Memeli Sperm Hücrelerinin Plazma Zarı Boyunca Elektrik Akımlarının Kaydedilmesi

Patch-clamp tekniğiyle sperm hücresinin elektriksel aktivitesinin kaydedilmesi, çeşitli sperm iyon kanallarının tanımlanmasında ve moleküler düzeyde sperm elektrofizyolojisinin anlaşılmasında çok önemli olmuştur. Bu yöntem, iyon kanallarının elektrofizyolojik ve farmakolojik parmak izlerini ölçmede üstün olup, iyon kanalı tanımlaması için en güvenilir araçtır. İyon kanallarının ve elektrojenik taşıyıcıların erkek doğurganlığı için fizyolojik önemi göz önüne alındığında, bu teknik, kısırlığa yol açan bazı sperm kusurlarını anlamak için güçlü bir araçtır.

Mikropipet üretimi için, dış çapı 1,5 milimetre, iç çapı 0,86 milimetre ve iç filamenti olan borosilikat cam kapillyarlarla başlayın. Ateş parlatmadan önce pipet ucunun iç çapının yaklaşık iki mikrometre olduğundan ve uygun parlatmadan sonra 0,5 mikrometreye indirildiğinden emin olun. Referans elektrodun çevresindeki ortamı stabil tutmak için bir agar köprüsü monte edin.

Küçük bir Bunsen ocağı altında bükülerek L şeklinde cam bir kapiller yapın ve soğumasına izin verin. Bir molyar potasyum klorürde %1 agaroz çözeltisi hazırlayın ve mikrodalgada agaroz eriyip çözelti şeffaf hale gelene kadar ısıtın. L şeklindeki cam kapiler kısmını dikkatlice agarozla doldurun ki hava kabarcıkları oluşmasın ve oda sıcaklığına soğumasına izin verin.

Alternatif olarak, L şeklindeki cam kapiler erimiş agaroza batırılır. Kabı birkaç kez karıştırın ve mikrodalgada tekrar ısıtın, ta ki agaroz kaynayana kadar, bu da agar köprüsünden hava kabarcıklarını dışarı atacaktır. Farenin alt karın bölgesini makasla açın ve her iki epididimidi çıkarın.

Bunları, oda sıcaklığına kadar ısıtılmış yüksek tuzlu veya HS çözeltisi ile doldurulmuş 35 milimetrelik bir hücre kültürü kabına yerleştirin. Epididimidleri, HS çözeltisi içeren yeni bir hücre kültürü kabına aktarın ve kalan tüm yağı iyice çıkarın. Epididimidleri kaput, corpus ve cauda olarak 15 numaralı bir bisterli bıçağı kullanarak ayırın.

Her epididimin korpusunu, HS çözeltisi içeren yeni bir hücre kültürü kabına aktarın. Epididimin izole kısmında sivri 11 numaralı bisterli bıçakla birden fazla kesi yapın. Epididimidlerin parçalarını, çoklu kesilerle 1,5 mililitrelik HS çözeltisi içeren 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Epididimden sperm hücrelerini kısa süreliğine çözeltiye Superfine Dumont Tip 5A forseps kullanarak sallayın. Sonra epididimidleri atıp tüpü oda sıcaklığında 10 dakika bekletin. Katı madde tüpün dibine çökene kadar bekle.

Sonra süpernatantı başka bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tübüne aktarın. 600x büyütme ile sitoplazmik damlacıklı uygun sperm hücresini bulun. Sitoplazmik damlanın oval olduğundan ve hafifçe uzun bir mil şeklinde olduğundan emin olun.

Başı örtü slipine bağlı hareketli bir spermatozoid seçin; böylece sperm hücresi kısmen sabitlenir, ancak sitoplazmik damla ve diğer flagellan flagella ile hareket etmeye devam eder. Sperm başının örtük slipine gevşek şekilde bağlı olduğundan emin olun. Uygun morfolojiye sahip bir sperm hücresi görsel olarak seçildikten sonra, mikropipeti pipet çözeltisiyle doldurun ve pipet tutucuya sabitleyin.

Pipet ucunu kalıntıdan temiz tutmak için, U tüp şeklindeki montaj kullanarak pipete pozitif basınç uygulayın. Pipeti aşağı indirin ve ucunu banyo çözeltisine daldırın. Hücreyi net görselleştirmek için, pipetin ucunu sitoplazmik damlanın üzerine öyle konumlandırın; böylece ucu damlaya çapraz hizalanır.

Pipetin ucunu hızla damlaya doğru indirin, böylece aynı odak düzleminde olurlar. Pipetin ucu damlaya değdiği anda, pipete negatif basınç uygulayarak damlanın bir kısmını uç içine taşıyıp giga-ohm bir mühür oluşturun. Sonra spermatozyoonu kapak kapakından kaldırın.

Tüm hücre moduna geçmeden önce amplifikatorun telafi modunu kullanarak boş kapasitans geçişini telafi edin. Bir milisaniye uygulayarak tüm hücre moduna geçiş yapın, yavaş yavaş artan voltaj darbeleri ve çok hafif bir emme uygulanır. Her devre voltajı darbesinin uygulanmasından sonra, daha büyük kapasitans geçiciliğinin olup olmadığını kontrol etmek için membran test aracını başlatın.

Tüm hücrenin kapasitansını ve erişim direncini belirlemek için daha büyük kapasitans geçiciliğini takın. Başarılı bir girişten sonra, farklı bileşikler içeren çeşitli banyo çözeltileri uygulamak veya voltaj adım veya voltaj rampası protokolleriyle kanal aktivitelerini ölçmek gibi planlanan tüm hücre yama-kelepçe deneylerine devam edin. CatSper kayıtları, patch pipet ile memeli spermatozoidi arasında sitoplazmik damlasında yüksek dirençli bir mühür oluşturularak gerçekleştirildi.

Seziyum tam hücreli CatSper akımlarının yoğunlukları, kaudal vahşi tipli nöron sperm hücrelerinden ve CatSper eksikliği olan kaudal nöron sperm hücrelerinden kaydedilmiştir. Farklı türlerin sperm hücreleri, morfolojileri ve iç düzenleyici yolları açısından çeşitlidir. Primat ve insan spermatozoidleri benzer CatSper kanal özellikleri ve düzenlemeleri göstermiştir.

İlginç bir şekilde, CatSper'ın progesteron aktivasyonu primat spermatozoidleri için benzersiz görünüyor. Domuz, boğa ve kemirgen spermleri CatSper akımlarında progesteron uyarılı herhangi bir değişiklik göstermedi. Boğa ve domuz spermatozoidlerinde, bazal CatSper kanal aktivitesi bile tespit edilebilir sınırların altındaydı; bu da kalsiyum akışı ve bunun sonucunda oluşan hiperaktivasyonun diğer kanallar veya taşıyıcılar tarafından yönlendirildiğini veya CatSper kanallarının aktivasyonu için farklı bir doğal uyarıcının gerekliydiğini düşündürmektedir.

Küçük, pürüzsüz, uniform ve aşırı şişmemiş sitoplazmik damlacıklar yama kelepçesi için en uygundur. O küçük tek taraflı, şişmiş ve tamamen şeffaf sitoplazmik damlacıkları kullanmaktan kaçınmalısınız çünkü bunlar zayıf veya hiç sızdırmazlık yaratacaktır. Bu teknik, doğal ifade sistemindeki belirli hava kanallarının ayrıntılı incelenmesini sağlar ve başarı, yüksek kaliteli değişken sperm hücrelerine, saf bölgelere, temel entelektüel fizyoloji becerilerine, sabra ve en önemlisi azmiye bağlıdır.