Faredeki Sinoatriyal ve Atriyoventriküler Düğümün Tam Montajlı İmmünofloresan Boyama, Konfokal Görüntüleme ve 3D Rekonstrüksiyonu

Bu protokol, farede özellikle sinüs düğümü ve AV düğümü için mikro diseksiyon, tam montajlı immünofloresan boyama ve mikroskopi gerçekleştirmek için gerekli adımları açıklar. Tam montaj metodolojisi, sinüs ve AV düğümünün tam 3D lokalizasyonunu ve morfolojisini ele almak ve çevredeki doku ile ilişkiyi incelemek için avantajlıdır. Doku morfolojisi, sadece minimum doku dehidrasyonu ve fiziksel yırtılma ile önemli ölçüde korunur.

Başlamak için, iğneyi dikkatlice sol ventriküle iterek ve kalbi doldurmak için hafifçe beş ila 10 mililitre buz gibi PBS enjekte ederek apeks bölgesinde 27 gauge iğne ile kalbi delin. Bir cımbız kullanarak kalbi dikkatlice kaldırın ve kalbi çıkarmak için büyük damarları kesin. Kalbi, diseksiyon mikroskobu altında buz gibi PBS ile doldurulmuş bir diseksiyon kabına koyun.

Kalbin yönünü belirledikten sonra, kalbin ön kısmı yemeğin dibinde olacak şekilde kalbi çevirin. Diseksiyon kabının altındaki agarozun içine apeksten ve atriyal apendiksten küçük pimler koyarak kalbi hareketsiz hale getirin. İnce cımbız ve makas kullanarak, superior ve inferior vena kava etrafındaki kardiyak olmayan dokuyu dikkatlice çıkarın.

İnterkaval bölgeyi ortaya çıkarmak için, ventriküller ve kulakçıklar arasındaki oluğa paralel olarak bir mikro makasla keserek ventriküllerin çoğunu çıkarın. Fiksasyon ve dehidrasyon için, numuneyi gece boyunca dört santigrat derecede %4 paraformaldehit içine koyun. Ertesi gün, kalbi% 15 sükroz çözeltisine aktarın ve dört santigrat derecede 24 saat inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, kalbi dört santigrat derecede 24 saat daha% 30 sükroz çözeltisine aktarın. Kalbi PBS'de seyreltilmiş% 1 Triton X-100 ile yıkayın. Daha sonra, gece boyunca dört santigrat derecede bloke etme çözeltisinde bloke edin ve geçirgenleştirin.

Kalbi 1.5 mililitrelik bir tüpe yerleştirin ve dört santigrat derecede yedi gün boyunca bloke edici çözelti ile seyreltilmiş tavşan anti-fare Connexin 43 ve sıçan anti-fare HTN4 antikorları ile inkübe edin. Yedi gün sonra, bir pipet kullanarak birincil antikorlar içeren çözeltiyi çıkarın. Kalbi %1 Triton X-100 solüsyonu ile orbital çalkalayıcıda yıkama başına bir saat boyunca üç kez yıkayın.

İkincil antikorlar ve DAPI ile inkübasyondan sonra yıkama adımlarını tekrarlayın. Plastik halkaları hazırladıktan ve hamuru ile doldurduktan sonra, kalbi kalbin arkası yukarı bakacak şekilde hamuru oluğuna yerleştirin. Kalbin dorsal tarafında bulunan SAN'ı interkaval bölge ile tanımlayın.

Kalp tamamen PBS ile kaplanana kadar boşluk içindeki tüm havayı değiştirmek için kalbe PBS ekleyin. Plastik halkanın kenarlarına silikon sürün. Kalbi sabitlemek ve kalbi bir kapak kaymağı ile örtmek için numunenin çevreleyen kısmını hamuru içine hafifçe bastırın.

Ardından, PBS'nin bir kısmını sıkmak için hamuru arka tarafına hafifçe bastırın ve görüntüleme alanında herhangi bir hava kabarcığı olmamasına dikkat ederek kalbi kapak kızağına takın. Tam montajlı boyama örneklerini konfokal mikroskobun platformuna baş aşağı yerleştirin ve metin el yazmasında açıklandığı gibi görüntülemeye devam edin. Konfokal mikroskobun her kanalı için parametreler, ilgili yazılım kullanılarak ayarlanır.

Bu protokol, murin kalplerinde hem sinoatriyal düğümün hem de atriyoventriküler düğümün konfokal mikroskopi görüntülemesini gerçekleştirmek için kullanıldı. İletim sisteminin ve çalışma miyokardının floresan antikorlarla spesifik boyanması, sırasıyla HCN4 ve Connexin 43'ü hedeflemesi, sağlam anatomi içinde sinoatriyal düğümü ve atriyoventriküler düğümü tanımlamayı mümkün kılar. Bu tam montajlı boyama protokolü, çeşitli antikorlar kullanarak farklı hücre tiplerinin etkileşimini incelemeyi mümkün kılar.