Name: Faredeki Sinoatriyal ve Atriyoventriküler Düğümün Tam Montajlı İmmünofloresan Boyama, Konfokal Görüntüleme ve 3D Rekonstrüksiyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: Keşfedin fare kalbindeki sinoatriyal ve atriyoventriküler düğümlerin tam montajlı immünofloresan boyama, konfokal görüntüleme ve 3D rekonstrüksiyon yöntemlerini. Bu teknik dokuların morfolojisini koruyarak kardiyak düğümlerin üç boyutlu lokalizasyonunu incelemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Çin Burs Konseyi (CSC, R. Xia'ya), Alman Kardiyovasküler Araştırma Merkezi (DZHK; 81X2600255'ten S. Clauss'a, 81Z0600206'dan S. Kääb'a), Corona Vakfı (S199/10079/2019'dan S. Clauss'a), SFB 914 (H. Ishikawa-Ankerhold ve S. Massberg'e Z01 projesi ve A10'dan C. Schulz'a), Kardiyovasküler Hastalıklar üzerine ERA-NET (ERA-CVD; 01KL1910'dan S. Clauss'a) ve Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (S. Clauss'a) tarafından desteklenmiştir. Fon verenlerin el yazması hazırlamada hiçbir rolü yoktu.

Hayvan bakımı ve tüm deneysel prosedürler, Münih Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Etik Komitesi'nin yönergelerine uygun olarak yürütülmüş ve fareler üzerinde yapılan tüm prosedürler Bavyera, Münih, Almanya Hükümeti tarafından onaylanmıştır (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106, ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). C57BL6/J fareleri Jackson Laboratuvarı'ndan satın alındı.
NOT: Şekil 1 , deney için gerekli aletleri göstermektedir. Şekil 2 , brüt kardiyak anatominin bir örneğini göstermektedir. Şekil 3 , SAN ve AVN'nin yetişkin bir fare kalbindeki konumunu göstermektedir. Şekil 4'te konfokal mikroskopiye yüklenen hazırlanmış örnek gösterilmektedir.
1. Hazırlıklar
<ol><li>30 mL PBS'de 10 mL% 16 formaldehit çözeltisini seyrelterek% 4'lük bir formaldehit çözeltisi (% 4 PFA) hazırlayın.</li>
	<li>Sırasıyla 15 g ve 30 g sakkaroz tozunu 100 mL PBS'ye çözerek% 15 sakkaroz çözeltisi ve% 30 sakkaroz çözeltisi hazırlayın. Sakkaroz tozu tamamen çözüldükten sonra, 4 ° C'de saklamadan önce çözeltiyi 0.2 μm şırınga filtresi kullanarak süzün.</li>
	<li>Bir beherin içine %3-%4'lük bir agaroz jeli hazırlayın, 3 g veya 4 g agaroz tozu ve 100 mL 1x TAE (50x TAE stok çözeltisinden seyreltilmiş) ekleyin. Beheri manyetik bir karıştırıcıya yerleştirin ve agaroz tamamen çözülene kadar kaynatın.</li>
	<li>Diseksiyon kabını, 100 mm çapında bir Petri kabına 30 mL agaroz jeli (% 3-4) hafifçe dökerek hazırlayın. Petri kabını soğuması ve sertleşmesi için oda sıcaklığında tezgahta bırakın.</li>
	<li>Tablo 1'de verilen tariflere göre blokaj çözeltisi ve yıkama çözeltisi hazırlayın. Kullanım gününde hazırlanan tüm çözümleri hazırlayın. Uzun süreli depolama önerilmez.</li>
	<li>Antikor çözeltilerini soğuk (4 ° C) 1x PBS'de seyrelterek hazırlayın, seyreltmeyi ışıktan koruyun (örneğin, alüminyum folyoyu etrafına sararak) ve seyreltmeleri kullanılana kadar buz üzerinde tutun. Kuluçkadan kısa bir süre önce antikorları seyreltin. Seyreltilmiş antikorları oda sıcaklığında bırakmaktan kaçının. NOT: Uygun antikor seyreltmesi, konvansiyonel immünofloresan boyama işlemi gerçekleştirilerek karşılaştırılabilir doku örnekleri ile test edilmelidir. Burada, antikorları 10 μm kalınlığında kesilmiş donmuş bölümleri boyayarak test ettik.</li>
</ol>2. Organ toplama ve doku hazırlama
<ol><li>Fareyi bir izofluran buharlaştırıcıya bağlı bir inkübasyon odasına yerleştirerek anestezi yapın. Buharlaştırıcıyı% 4-5 izofluran (sırasıyla% 96-95 oksijen) verecek şekilde ayarlayın. NOT: Tam anestezi, fare sırtına yerleştirilene kadar odayı hafifçe yuvarlayarak postüral reaksiyonun ve sağ refleksin kaybıyla doğrulanır.</li>
	<li>Fareyi ameliyat masasında sırtüstü pozisyona getirin. Fare burnunu, izofluran buharlaştırıcıya bağlı iç tüpü ile modifiye edilmiş bir Bain devresine bağlı bir anestezi maskesine yerleştirin. Anesteziyi sürdürmek için, 1 L / dak akış hızında oksijende% 1-2 izofluran kullanın. Fazla anestezik buharı maskenin dış tüpünden fareden temizleyin ve fazla anestezik gazı emen bir aktif kömür kutusundan çekin.</li>
	<li>Tam anestezi sağlandığında, analjezi için fentanil enjekte edin (0.1 μg / 25 g vücut ağırlığı i.p.).</li>
	<li>Ayak parmağını sıkıştırma refleksi tespit edilemediğinde, kürk ve cildi çıkarmak için iris makası kullanarak jugulumdan simfize kadar net bir kesim yapın. Karnı dikkatlice açmak için iris makası kullanarak kaburgaların altında soldan sağa doğru başka bir kesim yapın.</li>
	<li>Herhangi bir organa zarar vermeden diyaframın soldan sağa kesilmesine izin vermek için kavisli forseps kullanarak ksifoid biraz hayat verin. Göğüs kafesini her iki tarafta medial aksiller bir çizgide kesin, iris makası kullanarak kraniyal olarak çevirin ve kalbe erişime izin verin.</li>
	<li>İnferior vena kavayı ve inen torasik aortu iris makası kullanarak diyafram seviyesinde kesin. Kalbi tepe bölgesinde 27 G'lik bir iğne ile delin ve ardından iğneyi dikkatlice sol ventriküle (LV) itin. Kalbi delmek için LV'ye yavaşça 5-10 mL buz gibi soğuk PBS enjekte edin. NOT: Kalbin rengi, PBS ile başarılı perfüzyonu gösteren kırmızıdan griye dönmelidir.</li>
	<li>Büyük damarları kesmeye ve kalbi çıkarmaya izin veren bir cımbız kullanarak kalbin tepesini dikkatlice kaldırın.</li>
	<li>Superior vena kava'ya (SVC) zarar gelmesini önlemek için büyük arterleri ve damarları kalpten mümkün olduğunca uzağa keserek kalbi tüketin. Daha sonraki işlemler sırasında önemli bir dönüm noktası olarak hizmet edeceğinden SVC'yi koruyun.</li>
	<li>Kalbin çıkarılmasından sonra, izofluran buharlaştırıcısını kapatın.</li>
	<li>Kalbi, diseksiyon mikroskobu altında buz gibi soğuk PBS ile dolu bir diseksiyon kabına koyun. Kalbin solu/sağı ve önü/arkası belirlendikten sonra, kalbi kabın dibinde kalbin önü olacak şekilde çevirin (arkada bulunan büyük damarları ortaya çıkarmak için).</li>
	<li>Diseksiyon kabının altındaki agaroza tepeden ve sol atriyal apendikstan (LAA) küçük iğneler koyarak kalbi hareketsiz hale getirin (Şekil 2A). İnce cımbız ve makas kullanarak, kavaller arası bölgeyi açığa çıkarmak için SVC ve inferior vena kava (IVC) (örneğin akciğerler, yağ, perikard) etrafındaki kalp dışı dokuyu dikkatlice çıkarın (Şekil 3A).</li>
	<li>Ventriküller ve atriyum arasındaki oluğu mikro makasla paralel keserek ventriküllerin çoğunu çıkarın. Pleksiglas halkasına daha sonra yüklenmek üzere ventriküler dokunun küçük bir bölümünü koruyun.</li>
	<li>Fiksasyon ve dehidrasyon için, numuneyi (atriyum, SVC ve IVC içeren) 4 ° C'de gece boyunca% 4 PFA'ya koyun.</li>
	<li>Ertesi gün, kalbi 4 ° C'de 24 saat boyunca% 15 sakkaroz çözeltisine aktarın.</li>
	<li>Ertesi gün, kalbi 4 ° C'de 24 saat boyunca% 30 sakkaroz çözeltisine aktarın. NOT: Adım 2.13, 2.14 ve 2.15'teki sabitleme ve dehidrasyon için, numuneler daha fazla karışmadan veya sallanmadan 4 ° C'de bırakılır.</li>
</ol>3. Tam montajlı immünofloresan boyama
<ol><li>Kalbi PBS'de seyreltilmiş %1 Triton X-100 ile yıkayın ve 4 °C'de gece boyunca bloke edici çözeltiyi (Tablo 1) bloke edin ve geçirgenleştirin.</li>
	<li>Kalbi 1.5 mL'lik bir tüpe yerleştirin ve 4 ° C'de 7 gün boyunca bloke edici çözelti ile seyreltilmiş tavşan anti-fare konneksin-43 (1:200 seyreltme) ve sıçan anti-fare HCN4 (1:200 seyreltme) antikorları ile inkübe edin. NOT: Veri sayfalarını oryantasyon olarak kullanmadan önce optimal primer antikor konsantrasyonu test edilmelidir. İlgilenilen diğer antijenler de, birincil antijenin konakçı türleri diğerlerinden farklı olduğu sürece, bu adımda boyanabilir. Daha yüksek bir Triton X-100 konsantrasyonu,10'dan önce gösterildiği gibi daha etkili antikor boyaması elde edilmesine yardımcı olabilir, ancak konsantrasyon ayrı ayrı belirlenebilir.</li>
	<li>7 gün sonra, bir pipet kullanarak birincil antikorları içeren çözeltiyi çıkarın ve kalbi% 1 Triton X-100 çözeltisi ile 3 kez yıkayın (her seferinde orbital çalkalayıcıdaki oda sıcaklığında 1 saat boyunca).</li>
	<li>Yıkadıktan sonra, kalbi = Alexa Fluor 488 keçi anti-sıçan IgG (1:200 seyreltme) ve Alexa Fluor 647 keçi tavşan karşıtı IgG (1:200 seyreltme) ile 4 ° C'de 7 gün boyunca kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>7 gün sonra, ikincil antikorları içeren tüm çözeltiyi bir pipet kullanarak çıkarın. Daha sonra yıkama solüsyonunu kullanarak kalbi (Tablo 1) 3 kez yıkayın (yörüngesel çalkalayıcıdaki oda sıcaklığında her seferinde 1 saat boyunca).</li>
	<li>Çekirdekleri boyamak için, kalbi 4 ° C'de gece boyunca DAPI çözeltisinde (10 μg / mL) inkübe edin.</li>
	<li>Ertesi gün, kalbi 3 kez yıkama çözeltisiyle yıkayın (yörüngesel çalkalayıcıdaki oda sıcaklığında her seferinde 1 saat boyunca). NOT: Adım 3.1, 3.2, 3.4 ve 3.6'da blokaj, geçirgenlik, antikor inkübasyonu ve DAPI boyama için, numuneleri 4 ° C'de sabit durumda bırakın, karıştırmaya gerek yoktur. Lekeli doku, 4 ° C'de yıkama çözeltisi ile tamamen örtülmüş olarak korunabilir ve konfokal mikroskopta görüntülenene kadar birkaç gün boyunca ışıktan korunabilir.</li>
</ol>4. Konfokal mikroskopi
<ol><li>Pleksiglas halkaları hazırlayın ve hamuru ile doldurun (Şekil 1). Hamurun merkezinde, kalbin yüklenmesi için merkezde küçük bir oluk oluşur. Düz bir görüntüleme düzlemi elde etmek ve alanı ayarlamak ve 4.4. adımda numune ile kapak kaymaları arasındaki hava kabarcıklarını önlemek için sığ bir oluk açın.</li>
	<li>Hem SAN hem de AVN'nin sırayla görüntülenmesi için aynı kalp örneğini kullanın. SAN görüntüleme için doğrudan kalbe yüklenirken, AVN görüntüleme için daha önce mikrodiseksiyon yapın.<ol><li>SAN görüntüleme<ol><li>SAN'ı anatomik yer işaretleriyle tanımlayın: kalbin dorsal tarafında, kavaller arası bölgede (üst ve alt vena kava arasındaki bölge) bulunur. Crista terminalis (BT), SAN ve RAA arasındaki kas çizgisidir.</li>
			<li>Kalbi, kalbin arkası yukarı bakacak şekilde hamuru oluğuna yerleştirin. Kalp PBS ile tamamen kaplanana kadar boşluktaki tüm havayı yerinden etmek için kalbe PBS ekleyin (genellikle birkaç damla PBS yeterlidir).</li>
			<li>Diseksiyon mikroskobu altında, kalbi sabitlemek için RAA, LAA ve sol ventrikülün kalan kısımlarını hamuru içine hafifçe bastırın. Tüm kavaller arası bölgenin ve crista terminalinin açıkça görülebildiğinden emin olun (hamuru ile kaplı değildir). Görüntülenecek alan Şekil 3A'da gösterilmiştir.</li>
		</ol></li>
		<li>AVN görüntüleme<ol><li>SAN'ın görüntülenmesini bitirdikten sonra, aynı örneği hatırlayın ve ardından AVN görüntüleme için kullanın. AVN mikrodiseksiyonu için, kalbi = diseksiyon mikroskobunun altındaki bir diseksiyon kabına yerleştirin.</li>
			<li>Kalbi sağ taraf yukarı bakacak şekilde yönlendirin (sağ ventrikülün kalan kısımları dahil). Dokuyu hareketsiz hale getirmek için AG serbest duvarının kalan kısmından (şimdi altta olan) pimler yerleştirin (Şekil 2B).</li>
			<li>Kalan RV serbest duvarını triküspid valf ve superior vena kava boyunca yukarı doğru kesin. Daha sonra interventriküler ve interatriyal septumu ortaya çıkarmak için RV ve RA'yı çevirin. (Şekil 3B) NOT: Koroner sinüse (CS) zarar vermemeye dikkat edin, çünkü daha sonra AVN'yi lokalize etmeye izin veren Koch üçgenini bulmak önemli bir anatomik dönüm noktasıdır. CS, kalbin arka tarafındaki sol atriyoventriküler olukta enine olarak çalışır ve CS deliği açıklığı, interatriyal septumun alt kısmındaki IVC ile triküspid kapak arasında bulunur (Şekil 3A ve B).</li>
			<li>Sağ atriyumun endokardiyal yüzeyinde bulunabilen, triküspid kapağın (TV) septal broşürünün menteşe çizgisi ile ön tarafta ve arkada Todaro tendonu ile sınırlanmış Koch üçgenini tanımlayın. Taban, koroner sinüsün deliğinden oluşur (Şekil 3B). AVN görüntüleme için hedef bölge burası olduğundan, açıkça görülebilmesi gerekir.</li>
			<li>Kalbi, Pleksiglas halkası içindeki hamuru oluğuna, Koch üçgeni açıkça açığa çıkarılarak (yani hamuru ile kaplanmamış) aktarın. Numuneyi sabitlemek için Koch üçgeninin etrafındaki dokuyu hamuru yavaşça bastırın. Kalp PBS ile tamamen kaplanana kadar boşluktaki tüm havayı yerinden etmek için kalbe PBS ekleyin (genellikle birkaç damla PBS yeterlidir).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Pleksiglas halkaların kenarlarına, hamuru dolgulu Pleksiglas halkaların içine yüklenen kalplerin kapak kaymalarıyla kaplanmasını sağlamak için silikon uygulayın.</li>
	<li>PBS'nin parçalarını sıkmak ve görüntüleme alanında herhangi bir hava kabarcığından kaçınırken kalbi kapak kaymasına takmak için hamurunun arka tarafına hafifçe bastırın. NOT: Hamurunun arka tarafına bastırılırken ilgilenilen bölgelerin katlanmadığından ve örtülmediğinden emin olun. Anatominin korunması ve örneklerin uygun konfokal görüntülenmesi için numune aşırı kompresyonu olmayan düz bir görüntüleme düzlemi gereklidir. SAN için, kavaller arası bölgenin açıkça açığa çıktığından emin olmak önemlidir. AVN için, Koch üçgeni tamamen açığa çıkarılmalıdır.</li>
	<li>Tüm montajlı boyama örneklerini konfokal mikroskop platformuna baş aşağı yerleştirin. Kapak kaymasına takılı açıkta kalan SAN/AVN artık mikroskop platformunun dibindedir (Şekil 4). NOT: Görüntü çekmek için Airyscan Ünitesine sahip Carl Zeiss LSM800 ve ZEN 2.3 SP1 siyah yazılımını kullanıyoruz.</li>
	<li>Alexa Fluor 420 konjuge anti-HCN4'ün uyarılması için "BP420-480 + LP605" plakasını seçin. Ana kazancı 650-750 arasında değiştirin.</li>
	<li>Döşeme Tarama işlevini kullanarak tüm SAN ve AVN bölgesinin genel bir görüntüsünü alın. Ardından, taranacak ilgi alanının etrafındaki genel bakış görüntüsüne tıklayıp bir kare ekleyerek HCN4 pozitif bölgesini seçin.</li>
	<li>Konfokal mikroskobun kalan kanalları (Alexa Fluor 488 ve DAPI) için plakalar ve ana kazanç dahil olmak üzere parametreleri kontrol edin ve adım 4.6'da açıklandığı gibi ayarlayın.</li>
	<li>Tüm numuneyi önizlemek ve Z-stack aralığı için İlk ve Son'u ayarlamak üzere odağı numunenin yukarıdan aşağıya doğru yavaşça ayarlayın. Optik numunenin kalınlığına bağlı olarak Z-yığını için en uygun aralığı ayarlayın. Z-yığını için aralık olarak 20x hedefi ve 0,8-1 μm kullanıyoruz.</li>
	<li>Tüm parametreler düzgün bir şekilde ayarlandıktan sonra, SAN ve AVN'nin tüm alanını tarayın.</li>
	<li>Yazılım kullanarak görüntülerin 3B rekonstrüksiyonunu gerçekleştirin (örneğin, Imaris sürüm 8.4.2).<ol><li>Görüntü İşleme'yi seçin | Arka plan lekelemesini kaldırmak için Temel Çıkarma Özelliği.</li>
		<li>Seçilen kanal ve işlenecek ilgili bölge için ayara yüzey oluşturmayı seçin.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Clauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+arrhythmia%3A+classic+electrophysiology+to+genetically+modified+large+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals.</a> Nature Reviews Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).</li>
<li>Clauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+porcine+model+of+atrial+arrhythmogenicity+in+the+context+of+ischaemic+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of a porcine model of atrial arrhythmogenicity in the context of ischaemic heart failure.</a> PLoS One. 15 (5), 0232374(2020).</li>
<li>Schuttler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+Models+of+Atrial+Fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Animal Models of Atrial Fibrillation.</a> Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).</li>
<li>van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+and+function+of+the+cardiac+conduction+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The formation and function of the cardiac conduction system.</a> Development. 143 (2), 197-210 (2016).</li>
<li>Vogler, J., Breithardt, G., Eckardt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bradyarrhythmias+and+Conduction+Blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Espa%C3%B1ola+de+Cardiolog%C3%ADa+%28English+Edition%22%5BJournal%5D)">Bradyarrhythmias and Conduction Blocks.</a> Revista Española de Cardiología (English Edition. 65 (7), 656-667 (2012).</li>
<li>Wen, Y., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+mouse+sinoatrial+node+and+its+expression+of+NF-160+and+HCN4%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Morphology of mouse sinoatrial node and its expression of NF-160 and HCN4.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (8), 13383-13387 (2015).</li>
<li>Verheijck, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+features+of+the+mouse+sinoatrial+node+in+relation+to+connexin+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution.</a> Cardiovascular Research. 52 (1), 40-50 (2001).</li>
<li>Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+anatomy+of+the+murine+sinus+node%3A+high-resolution+optical+mapping+of+ankyrin-B+heterozygous+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice.</a> American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 299 (2), H482-H491 (2010).</li>
<li>Sillitoe, R. V., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+immunohistochemistry%3A+a+high-throughput+screen+for+patterning+defects+in+the+mouse+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Whole-mount immunohistochemistry: a high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (2), 235-244 (2002).</li>
<li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li>
<li>Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organisation+of+the+mouse+sinoatrial+node%3A+structure+and+expression+of+HCN+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels.</a> Cardiovascular Research. 73 (4), 729-738 (2007).</li>
<li>Muller-Taubenberger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+fluorescent+protein+tags+as+reporters+in+live-cell+imaging+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Application of fluorescent protein tags as reporters in live-cell imaging studies.</a> Methods Mol Biol. 346, 229-246 (2006).</li>
<li>Müller-Taubenberger, A., Ishikawa-Ankerhold, H. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aM%C3%BCller-Taubenberger%2C+A+%22Dictyostelium+discoideum+Protocol%22">Dictyostelium discoideum Protocol</a>. Eichinger, L., Rivero, F. , Humana Press. 93-112 (2013).</li>
<li>Shaw, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShaw%2C+PJ+%22Handbook+Of+Biological+Confocal+Microscopy%22">Handbook Of Biological Confocal Microscopy</a>. Pawley, J. B. , Springer US. 453-467 (2006).</li>
<li>Huff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Airyscan+detector+from+ZEISS%3A+confocal+imaging+with+improved+signal-to-noise+ratio+and+super-resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution.</a> Nature Methods. 12 (12), (2015).</li>
<li>Rysevaite, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+characterization+of+the+intrinsic+cardiac+neural+plexus+in+whole-mount+mouse+heart+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical characterization of the intrinsic cardiac neural plexus in whole-mount mouse heart preparations.</a> Heart Rhythm. 8 (5), 731-738 (2011).</li>
<li>Acar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+imaging+of+bone+marrow+shows+non-dividing+stem+cells+are+mainly+perisinusoidal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal.</a> Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).</li>
<li>Brahmajothi, M. V., Morales, M. J., Campbell, D. L., Steenbergen, C., Strauss, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+distribution+of+voltage-gated+ion+channels+in+ferret+sinoatrial+node%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Expression and distribution of voltage-gated ion channels in ferret sinoatrial node.</a> Physiological Genomics. 42 (2), 131-140 (2010).</li>
<li>Mesirca, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+arrhythmia+induced+by+genetic+silencing+of+%27funny%27+%28f%29+channels+is+rescued+by+GIRK4+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Cardiac arrhythmia induced by genetic silencing of 'funny' (f) channels is rescued by GIRK4 inactivation.</a> Nature Communication. 5, 4664(2014).</li>
<li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HCN4+dynamically+marks+the+first+heart+field+and+conduction+system+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors.</a> Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).</li>
<li>Verheule, S., Kaese, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+diversity+in+the+heart%3A+insights+from+transgenic+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Connexin diversity in the heart: insights from transgenic mouse models.</a> Frontiers in Pharmacology. 4, 81(2013).</li>
<li>van der Velden, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+gap+junctions+and+connexins%3A+their+role+in+atrial+fibrillation+and+potential+as+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac gap junctions and connexins: their role in atrial fibrillation and potential as therapeutic targets.</a> Cardiovascular Research. 54 (2), 270-279 (2002).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Kardiyak anatomi geleneksel olarak ince histolojik kesitler11 kullanılarak incelenmiştir. Bununla birlikte, bu yöntemler iletim sisteminin üç boyutlu yapısını korumaz ve bu nedenle sadece 2D bilgi sağlar. Burada açıklanan tam montajlı immünofloresan boyama protokolü bu sınırlamaların üstesinden gelmeye izin verir ve SAN ve AVN görüntüleme için rutin olarak kullanılabilir.
Parafin gömme, kesitleme ve antijen alımı gerektiren geleneksel immünohistokimya gibi standart yönt...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62058">Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse</a>. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia1,2,3 
Julia Vlcek1,2 
Julia Bauer1,2,3 
Stefan K&#228;&#228;b1,3 
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2 
Dominic Adam van den Heuvel1,2 
Christian Schulz1,2,3 
Steffen Massberg1,2,3 
Sebastian Clauss1,2,3 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilian University Munich 
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig Maximilian University Munich 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
to:
Ruibing Xia1,2,3 
Julia Vlcek1,2 
Julia Bauer1,2,3 
Stefan K&#228;&#228;b1,3 
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2 
Dominic Adam van den Heuvel1,2 
Christian Schulz1,2,3 
Steffen Massberg1,2,3 
Sebastian Clauss1,2,3 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich 
2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62058">Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

Aritmiler milyonlarca insanı etkileyen yaygın hastalıklardır ve dünya çapında önemli morbidite ve mortalite nedenidir. Kardiyak kalp pillerinin geliştirilmesi gibi tedavi ve önlemedeki muazzam ilerlemelere rağmen, aritmilerin tedavisi, esas olarak altta yatan hastalık mekanizmaları hakkındaki çok sınırlı bilgi birikimi nedeniyle zor olmaya devam etmektedir 1,2,3. Aritmilerin hem normal elektrofizyolojisinin hem de patofizyolojisinin daha iyi anlaşılması, gelecekte yeni, yenilikçi ve nedensel tedavi stratejilerinin geliştirilmesine yardımcı olabilir. Ek olarak, aritmogenezi kapsamlı bir şekilde incelemek için, fareler elektrofizyoloji araştırmalarında yaygın olarak kullanıldığından, fare gibi hayvan modellerinde spesifik kardiyak iletim sistemini lokalize etmek ve görselleştirmek önemlidir.
Kardiyak iletim sisteminin ana parçaları, elektriksel impulsun özel kalp pili hücrelerinde üretildiği sinoatriyal düğüm (SAN) ve atriyum ile ventriküller arasındaki tek elektriksel bağlantı olan atriyoventriküler düğümdür (AVN)4. SAN ve AVN'nin elektrofizyolojik özellikleri her değiştiğinde, hemodinamik bozulmaya, senkopa ve hatta ölüme yol açabilecek hasta sinüs sendromu veya atriyoventriküler blok gibi aritmiler ortaya çıkabilir ve böylece hem SAN hem de AVN'nin elektrofizyoloji ve aritmiyogenezdeki temel rolünün altını çizer5.
SAN veya AVN ile ilgili kapsamlı çalışmalar, her iki yapının da ideal olarak fizyolojik ortamlarında hassas bir lokalizasyonunu ve görselleştirilmesini gerektirir. Bununla birlikte, çalışan miyokard içindeki küçük boyutları ve konumları nedeniyle, makroskopik olarak görülebilen net bir yapı oluşturmadan, SAN ve AVN'nin anatomisini ve elektrofizyolojisini incelemek zordur. Anatomik yer işaretleri, SAN ve AVN 6,7,8'i içeren bölgeyi kabaca tanımlamak için kullanılabilir. Kısaca SAN, sağ atriyumun kas krista terminalisine (BT) bitişik kaval bölgesinde, AVN, triküspid kapak, koroner sinüsün ostiumu ve Todaro tendonu tarafından kurulan Koch üçgeni içinde yer almaktadır. Şimdiye kadar, bu anatomik işaretler esas olarak SAN ve AVN'yi bireysel yapılar olarak lokalize etmek, kaldırmak ve daha sonra incelemek için kullanıldı (örneğin, geleneksel histoloji ile). Bununla birlikte, SAN ve AVN'nin karmaşık elektrofizyolojisini (örneğin, çalışan miyokardın bitişik hücrelerinin düzenleyici etkileri) daha iyi anlamak için, fizyolojik 3D ortamdaki iletim sistemlerini incelemek gereklidir.
Tam montajlı immünofloresan boyama, çevreleyen dokunun bütünlüğünü korurken anatomik yapıları in situ olarak incelemek için kullanılan bir yöntemdir9. Konfokal mikroskopi ve görüntü analiz yazılımından yararlanan SAN ve AVN, özellikle bu bölgelerde ifade edilen iyon kanallarını hedefleyen floresan etiketli antikorlarla görselleştirilebilir.
Aşağıdaki protokol, SAN ve AVN mikroskop lokalizasyonu ve görselleştirmesi için iyi kurulmuş bir bütüne monte boyama yöntemi gerçekleştirmek için gerekli adımları açıklamaktadır. Spesifik olarak, bu protokol (1) SAN ve AVN'nin anatomik işaretlerle anatomik işaretlerle nasıl lokalize edileceğini ve bu numunelerin boyama ve mikroskopi analizi için nasıl lokalize edileceğini (2) HCN4 ve Cx43 (3) referans belirteçlerinin tam montajlı immünofloresan boyamasını gerçekleştirmek için SAN ve AVN örneklerini konfokal mikroskopi için hazırlamak (4) SAN ve AVN'nin konfokal görüntülemesini gerçekleştirmek için açıklamaktadır. Ayrıca, bu protokolün, çevredeki çalışan miyokard veya otonom sinir lifleri gibi miyosit olmayan hücrelerin ilave boyanmasını içerecek şekilde nasıl değiştirilebileceğini de açıklıyoruz, bu da kalp içindeki kardiyak iletim sisteminin kapsamlı bir şekilde araştırılmasını sağlıyor.

<table><tbody><tr><td><güçlü > Anestezi< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>İzofluran buharlaştırıcı sistemi&nbsp;</td><td>Hugo Sachs Elektronik</td><td>34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910</td><td>Bir indüksiyon odası, bir gaz tahliye ünitesi ve karbon filtreleri içerir</td></tr><tr><td>Modifiye Bain devresi</td><td>Hugo Sachs Elektronik</td><td>73-4860</td><td>Fareler için bir anestezi maskesi içerir</td></tr><tr><td>Cerrahi Platform</td><td>Kent Scientific</td><td>SURGI-M</td><td></td></tr><tr><td>In vivo enstrümantasyon</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnce forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>İris makası</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Yaylı makas</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>Doku forsepsleri</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>Doku pimleri</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>26007-01</td><td>Yedek olarak 27G iğneler kullanılabilir</td></tr><tr><td><güçlü>Genel laboratuvar aletleri</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbital çalkalayıcı</td><td>Sunlab</td><td>D-8040</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik karıştırıcı</td><td>IKA&nbsp;</td><td>RH temel</td><td></td></tr><tr><td>Pipet, hacim 10 ve mikro; L, 100 ve mikro; L, 1000 ve mikro; L</td><td>Eppendorf</td><td>Z683884-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskoplar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon stereo-zoom mikroskobu&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10836-004</td><td></td></tr><tr><td>Lazer Tarama Konfokal mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 8.4.2</td><td>Oxford aletleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEN 2.3 SP1 siyah</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>General Lab Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 ve mikro; m şırınga filtresi</td><td>Sartorius</td><td>17597</td><td></td></tr><tr><td>100 mm petri kabı</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>27G iğne</td><td>BD Microlance 3</td><td>300635</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Polipropilen konik tüp</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>5ml Şırınga</td><td>Braun</td><td>4606108V</td><td></td></tr><tr><td>Kapak fişleri</td><td>Thermo Scientific</td><td>7632160</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tüpleri</td><td>Eppendorf</td><td>30121872</td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Kimyasallar</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA</td><td>Sigma</td><td>20-158</td><td>TEA Bileşenleri</td></tr><tr><td>% 16 Formaldehit Çözeltisi</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>28908</td><td>%4'lük bir çözelti olarak kullanın&nbsp;</td></tr><tr><td>Asetik asit</td><td>Merck</td><td>100063</td><td>TEA'nın Bileşenleri</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biozym</td><td>850070</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Sigma</td><td>A2153-100G</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (1X) Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Normal keçi serumu</td><td>Sigma</td><td>NS02L</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma</td><td>S1888-1kg</td><td></td></tr> TEA <tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-250ml'nin</td> Tris-base Roche TRIS-RO Bileşenleri PBS Tween 20 Sigma P2287-500ml'de<td>% 1'e Seyreltilmiş</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td><güçlü>İlaçlar< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Fentanil 0.5 ve nbsp;<td></td></tr><tr><td> mg/10&nbsp; mL</td><td>Braun Melsungen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İzofluran 1 mL/mL</td><td>Cp-pharma</td><td>31303</td><td></td></tr><tr><td>Oksijen 5 L</td><td>Linde</td><td>2020175</td><td>Basınç regülatörü</td></tr> <tr><td><güçlü >Antikorlar< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Keçi anti-Tavşan IgG Alexa Fluor içerir; 488&nbşk;</td><td>Hücre Sinyal Teknolojisi</td> <td># 4412</td>, <td>1:200</td></tr><tr><td>Keçi anti-Sıçan IgG Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>#A-21247</td>, <td>1:200</td></tr><tr><td>Hoechst 33342, Trihidroklorür, Trihidrat (DAPI)</td> ile seyreltilmiş <td>Invitrogen</td>, <td>H3570</td>, <td>1:1000</td></tr><tr><td>Tavşan Anti-Connexin-43</td><td>Sigma</td><td>C6219</td>, <td>1:200</td></tr><tr><td>Sıçan anti-HCN4 (SHG 1E5)</td><td></td> <td>ile seyreltilmişMA3-903</td><td>1:200 seyreltilmiş</td></tr> <tr><td><güçlü>Diğer< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Pleksiglas halka</td><td></td><td></td><td>Kendinden tasarlanmış ve 3D baskılı</td></tr><tr><td>Hamuru</td><td>Cernit</td><td>49655005</td><td></td></tr><tr><td>Silikonpasten, Baysilone</td><td>VWR</td><td>291-1220</td><td></td></tr> <tr><td>< güçlü > Hayvanlar < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Fare, C57BL/6</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

faredeki sinoatriyal ve atriyoventriküler düğümün tam montajlı İmmünofloresan boyama, konfokal görüntüleme ve 3d rekonstrüksiyonu

Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

Sinoatriyal düğümdeki (SAN) kalp pili hücreleri tarafından fizyolojik olarak üretilen elektrik sinyali, tüm kalbin uyarılmasına ve kasılmasına izin vermek için atriyoventriküler düğümü (AVN) içeren iletim sistemi aracılığıyla iletilir. SAN veya AVN'nin herhangi bir disfonksiyonu, elektrofizyoloji ve aritmogenezdeki temel rollerini gösteren aritmilere neden olur. Fare modelleri aritmi araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır, ancak SAN ve AVN'nin spesifik araştırması zor olmaya devam etmektedir.
SAN, crista terminalinin superior vena kava ile birleştiği noktada bulunur ve AVN, koroner sinüs, triküspid annulus ve Todaro tendonunun deliğinden oluşan Koch üçgeninin tepesinde bulunur. Bununla birlikte, küçük boyut nedeniyle, geleneksel histoloji ile görselleştirme zor olmaya devam etmektedir ve SAN ve AVN'nin 3D ortamlarında incelenmesine izin vermemektedir.
Burada, etiketli fare SAN ve AVN'nin yerel olarak görselleştirilmesine izin veren tam montajlı bir immünofloresan yaklaşımını açıklıyoruz. Bu amaçla, fare kalbi disseke edilir, istenmeyen doku çıkarılır, ardından fiksasyon, geçirgenlik ve bloke edilir. SAN ve AVN içindeki iletim sisteminin hücreleri daha sonra bir anti-HCN4 antikoru ile boyanır. Konfokal lazer tarama mikroskobu ve görüntü işleme, düğüm hücreleri ve çalışan kardiyomiyositler arasında ayrım yapılmasına ve SAN ve AVN'nin net bir şekilde lokalize edilmesine izin verir. Ayrıca, sinir lifleri gibi diğer hücre tiplerini de etiketlemek için ek antikorlar birleştirilebilir.
Konvansiyonel immünohistoloji ile karşılaştırıldığında, tam montajlı immünofloresan boyama, kardiyak iletim sisteminin anatomik bütünlüğünü korur, böylece AVN'nin araştırılmasına izin verir; özellikle anatomilerine ve çevredeki çalışan miyokard ve miyosit olmayan hücrelerle etkileşimlerine girer.

Yukarıda özetlenen protokolü kullanarak, hem SAN hem de AVN'nin konfokal mikroskopi görüntülemesi güvenilir bir şekilde gerçekleştirilebilir. HCN4'ü hedef alan floresan antikorları kullanarak iletim sisteminin spesifik boyanması ve Cx43'ü hedefleyen floresan antikorları kullanarak çalışan miyokardın boyanması, sağlam anatomi içinde SAN (Şekil 5, Video 1) ve AVN'nin (Şekil 6, Video 2) net bir şekilde tanımlanmasın...

Murin kalplerde sinoatriyal nod (SAN) ve atriyoventriküler nodun (AVN) tam montajlı immünofloresan boyaması için adım adım bir protokol sağlıyoruz.

Faredeki Sinoatriyal ve Atriyoventriküler Düğümün Tam Montajlı İmmünofloresan Boyama, Konfokal Görüntüleme ve 3D Rekonstrüksiyonu

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes ...

Bu protokol, farede özellikle sinüs düğümü ve AV düğümü için mikro diseksiyon, tam montajlı immünofloresan boyama ve mikroskopi gerçekleştirmek için gerekli adımları açıklar. Tam montaj metodolojisi, sinüs ve AV düğümünün tam 3D lokalizasyonunu ve morfolojisini ele almak ve çevredeki doku ile ilişkiyi incelemek için avantajlıdır. Doku morfolojisi, sadece minimum doku dehidrasyonu ve fiziksel yırtılma ile önemli ölçüde korunur.Başlamak için, iğneyi dikkatlice sol ventriküle iterek ve kalbi doldurmak için hafifçe beş ila 10 mililitre buz gibi PBS enjekte ederek apeks bölgesinde 27 gauge iğne ile kalbi delin. Bir cımbız kullanarak kalbi dikkatlice kaldırın ve kalbi çıkarmak için büyük damarları kesin. Kalbi, diseksiyon mikroskobu altında buz gibi PBS ile doldurulmuş bir diseksiyon kabına koyun.Kalbin yönünü belirledikten sonra, kalbin ön kısmı yemeğin dibinde olacak şekilde kalbi çevirin. Diseksiyon kabının altındaki agarozun içine apeksten ve atriyal apendiksten küçük pimler koyarak kalbi hareketsiz hale getirin. İnce cımbız ve makas kullanarak, superior ve inferior vena kava etrafındaki kardiyak olmayan dokuyu dikkatlice çıkarın.İnterkaval bölgeyi ortaya çıkarmak için, ventriküller ve kulakçıklar arasındaki oluğa paralel olarak bir mikro makasla keserek ventriküllerin çoğunu çıkarın. Fiksasyon ve dehidrasyon için, numuneyi gece boyunca dört santigrat derecede %4 paraformaldehit içine koyun. Ertesi gün, kalbi% 15 sükroz çözeltisine aktarın ve dört santigrat derecede 24 saat inkübe edin.İnkübasyondan sonra, kalbi dört santigrat derecede 24 saat daha% 30 sükroz çözeltisine aktarın. Kalbi PBS'de seyreltilmiş% 1 Triton X-100 ile yıkayın. Daha sonra, gece boyunca dört santigrat derecede bloke etme çözeltisinde bloke edin ve geçirgenleştirin.Kalbi 1.5 mililitrelik bir tüpe yerleştirin ve dört santigrat derecede yedi gün boyunca bloke edici çözelti ile seyreltilmiş tavşan anti-fare Connexin 43 ve sıçan anti-fare HTN4 antikorları ile inkübe edin. Yedi gün sonra, bir pipet kullanarak birincil antikorlar içeren çözeltiyi çıkarın. Kalbi %1 Triton X-100 solüsyonu ile orbital çalkalayıcıda yıkama başına bir saat boyunca üç kez yıkayın.İkincil antikorlar ve DAPI ile inkübasyondan sonra yıkama adımlarını tekrarlayın. Plastik halkaları hazırladıktan ve hamuru ile doldurduktan sonra, kalbi kalbin arkası yukarı bakacak şekilde hamuru oluğuna yerleştirin. Kalbin dorsal tarafında bulunan SAN'ı interkaval bölge ile tanımlayın.Kalp tamamen PBS ile kaplanana kadar boşluk içindeki tüm havayı değiştirmek için kalbe PBS ekleyin. Plastik halkanın kenarlarına silikon sürün. Kalbi sabitlemek ve kalbi bir kapak kaymağı ile örtmek için numunenin çevreleyen kısmını hamuru içine hafifçe bastırın.Ardından, PBS'nin bir kısmını sıkmak için hamuru arka tarafına hafifçe bastırın ve görüntüleme alanında herhangi bir hava kabarcığı olmamasına dikkat ederek kalbi kapak kızağına takın. Tam montajlı boyama örneklerini konfokal mikroskobun platformuna baş aşağı yerleştirin ve metin el yazmasında açıklandığı gibi görüntülemeye devam edin. Konfokal mikroskobun her kanalı için parametreler, ilgili yazılım kullanılarak ayarlanır.Bu protokol, murin kalplerinde hem sinoatriyal düğümün hem de atriyoventriküler düğümün konfokal mikroskopi görüntülemesini gerçekleştirmek için kullanıldı. İletim sisteminin ve çalışma miyokardının floresan antikorlarla spesifik boyanması, sırasıyla HCN4 ve Connexin 43'ü hedeflemesi, sağlam anatomi içinde sinoatriyal düğümü ve atriyoventriküler düğümü tanımlamayı mümkün kılar. Bu tam montajlı boyama protokolü, çeşitli antikorlar kullanarak farklı hücre tiplerinin etkileşimini incelemeyi mümkün kılar.

whole-mount-immunofluorescence-staining-confocal-imaging-3d

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu video, sinoatriyal düğümü veya SAN'ı fare kalbinden izole etme prosedürünü gösterir. SAN, spontan aksiyon potansiyelleri üreterek kalp atışını başlatan sinoatriyal hücreleri barındırır.

Fare Modelinden Sinoatriyal Düğüm İzolasyonu: Murin Kalbinden SA Düğümünü Hasat Etme Prosedürü

MRI taramaları (insan), 3D görüntüleme yazılımı ve immünohistolojik analiz kullanarak, beynin lateral ventriküllerindeki değişiklikleri belgeliyoruz. Lateral ventrikül hacim değişikliklerinin uzunlamasına 3D haritalanması ve yaşlanma veya hastalık nedeniyle insan beyninde meydana gelen periventriküler hücresel değişikliklerin karakterizasyonu daha sonra farelerde modellenir.

İnsanlar ve Mouse Periventriküler Doku Yanal ventrikülleri ve histolojik Karakterizasyonu 3D Modelleme

Yöntemler yama kelepçe elektrofizyoloji veya görüntüleme çalışmaları için yetişkin farelerin sinoatriyal düğüm miyosit (SAMs) izolasyonu için gösterilmiştir. İzole edilmiş hücreler, doğrudan kullanılabilir ya da bu tür genetik olarak kodlanmış muhabir olarak ilgi proteinlerin ekspresyonuna izin vermek için kültür içinde muhafaza edilebilir.

Yetişkin fareler ile Sinoatriyal Düğüm miyositlerin İzolasyonu, Kültür ve Fonksiyonel Karakterizasyonu Yöntemleri

Burada, bir yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlükte, farenin sağ atrium ve özellikle Çin-atriyal düğümden elektriksel aktivitenin optik haritalama için bir protokol mevcut.

Fare Çin-atriyal düğüm yüksek çözünürlüklü optik Haritalama

Burada, Bütün Dağı ayirt ve nicel hacimsel analizi erken sahne fare embriyo yansıma tabanlı bir protokol açıklayın. Bu teknik nitelik ve nicelik geliştirme sırasında kalp yapıları değerlendirmek ve diğer organ sistemleri yaygın olarak adapte olması teklif için güçlü bir yaklaşım olarak mevcut.

Nicel bütün Dağı ayirt analiz fare embriyo kardiyak progenitör nüfusun

Bu iletişim kuralı ile yüksek zamansal ve mekansal çözünürlüklü, membran gerilim çift kayıtları da dahil olmak üzere bir optik haritalama sistemi kullanan fare Kulakçık Elektrofizyolojik değerlendirme açıklar ve Ca2 + geçici altında programlanmış stimülasyon özel elektrot kateter aracılığıyla.

Yüksek çözünürlüklü optik eşleştirmenin fare Atria Elektrofizyolojik değerlendirme

Bu çalışmada optik takas ile kombine bir çift taraflı aydınlatma ışık sayfalık floresans mikroskobu (LSFM) fare kalp çalışmaya kullanmaktadır.

Fare kalp çalışma için ışık sayfalık floresans mikroskobu

Bu protokol, farelerdeki hız yapma kusurlarını tanımlamak için tüm sinoatriyal düğüm dokusunun mikroelekrod dizi kaydını kullanarak içsel kardiyak ateşleme hızını ölçmek için yeni bir metodoloji tanımlamayı amaçlamaktadır. Farmakolojik ajanlar, içsel tempo yapımı üzerindeki etkilerini incelemek için bu yöntemde de tanıtılabilir.

Farelerde İçSel Kardiyak Pacemaking Kusurlarını Belirlemek için Sinoatrial Düğüm Ateşleme Hızının Mikroelekrod Dizisi Kaydı

Doku transformasyonu ve boyamadaki yeni gelişmeleri eksenel olarak taranmış bir ışık tabakası mikroskobunun geliştirilmesiyle birleştirerek tüm fare kalbinin mezoskopik rekonstrüksiyonu için bir yöntem sunuyoruz.

Tüm Fare Kalbinin Mezoskopik Optik Görüntülenmesi

Bu protokol, murin pulmoner venlerinin mikroskopi kılavuzluğunda izolasyonunu ve immünofloresan boyamasını gösterir. Sol atriyum, pulmoner venler ve ilgili akciğerleri içeren doku örnekleri hazırlıyoruz ve bunları kardiyak Troponin T ve Connexin 43 için boyuyoruz.

Murin Pulmoner Venlerde Miyokard Kılıflarının Mikrodiseksiyonu ve İmmünofloresan Boyanması

Protokol, kemirgen kalplerindeki karmaşık kardiyak yapıları araştırmak için uyarlanmış doku temizleme yöntemleriyle birlikte gelişmiş ışık tabakası mikroskobunu kullanır ve kardiyak morfogenezin anlaşılması ve yeniden şekillenmesi için büyük bir potansiyele sahiptir.

Kemirgen kalplerinde kalp yapısını ortaya çıkarmak için ışıklı tabaka görüntüleme

Keşfedin fare kalbindeki sinoatriyal ve atriyoventriküler düğümlerin tam montajlı immünofloresan boyama, konfokal görüntüleme ve 3D rekonstrüksiyon yöntemlerini. Bu teknik dokuların morfolojisini koruyarak kardiyak düğümlerin üç boyutlu lokalizasyonunu incelemenizi sağlar.

Faredeki Sinoatriyal ve Atriyoventriküler Düğümün Tam Montajlı İmmünofloresan Boyama, Konfokal Görüntüleme ve 3D Rekonstrüksiyonu (Video) | JoVE Journal

Faredeki Sinoatriyal ve Atriyoventriküler Düğümün Tam Montajlı İmmünofloresan Boyama, Konfokal Görüntüleme ve 3D Rekonstrüksiyonu

Daha fazla video keşfet