğü bozulmasını en aza indirmesidir. Retina hastalıkları, dokuyu belirli koşullar altında kült ederek taklit edilebilir.

Bu, yeni ilaç tedavilerinin testine izin verir. Diseksiyon ve numune toplama prosedürleri karmaşıktır. Bu nedenle, görsel gösterim okuyucuların yazılı protokolü anlamasına ve prosedürü başarıyla yürütmesine yardımcı olmak için kritik öneme sahiptir.

Prosedürü gösteren charisse Kuo, laboratuvarımdan ikinci sınıf doktora öğrencisi. Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta/Besin Karışımı F-12 ve bir kez antibiyotik ve antimykotik karışımı içeren kültür ortamını hazırlayın. İlk olarak, 500 mikrolitre ortayı 24 kuyulu bir tabağa yerleştirin ve 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte nemlendirilmiş bir inkübatöre denge edin.

Eksizyon ekstraksiyonu öncesinde ortamın hazır olması, daha sonra eklenme üzerine retinanın yerinden çıkarılmasını önler. Retina eksplantlarını çıkarmak için, göz kapağını iris ve lens yukarı bakacak şekilde bir Petri kabına yerleştirerek ve ONH Petri kabına temas ederek başlayın. Kirpik kullanarak kirpikte sabit tutun ve limbüsün dış kenarı boyunca çevresel olarak küçük kesikler yaparak iris ve lensi ayırın.

İris ve lensi dikkatlice çıkarın, retinayı rahatsız etmekten kaçındığından emin olun. Parlak beyaz bir ışık kaynağı kullanarak ONH'yi tanımlayın ve daha kolay kullanım için Petri kabını döndüren ONH'ye doğru dört kadranda incise. Göz kapağını dikkatlice yayın ve düzleştirin.

Retina bütünlüğünü bozmamak için tokmakları retina yerine sklera uygulayın. Hazırlanan ortamı içeren plakayı inkübatörden çıkarın. Retina kıvrımları olmayan bir bölgede retinaya cerrahi bir trefin yerleştirin ve petri kabını kırarken çatlama sesi üretmesi gereken skleraya nüfuz etmek için sert bastırın.

Skleranın tam olarak nüfuz ettiğinden emin olmak için trephine'i döndürün, böyle şekilde retina eksplantı artık numunenin geri kalanından ayrılır. Skleradaki tokmakları uygulayın ve sandviç retina eksplantını kültür ortamına aktarın. Toplanan sandviç retinasının nemlendirilmiş %5 karbondioksit inkübatöründe 72 saate kadar 37 santigrat derecede eksplantları kültüre edin.

Hematoksilin ve eozin lekeleme, sandviç retinanın bütünlüğünü koruduğunu ve iç ve dış nükleer katmanlarda kompakt çekirdeklerle GCL'den ONL'ye kadar belirgin bir lamel yapısının korunduğunu göstermiştir. Retinanın alttaki RPE koroid ve skleradan koptuğu aynı örneğin kenarlarında retina kalınlığının azaldığı ve INL ve ONL'de çekirdek kaybını gösteren bozulmuş retina bütünlüğü bulundu. Bazal koşullarda kültürlenen retina eksplantlarında, 72 saat sonra bile sürekli hücresel canlılık gösteren tunel pozitif hücre çekirdeğine rastlanmadı.

GFAP etiketlemesi glial fibrozis olmadan GCL ve IPL ile sınırlıydı, bu da GFAP'ın ONL'ye genişletilmiş ifadesi olarak tanımlanacak bir patoloji belirtisiydi. Vimentin, ganglion hücre tabakasından dış nükleer katmana kadar yüksek oranda ifade edildi ve normal retina dokularında görüldüğü gibi korunmuş Mueller hücre bütünlüğünü gösterdi. Luminex manyetik tahlil, IL-18, VEGF, IL-6 ve IL-8 seviyelerinin 24 saat sonra yüksek glikoz ve pro-enflamatuar sitokinlerde sandviç retina eksplant kültürlerinde taban çizgisinin önemli ölçüde üzerinde arttığını göstermiştir.

72 saat sonra IL-18 ve VEGF seviyeleri önemli ölçüde artmış, ancak IL-6 ve IL-8 seviyelerinde anlamlı bir farka rastlanmadı. Bu işlemi yaparken, retinayı RP koroidinden ayrılmaması ve kültür medyasında yüzmemesi için tartacak yeterli artık vitreus bırakın. Kültürlü retina immünhistokimya ve histoloji kullanılarak daha da karakterize edilebilirken, kültürlü ortama salınan enflamatuar sitokinler Luminex manyetik bir test kullanılarak ölçülebilir.

Bu model, retina hastalıkları için yeni terapötik ilaçların etkinliğini test etmek için daha uygun hale getiren hayvan ve in vitro modellerine kıyasla daha klinik olarak çevrilebilir.