Name: Işınlanmış Buffy Coatdan Besleyici Hücreler Kullanılarak T Lenfositlerin İzolasyonu ve Kültürü Yoluyla Aort Kapak Kireçlenmesinin Araştırılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 30 s
Description: Keşfedin, aort kapağı kireçlenmesinde T lenfositlerinin izolasyonu ve kültürü için besleyici hücrelerle klonlama yöntemini. Akış sitometrisi ile hücre alt gruplarını analiz ederek immün aktivasyonun rolünü açıklayın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu protokol için kullanılan tüm buffy palto çantaları, Dr. Peter Rosenthal, Dr. Dirk Böhmer ve Charité Benjamin Franklin Radyoloji Bölümü'nün tüm ekibinin mevcudiyeti sayesinde ışınlandı. Burs sahibi/Mary Roxana Christopher, bu çalışma Alman Kardiyak Derneği'nin (DGK) bursu ile desteklenmektedir.

Çalışma, İyi Bilimsel Uygulamanın Sağlanması için Charité Tüzüğü'ne göre yürütüldü ve gizlilik ve etikle ilgili yasal kılavuz ve hükümlere uyulur. Etik Kurul tüm insan deneylerini onaylamıştır ve hastaların mahremiyeti ve anonimliği Etik Form'da bildirilen kurallara uygun olarak sürdürülmektedir.
NOT: Aşağıda açıklanan protokol için taze insan stenotik kapak örnekleri kullanılmıştır.
1. Reaktif hazırlama
<ol><li>RPMI 1640 Medium: Non-esansiyel amino asitler ekleyerek zenginleştirilmiş RPMI komple ortamını hazırlayın; Sodyum Piruvat, L- Glutamin, ß-Mercaptoethanol ve Penisilin-Streptomisin (Pen/Strep). Kullanmadan önce filtreleyin. +4 °C'de saklayın ve iki ay içinde kullanın.</li>
	<li>Zenginleştirilmiş RPMI 1640 komple orta ilave fetal sığır serumu (FBS), HB bazal orta, 50 U Interlökin 2 (IL-2) ve İnsan Serumu (HS) kullanarak klonlama aşaması için hücre kültürü ortamını (CCM) hazırlayın. Gün içinde filtreleyin ve kullanın. Saklamayın.</li>
	<li>Eklenen FBS, HB bazal ortam, 30 U IL-2 ve HS ile zenginleştirilmiş RPMI 1640 komple ortamını kullanarak hücre kültürü ortamını yeniden besleme aşamasına hazırlayın. Gün içinde filtreleyin ve kullanın. Saklamayın.</li>
	<li>250 mL RPMI ve 5 mL Pen/Strep içeren yıkama tamponu hazırlayın. +4 °C'de saklayın, iki ay içinde kullanın.</li>
</ol>2. T-25 şişelerine insan T lenfosit izolasyonu ve kültürü
<ol><li>Stenotik valf örneğini Yıkama Tamponu ile dolu steril bir Petri kabına yerleştirin ve tüm valf örneğinin bununla kaplı olmasını sağlayın. 15 dakika bekletin.</li>
	<li>Stenotik vanayı neşter kullanarak küçük parçalar halinde kesin ve 10 dakika boyunca tekrar bekletin.</li>
	<li>Hücre kültürü ortamını daha önce açıklandığı gibi 50 U il-2 ile hazırlayın ve filtreleyin.</li>
	<li>CCM'yi T25 şişelerinin içine ekleyin ve steril bir plastik plier kullanarak valf parçalarını şişelerin içine yerleştirin.</li>
	<li>Şişeleri bir hafta boyunca bir CO2 inkübatörü içinde dikey bir konumda saklayın ve mikroskop altında şişenin durumunu gözlemlemeye dikkat edin. T hücre klonları kültür adımından yaklaşık üç gün sonra görünmelidir; daha iyi gözlem için şişelerin mikroskobik analizden önce 20 dakika boyunca yatay konuma yerleştirilmesi tavsiye edilir. NOT: Hücre kültürü ortamının miktarı, mevcut numune miktarına ve kaç adet T25 şişesi kullanılacağına bağlıdır. Her bir valf parçasının bir şişenin içinde 10 mL CCM gerektirdiği göz önüne alındığında, bir T25 şişesinde 25 mL CCM, 3 adet valf için uygundur.</li>
</ol>3. Klonlama aşaması
NOT: T hücrelerinin klonlama aşaması için, PBMCs protokolünü izleyerek besleyici hücrelerin ışınlanmış bir buffy coat'dan (BC) izolasyonu ile başlamak gerekir.
<ol><li>İğnesiz valfli torba çivisini kullanarak laminar akış başlığının altındaki BC torbasını açın ve bir T150 şişesinde 50 mL kan aktarın. Şişenin içindeki kanı seyreltmek için 70 mL PBS ekleyin.</li>
	<li>Dört 50 mL konik tüp alın ve her birine 20 mL yoğunluk gradyanı ortamı yerleştirin ve üzerine 30 mL kanı dikkatlice katlayın.</li>
	<li>Freni kapalıyken 800 x g ve 20 °C'de 25 dakika santrifüj.</li>
	<li>Süpernatantı dikkatlice emiş ve atık olarak atın. PBMC'leri PBS çözeltisinin içine 50ml hacme kadar ekleyerek yeni bir 50ml konik tüpte halkalayın.</li>
	<li>400 x g ve 20 °C'de 10 dakika santrifüj.</li>
	<li>Üstnatantı atın ve PBS çözeltisinin içine 50 mL hacme kadar ekleyerek peleti askıya alın. Santrifüjleme aşamasını 400 x g ve 20 °C'de 10 dakika boyunca tekrarlayın.</li>
	<li>Üstnatant atın ve 10 mL hücre kültürü ortamında FC'leri askıya alın.</li>
	<li>Yeni bir toplama tüpü alın ve FC'ler ve hücre kültürü ortamı ile tüpten 9,9 mL PBS ve 100 μL'nin içine ekleyerek FC'leri PBS 1:10 ile seyreltin. Bir pipetle iyi durulayın ve bu seyreltmeden 7 μL alın ve hücreleri mikroskop altında sayın.</li>
	<li>Klonlama aşaması için hücre kültürü ortamını hazırlayın: 50 U IL-2 ile 70 mL ve ardından iki 50 mL konik tüpe bölün, her tüp aşağıda açıklanacağı gibi 25 mL hücre kültürü ortamı içerecektir:<ul style="list-style-type: disc;">
<li>Tüp 1: 25 mL CCM + FCs + fitohemagglutinin %0,6'sı (PHA)</li>
		<li>Tüp 2: 25 mL CCM + T lenfositler NOT: PMBC'ler yönteminin amacı her mL için 2 x 106 hücre elde etmektir, bu nedenle hazırlanan 25 mL CCM'nin (Tüp 1) buna göre hesaplanması gerekir. Kullanılan genel formül: Sayılan hücre sayısı x 106: 1 mL = CCM x 106: X</li>
	</ul>
</li>
</ol>4. Çok katlı plakalarda T Lenfosit kültürü
<ol><li>Elektronik pipeti kullanarak, şişelerin içindeki tüm hücre kültürü ortamını toplayın ve 50 mL konik bir tüpe aktarın. Boş şişeler atılabilir.</li>
	<li>Hücreleri 400 x g ve 20 °C'de 10 dakika santrifüjleme ile peletle.</li>
	<li>Süpernatantı atın, peleti 50 mL PBS'de askıya alın ve hücreleri 400 x g ve 20 °C'de 10 dakika santrifüjleme ile toplayın. Bu adımı iki kez yineleyin.</li>
	<li>Süpernatantı atın ve peletin 1 mL CCM'de askıya alın. Bu seyreltmeden 7 μL alın ve hücreleri mikroskop altında sayın. NOT: Odanın hacmi ve seyreltme uygulanması için sayılan hücre sayısının çoğaltılması gerekir.</li>
	<li>Hücre kültürü ortamında 105'ten 103'e kadar sayılan hücreleri seyreltmeye devam edin ve ardından 103'ten 500 μL alın ve Tüp 2'nin içine koyun.</li>
	<li>Tüp 1'in 25 mL hücre kültürü ortamını 100 mm x 15 mm plastik Petri kabının içine dökün.</li>
	<li>Dört 96-U alt multiwell plaka alın ve her kuyuda 100 μL tohum FC'lerine ayarlanmış çok kanallı bir pipet kullanın.</li>
	<li>Tüp 2'yi alın ve hücre kültürü ortamını bir Petri kabının içine dökün. 100 μL'ye ayarlanmış çok kanallı bir pipet kullanarak, her kuyuda T hücrelerini tohumlamak.</li>
	<li>Multiwell plakalarını bir hafta boyunca bir CO2 inkübatöründe saklayın.</li>
</ol>5. İlk yeniden besleme aşaması
<ol><li>Işınlanmış buffy ceket çantası kullanarak, önceki yöntemde açıklandığı gibi FC'leri elde etmek için PBMC yöntemini izleyin.</li>
	<li>PHA olmadan uygun miktarda CCM hazırlayın ve filtreleyin.</li>
	<li>Çok kanallı bir pipet kullanarak, her kuyudan 100 μL çıkarın ve kuyunun dibine dokunmamaya dikkat edin.</li>
	<li>Hücre kültürü besinlerini sağlamak ve ortamı değiştirmek için tüm kuyulara bir besleme katmanı olarak 100 μL FC ekleyin. NOT: Her multiwell için 6 mL CCM'yi göz önünde bulundurmanız önerilir, bu nedenle 4 çokluwell için önerilen miktar yaklaşık 30 mL'dir. PHA'nın (toplam CCM miktarının %0,4'ü) ccm'ye iki haftada bir eklenmesi gerekir.</li>
</ol>6. İkinci yeniden besleme aşaması
<ol><li>Yukarıda açıklanan pasajı takiben yeniden besleme aşamasını tekrarlayın. Hücre kültürü ortamına %0,4 PHA eklenmesi gerekir.</li>
</ol>7. İlk bölme aşaması 1 kuyu / numuneden 2 kuyuya / numuneye
<ol><li>Mikroskop altındaki dört çoklu boşluğun tümünde kontrol edin ve bu kuyuları T hücre klonları (TCC' ler) ile bölmeye devam edin.</li>
	<li>Besleyici hücrelerini ışınlanmış buffy ceket torbasından izole etmek için PBMCs protokolünü izleyin.</li>
	<li>Hücre kültürü ortamını 30 U il-2 ile hazırlayın. IC'leri ekleyin ve U altlı yeni bir 96 kuyulu çoklu plaka alın.</li>
	<li>100 μL'ye ayarlanmış bir pipet kullanarak, seçilen numunelerin kuyularının içinde iyice durulayın ve her kuyuda bulunan 200 μL hacmi, yeni 2 kuyunun her biri için 100 μL hacme sahip olmak için yeni çok kuyulu plakanın 2 yeni kuyusuna bölün.</li>
	<li>Tüm yeni kuyuların içine 100 μL IC ekleyin. Her kuyu toplam 200 μL hacim içermelidir.</li>
	<li>Pipet 100 μL'ye ayarlayın ve kontrol görevi görmek için yalnızca FC'ler içeren ek iki kuyuya 100 μL ekleyin. NOT: TTK'yı hangi kuyuların başarıyla büyüttüğini belirlemek için tüm çok katlı plakaları gözlemlemek için hafif mikroskopi kullanın. Klonların seçimini kolaylaştırmak için, denetime (yalnızca DC'ler içeren iki kuyu) bir karşılaştırma yapılabilir ve klon denetime kıyasla daha koyu ve daha büyük görünür. Seçilecek kuyular, lenfositlerin yoğun bir şekilde bir araya toplanmış olduğu büyük, net, yuvarlak bir klona sahip olanlardır. İki haftalık yeniden beslemeden sonra TCC yoksa, bir hafta daha beklemeniz ve ek bir yeniden besleme aşaması gerçekleştirmeniz önerilir.</li>
</ol>8. 2 kuyudan/ numuneden 4 kuyuya / numuneye ikinci bölme aşaması
<ol><li>Pipet 100 μL'ye ayarlayın, her numunenin iki kuyusunun içinde iyice durulayın ve her biri için 100 μL'lik iki yeni kuyuyu tohumlayın.</li>
	<li>Hücre kültürü ortamını 30 U IL-2 ile hazırlayın ve IC'leri buffy ceket torbasından çıkarmak ve IC'leri CCM'nin içine yerleştirmek için PBMC tekniğini izleyin.</li>
	<li>Pipet 100 μL'ye ayarlayın ve FC'leri tüm kuyulara tohumlayın. Multiwells bir hafta boyunca bir CO2 inkübatörde saklayın.</li>
</ol>9. 4 kuyudan/ numuneden 8 kuyuya / örneğe üçüncü bölme aşaması:
<ol><li>100 μL'ye ayarlanmış çok kanallı bir pipet kullanarak, her numunenin dört kuyusunun içinde iyice durulayın ve 100 μL'lik tohumu yeni bir 96 kuyu plakasında dört yeni kuyunun her birine durulayın.</li>
	<li>Hücre kültürü ortamını hazırlayın ve FC'leri ışınlanmış bir buffy ceket çantasından çıkarmak için PBMC'ler tekniğini izleyin.</li>
	<li>IC'leri CCM'nin içine yerleştirin. Pipet 100 μL'ye ayarlayın ve FC'leri tüm kuyulara tohumlayın. Multiwells'i bir hafta boyunca bir CO2 inkübatörde saklayın</li>
</ol>10. Sitofluorimetrik analiz
<ol><li>CO2 inkübatöründen en eski tarihe sahip multiwell plakasını alın ve analiz etmek için numune numaralarıyla toplama tüplerini tanımlayın.</li>
	<li>2 uçlu 200 μL'ye ayarlanmış çok kanallı bir pipet kullanarak, aynı numunenin iki kuyusunun içini iyice durulayın ve her ikisini de aynı toplama tüpünün içine koyun. Tüm örnekler için bu adımı yineleyin. NOT: PCC örnekleri yalnızca kontrol görevi gördükleri için analiz edilmeyecektir.</li>
</ol>11. Sitofluorimetrik analiz için Antikor Boyama Paneli Hazırlama
<ol><li>Her tüp için 1 mL PBS çözeltisi ve 400 x g ve 20 °C'de 10 dakika santrifüj ekleyin.</li>
	<li>Santrifüjleme aşamasından sonra süpernatantı atın. NOT: Antikor boyama paneli Tablo 1'de bulunabilir. Hesaplanan her bir antikor konsantrasyonu yaklaşık 2 μL/numunedir. Kullanmadan önce antikor tüplerinin kısa bir süre dönmesi önerilir. Floroforla konjuge edilen antikorları ışıktan korumak için tüm adımlar karanlıkta yapılmalıdır.</li>
	<li>Antikor karışımını 1,5 mL'lik bir tüpün içine hazırlayın ve girdaplayın.</li>
	<li>Antikorları numunelerin içine ekleyin ve numuneleri 15 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta kuluçkaya bırakın.</li>
	<li>Her numuneye 1 mL PBS ekleyin ve 400 x g ve 20 °C'de 10 dakika santrifüj ekleyin.</li>
	<li>Süpernatant atın ve peleti 500 μL PBS çözeltisi ile askıya alın.</li>
	<li>Sitofluorimetrik analize devam edin (FACS analizi, Tablo 1). NOT: Lekeli numuneler PBS çözeltisinde seyreltilmiş %0,5 paraformaldehit (PFA) kullanılarak sabitlenebilir ve 15 gün sonrasına kadar analiz edilebilir. DİkKAT: PFA toksiktir ve dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Işaretleyici</td>
			<td>Florofor</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>PE/Cy7</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4</td>
			<td>Alexa Flor 488</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8</td>
			<td>Parlak menekşe 510</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD14</td>
			<td>Parlak menekşe 421</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD25</td>
			<td>PE</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>Parlak menekşe 711</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1. Kireçlenme aort kapak hastalığında T lenfosit popülasyonunun saptaması için antikor boyama paneli.

<ol><li>Nkomo, V. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+valvular+heart+diseases%3A+a+population-based+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Burden of valvular heart diseases: a population-based study.</a> Lancet. 368 (9540), 1005-1011 (2006).</li>
<li>Clavel, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+aortic+valve+calcification%2C+as+measured+by+MDCT%2C+on+survival+in+patients+with+aortic+stenosis%3A+results+of+an+international+registry+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Impact of aortic valve calcification, as measured by MDCT, on survival in patients with aortic stenosis: results of an international registry study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 64 (12), 1202-1213 (2014).</li>
<li>Rosenhek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictors+of+outcome+in+severe%2C+asymptomatic+aortic+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Predictors of outcome in severe, asymptomatic aortic stenosis.</a> The New England Journal of Medicine. 343 (9), 611-617 (2000).</li>
<li>Alushi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+Hypertension+in+Patients+With+Severe+Aortic+Stenosis%3A+Prognostic+Impact+After+Transcatheter+Aortic+Valve+Replacement%3A+Pulmonary+Hypertension+in+Patients+Undergoing+TAVR%5BTitle%5D)+AND+%22JACC%3A+Cardiovascular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Pulmonary Hypertension in Patients With Severe Aortic Stenosis: Prognostic Impact After Transcatheter Aortic Valve Replacement: Pulmonary Hypertension in Patients Undergoing TAVR.</a> JACC: Cardiovascular Imaging. 12 (4), 591-601 (2019).</li>
<li>Figulla, H. R., Franz, M., Lauten, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+History+of+Transcatheter+Aortic+Valve+Implantation+%28TAVI%29-A+Personal+View+Over+25+Years+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Revascularization+Medicine%22%5BJournal%5D)">The History of Transcatheter Aortic Valve Implantation (TAVI)-A Personal View Over 25 Years of development.</a> Cardiovascular Revascularization Medicine. 21 (3), 398-403 (2020).</li>
<li>Lauten, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAVI+for+low-flow%2C+low-gradient+severe+aortic+stenosis+with+preserved+or+reduced+ejection+fraction%3A+a+subgroup+analysis+from+the+German+Aortic+Valve+Registry+%28GARY%29%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+Intervention+Journal%22%5BJournal%5D)">TAVI for low-flow, low-gradient severe aortic stenosis with preserved or reduced ejection fraction: a subgroup analysis from the German Aortic Valve Registry (GARY).</a> Euro Intervention Journal. 10 (7), 850-859 (2014).</li>
<li>Mirna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-biomarker+analysis+in+patients+after+transcatheter+aortic+valve+implantation+%28TAVI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarkers%22%5BJournal%5D)">Multi-biomarker analysis in patients after transcatheter aortic valve implantation (TAVI).</a> Biomarkers. 23 (8), 773-780 (2018).</li>
<li>Wernly, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcatheter+aortic+valve+replacement+for+pure+aortic+valve+regurgitation%3A+%22on-label%22+versus+%22off-label%22+use+of+TAVR+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Transcatheter aortic valve replacement for pure aortic valve regurgitation: "on-label" versus "off-label" use of TAVR devices.</a> Clinical Research in Cardiology. 108 (8), 921-930 (2019).</li>
<li>Wernly, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcatheter+valve-in-valve+implantation+%28VinV-TAVR%29+for+failed+surgical+aortic+bioprosthetic+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Transcatheter valve-in-valve implantation (VinV-TAVR) for failed surgical aortic bioprosthetic valves.</a> Clinical Research in Cardiology. 108 (1), 83-92 (2019).</li>
<li>Mathieu, P., Bouchareb, R., Boulanger, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+and+Adaptive+Immunity+in+Calcific+Aortic+Valve+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Innate and Adaptive Immunity in Calcific Aortic Valve Disease.</a> Journal of Immunology Research. 2015, 851945(2015).</li>
<li>Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcific+Aortic+Valve+Disease%3A+Molecular+Mechanisms+and+Therapeutic+Approaches%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Calcific Aortic Valve Disease: Molecular Mechanisms and Therapeutic Approaches.</a> European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).</li>
<li>Olsson, M., Thyberg, J., Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+oxidized+low+density+lipoprotein+in+nonrheumatic+stenotic+aortic+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Presence of oxidized low density lipoprotein in nonrheumatic stenotic aortic valves.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 19 (5), 1218-1222 (1999).</li>
<li>Mazzone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-lymphocyte+infiltration%2C+and+heat+shock+protein-60+are+biological+hallmarks+of+an+immunomediated+inflammatory+process+in+end-stage+calcified+aortic+valve+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">T-lymphocyte infiltration, and heat shock protein-60 are biological hallmarks of an immunomediated inflammatory process in end-stage calcified aortic valve stenosis.</a> Journal of the American College of Cardiology. 43 (9), 1670-1676 (2004).</li>
<li>Wu, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lymphocytic+Infiltration+in+Calcific+Aortic+Stenosis+Predominantly+Consists+of+Clonally+Expanded+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Lymphocytic Infiltration in Calcific Aortic Stenosis Predominantly Consists of Clonally Expanded T Cells.</a> The Journal of Immunology. 178 (8), 5329-5339 (2007).</li>
<li>Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+immune+cells+in+calcific+aortic+valve+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 317 (1), 141-155 (2009).</li>
<li>Galkina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+recruitment+into+the+aortic+wall+before+and+during+development+of+atherosclerosis+is+partially+L-selectin+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203 (5), 1273-1282 (2006).</li>
<li>Poursaleh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+intimal+endothelial+cells+from+the+human+thoracic+aorta%3A+Study+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+journal+of+the+Islamic+Republic+of+Iran%22%5BJournal%5D)">Isolation of intimal endothelial cells from the human thoracic aorta: Study protocol.</a> Medical journal of the Islamic Republic of Iran. 33, 51(2019).</li>
<li>Yun, T. J., Lee, J. S., Shim, D., Choi, J. H., Cheong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Aortic+Dendritic+Cells+and+Lymphocytes+in+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methodsin+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Aortic Dendritic Cells and Lymphocytes in Atherosclerosis.</a> Methodsin Molecular Biology. 11559, 419-437 (2017).</li>
<li>Adams, N. M., Grassmann, S., Sun, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+expansion+of+innate+and+adaptive+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Clonal expansion of innate and adaptive lymphocytes.</a> Nature Reviews Immunology. 20 (11), 694-707 (2020).</li>
<li>Amedei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+tumor+antigen+peptide-specific+T+cells+isolated+from+the+neoplastic+tissue+of+patients+with+gastric+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+%26+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Characterization of tumor antigen peptide-specific T cells isolated from the neoplastic tissue of patients with gastric adenocarcinoma.</a> Cancer Immunology & Immunotherapy. 58 (11), 1819-1830 (2009).</li>
<li>Niccolai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-tumoral+IFN-gamma-producing+Th22+cells+correlate+with+TNM+staging+and+the+worst+outcomes+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Science+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Intra-tumoral IFN-gamma-producing Th22 cells correlate with TNM staging and the worst outcomes in pancreatic cancer.</a> Clinical Science (London). 130 (4), 247-258 (2016).</li>
<li>Niccolai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Different+Functional+Distribution+of+%22Not+Effector%22+T+Cells+%28Treg%2FTnull%29+in+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The Different Functional Distribution of "Not Effector" T Cells (Treg/Tnull) in Colorectal Cancer.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1900(2017).</li>
<li>Llames, S., Garcia-Perez, E., Meana, A., Larcher, F., del Rio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeder+Layer+Cell+Actions+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">Feeder Layer Cell Actions and Applications.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 21 (4), 345-353 (2015).</li>
<li>Ponchio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitomycin+C+as+an+alternative+to+irradiation+to+inhibit+the+feeder+layer+growth+in+long-term+culture+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Mitomycin C as an alternative to irradiation to inhibit the feeder layer growth in long-term culture assays.</a> Cytotherapy. 2 (4), 281-286 (2000).</li>
<li>Delso-Vallejo, M., Kollet, J., Koehl, U., Huppert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Irradiated+Peripheral+Blood+Mononuclear+Cells+on+Both+Ex+Vivo+Proliferation+of+Human+Natural+Killer+Cells+and+Change+in+Cellular+Property%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Influence of Irradiated Peripheral Blood Mononuclear Cells on Both Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells and Change in Cellular Property.</a> Frontiers in Immunology. 8, 854(2017).</li>
<li>Amedei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mimicry+between+Helicobacter+pylori+antigens+and+H%2B%2C+K%2B+--adenosine+triphosphatase+in+human+gastric+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Molecular mimicry between Helicobacter pylori antigens and H+, K+ --adenosine triphosphatase in human gastric autoimmunity.</a> Journal of Experimental Medicine. 198 (8), 1147-1156 (2003).</li>
<li>Lienhardt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+tuberculosis+in+Africa+is+associated+with+reduced+Th1+and+increased+Th2+activity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Active tuberculosis in Africa is associated with reduced Th1 and increased Th2 activity in vivo.</a> European Journal of Immunology. 32 (6), 1605-1613 (2002).</li>
<li>Benagiano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydophila+pneumoniae+phospholipase+D+%28CpPLD%29+drives+Th17+inflammation+in+human+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chlamydophila pneumoniae phospholipase D (CpPLD) drives Th17 inflammation in human atherosclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1222-1227 (2012).</li>
<li>Benagiano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+60-kDa+heat+shock+protein+is+a+target+autoantigen+of+T+cells+derived+from+atherosclerotic+plaques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human 60-kDa heat shock protein is a target autoantigen of T cells derived from atherosclerotic plaques.</a> Journal of Immunology. 174 (10), 6509-6517 (2005).</li>
<li>Benagiano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+helper+type+1+lymphocytes+drive+inflammation+in+human+atherosclerotic+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Procceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">T helper type 1 lymphocytes drive inflammation in human atherosclerotic lesions.</a> Procceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6658-6663 (2003).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada akış sitometrisi kullanarak stenotik aort kapak örneklerinden izole edilmiş T lenfosit subpopulasyonlarını karakterize etmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, PBMC'leri izole etmek için ışınlanmış buffy coat kullanılmasını gerektirir. Buffy ceket torbalarının tabi tutulması gereken radyasyon frekansı 9000 Rad/90 Gridir (Gy) ve besleyici hücrelerin çoğalmasını durdurmak için çok önemli bir adımı temsil eder. Buffy ceket torbalarından izole edilen hücrelerin rolü, sadece besleyici hücreler olarak hareket etmek v...

Kalsfik aort kapak hastalığı (CAVD), sağlık hizmetleri üzerinde ağır bir etkisi olan en yaygın kalp kapak hastalıklarından biridir. Son yıllarda aort kapak değişimi sıklığı önemli ölçüde artmıştır ve artan yaşlı nüfus nedeniyle daha da artması beklanmaktadır1.
CAVD'nin alttaki patofizyolojisi sadece kısmen bilinmektedir ve mevcut terapötik stratejiler cerrahi veya perkütan prosedürler yoluyla konservatif önlemler veya aort kapak değişimi ile sınırlıdır. Bugüne kadar, aort kapak değişimi (AVR) yapılmadıkça, etkili hiçbir tıbbi tedavi CAVD ilerlemesini engelleyemez veya tersine çeviremez ve yüksek mortalite erken semptom başlangıcı ile ilişkilidir2. Şiddetli semptomatik aort darlığı olan hastalarda 3 yıllık semptomsuz sağkalım %20 3 gibi düşük bir oranın olduğu bildirilmiştir. Transktheter aort kapak replasmanı (TAVR), özellikle yaşlılar arasında yüksek riskli hastalar için tedavide devrim yapan ve bu popülasyonda özünde yüksek olan mortaliteyi önemli ölçüde azaltan yeni bir seçeneği temsil eder4,5,6. TAVR'ın umut verici sonuçlarına rağmen, yeni erken terapötik hedefleri belirlemek için CAVD patofizyolojisini anlamak için daha fazla araştırma yapılması gerekmektedir7,8,9.
Daha önce pasif, dejeneratif bir süreç olduğu düşünülen CAVD, şimdi aort kapak interstisyel hücrelerinin osteoblastik fenotip anahtarı ile karakterize aktif bir ilerleyici hastalık olarak kabul edilmektedir10. Bu hastalık progresif mineralizasyon, fibrokalsifik değişiklikler ve aort kapaklarının (skleroz) azlığı içerir, bu da sonuçta aort kapak açıklığının daralmasına (darlığına) yol açan kan akışını engeller11.
İnflamasyon, vasküler ateroskleroz sürecine benzer şekilde CAVD patofizyolojisinde önemli bir süreç olarak kabul edilir. Endotel yaralanması lipid türlerinin, özellikle de aort kapakçığında oksitlenmiş lipoproteinlerin birikmesini ve birikmesini sağlar12. Bu oksitlenmiş lipoproteinler, mineralizasyona yol açan enflamatuar aktivite ile sitotoksik oldukları için enflamatuar bir tepkiye neden olan bir inflamatuar yanıta nedendir. CAVD gelişiminde ve hastalığın ilerlemesinde doğuştan gelen ve adaptif bağışıklığın rolü son zamanlarda vurgulanmıştır13. Bellek T hücrelerinin belirli alt kümelerinin aktivasyonu ve klonal genişlemesi CAVD ve mineralize aort kapak broşürleri olan hastalarda belgelenmiştir, böylece enflamatuar süreçlerin en azından CAVD gelişiminde ve muhtemelen hastalığın ilerlemesinde rol aldığı varsayılmıştır14. Aslında, hem sağlıklı hem de hastalıklı kapakta antijen sunan hücreler ve makrofajlar mevcut olmasına rağmen, T lenfositlerinin varlığı yaşlı ve hastalıklı bir aort kapakçığının göstergesidir. Bu lenfositik infiltrat, neovaskülarizasyon ve metaplazideki artışla birlikte CAVD15'in karakteristik histolojik belirtileridir.
Aort kapak kesişim hücreleri ile bağışıklık sisteminin aktivasyonu arasında bir etkileşimin varlığını hipotez ediyoruz, bu da aort kapakta kronik bir enflamatuar sürecin başlatılmasını potansiyel olarak tetikliyor. T hücrelerinin stenotik aort kapak dokusundan test edilmesi, aort kapak hücrelerinin in vivo olarak yakından temsil edilmesini sağlayabildiğinden, kireçlenme gelişimindeki rollerini netleştirmenin etkili bir yolu olabilir. Mevcut çalışmada, aort kapak dokusunu kullanarak, T-lenfositleri izole ediyoruz, kültürlüyoruz ve klonlıyoruz ve daha sonra floresanla aktive edilmiş hücre sıralamasını (FACS) kullanarak karakterize ediyoruz. Şiddetli aort darlığı için cerrahi kapak değişimi alan CAVD hastalarından taze aort kapak örnekleri çıkarıldı. Cerrahi eksizyondan sonra, taze kapak örneği küçük parçalar halinde parçalandı ve T hücreleri kültürlendi, klonlandı ve akış sitometrisi kullanılarak analiz edildi. Boyama işlemi basittir ve lekeli tüpler paraformaldehitin% 0.5'i kullanılarak sabitlenebilir ve 15 gün sonrasına kadar analiz edilebilir. Boyama panelinden oluşturulan veriler, müdahale ile ilgili olarak zaman içinde T lenfosit dağılımındaki değişiklikleri izlemek için kullanılabilir ve belirli T hücresi alt kümelerinin aktivasyon durumlarını değerlendirmek için kolayca geliştirilebilir.
Kireçlenmiş dokunun çıkarılması, lökositlerin kireçlenmiş dokudan izolasyonu ve özellikle bu tür dokularda akış sitometrisinin kullanılması, otoflüoresans gibi sorunlar nedeniyle zor olabilir. Bu özel amaç için protokollerle çok az yayın var16,17,18. Burada, insan aort kapak örneklerinden T lenfositin doğrudan izolasyonu ve kültürü için özel olarak tasarlanmış bir protokol sunuyoruz. Lenfositlerin klonal genişlemesi adaptif bağışıklığın ayırt edici bir özelliğidir. Bu sürecin in vitro olarak incelenmesi lenfosit heterojenliği seviyesi hakkında içgörülü bilgiler sağlar19. Üç haftalık bir kuluçka süresinden sonra, fenotipik ve fonksiyonel çalışmaya izin vermek için her klondan yeterli miktarda T hücresi elde edildiği için T hücre klonları ekilmeye hazırdır. Daha sonra T klonlarının fenotipi sitoflorometri ile incelenir.
Bu immünolojik protokol, amedei ve arkadaşları tarafından daha önce T hücre izolasyonu ve insan dokusundan karakterizasyon için geliştirilen, özellikle CAVD20,21,22 gibi kireçlenmiş insan dokusu için tasarlanmış bir yöntemin adaptasyonudur. Işınlanmış buffy coat kullanılarak PBMC'lerin (periferik kan mononükleer hücreleri) izolasyonu için buradaki protokol, kapak geçiş hücrelerinden izole edilen T lenfositlerinin klonlama aşaması için özel olarak ayarlanmış besleyici hücreler (FC) elde etmenin etkili bir yolunu açıklar. Besleyici tabaka, hala canlı ve biyoaktif olan büyüme tutuklanığı hücrelerinden oluşur. Besleyici hücrelerin rolü, kapak geçiş hücrelerinden izole edilmiş T lenfositlerinin in vitro sağkalımını ve büyümesini desteklemek için önemlidir23. Kültürde besleyici hücre çoğalmasını önlemek için, bu hücrelerin büyüme hapsine tabi tutulması gerekir. Bu iki şekilde elde edilebilir: ışınlama gibi fiziksel yöntemlerle veya doğrudan kültür yüzeyine uygulanabilen bir antitümöral antibiyotik olan mitomisin C (MMC) gibi sitotoksik kimyasallarla tedavi yoluyla24. Burada hücre ışınlama yoluyla elde edilen besleyici hücre büyümesi tutuklaması gösteriyoruz.
Bu yöntem, T hücrelerini aort kapak dokusundan izole etmek ve karakterize etmek için etkili, uygun maliyetli bir yol sunarak CAVD patofizyolojisini keşfetmek için immünolojik yöntemlerin spektrumunun genişletilmesine katkıda bulunur.

<table><tbody><tr><td>50 mL plastik şırınga</td><td>Fisherbrand</td><td>9000701</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu U-dipli Çok kuyulu plakalar</td><td>Greiner Bio-One</td><td>10638441</td><td></td></tr><tr><td>Torba Spike (iğnesiz)</td> <td>Sigma</td><td>P6148</td> PBS CD14 <td>ile %4'e seyreltin</td></tr><tr><td>Parlak menekşe 421</td><td>&nbsp; Biolegend</td><td>560349</td><td></td></tr><tr><td>CD25 PE&</td><td>nbsp; Biolegend</td><td>302621</td><td></td></tr><tr><td>CD3 PE / Cy7</td><td>&nbsp; Biolegend</td><td>300316</td><td></td></tr><tr><td>CD4 Alexa Fluor 488</td><td>&nbsp; Biolegend</td><td>317419</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Parlak menekşe 711</td><td>&nbsp; Biolegend</td><td>304137</td><td></td></tr><tr><td>CD8 Parlak menekşe 510</td><td>&nbsp; Biolegend</td><td>301047</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tüpü 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>13094697</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tüpü 0.5 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0533</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL konik santrifüj tüpü</td><td>Falcon</td><td>10136120</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL konik santrifüj tüpleri</td><td>Falcon</td><td>10788561</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Yuvarlak Tabanlı Polistiren Tüpler</td><td>BD</td><td>2300E</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı okuma 102 plastik sayma haznesi</td><td>KOVA INTERNATIONAL</td><td>630-1893</td><td></td></tr><tr><td>Kültür ortamı için filtreler 250 mL</td><td>NalgeneThermo Fisher Scientific</td><td>168-0045</td><td></td></tr><tr><td>Kültür ortamı için filtreler 500 mL</td><td>NalgeneThermo Fisher Scientific</td><td>166-0045</td><td></td></tr><tr><td>HB 101 Liyofilize Takviye Edici Gıda</td><td>Irvine Scientific</td><td>T151</td><td></td></tr><tr><td>HB Bazal Orta</td><td>Irvine Scientific</td><td>T000</td><td></td></tr><tr><td>Isı ile İnaktive Edilmiş FBS (Fetal Sığır Serumu)</td> <td>Euroclone</td><td>ECS0180L</td><td></td></tr><tr><td>HS (İnsan serumu)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>H3667</td><td></td></tr><tr><td>İnsan IL-2 IS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-744</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Lenforep</td><td>Şahin</td><td>352057</td><td></td></tr><tr><td>Esansiyel olmayan amino asit çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>11082132001</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10538931</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Fosfat tamponlu salin)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Gibco</td><td></td><td>15070063 10000 U / mL</td></tr><tr><td>PHA (fitohemaglutinin)</td> <td>Kök Hücre Teknolojiler</td><td>7811</td><td></td></tr><tr><td>Plastik Petri kapları</td><td>Thermo Scientific</td><td>R80115TS</td><td>10 0mm x 15 mm</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medya</td><td>HyClone</td><td>15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>Gibco by Life teknolojileri</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga Filtreleri 0,45 mikro; l</td><td>Rotilabo-Spritzenfilter</td><td>P667.1</td><td></td></tr><tr><td>T-25 Hücre kültürü şişeleri</td><td>InvitrogenThermo Fisher Scientific</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>T-75 Hücre kültürü şişesi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10232771</td><td></td></tr><tr><td>&beta;- Merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>A2916801</td><td></td></tr></tbody></table>

işınlanmış buffy coat'dan besleyici hücreler kullanılarak t lenfositlerin İzolasyonu ve kültürü yoluyla aort kapak kireçlenmesinin araştırılması

Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat

Kapakçığın hafif kalınlaşmasından şiddetli kireçlenmeye kadar uzanan aktif bir hastalık süreci olan kalsfik aort kapak hastalığı (CAVD), transktheter aort kapak replasmanı (TAVR) gibi yeni terapötik seçeneklere rağmen yüksek mortalite ile ilişkilidir. 
Kapak kireçlenmesi ile başlayan ve şiddetli aort darlığı ile yol açan tüm yollar sadece kısmen anlaşılmaktadır. Aort kapak hücrelerinin in vivo olarak yakından temsil edilmesini sağlayarak, T lenfositlerinin stenotik kapak dokusundan test edilmesi, kireçlenme gelişimindeki rollerini netleştirmenin etkili bir yolu olabilir. Cerrahi eksizyondan sonra, taze aort kapak örneği küçük parçalar halinde parçalara ayrılır ve T lenfositleri kültürlenir, klonlanır ve floresan aktif hücre sıralama (FACS) kullanılarak analiz edilir.
Boyama işlemi basittir ve lekeli tüpler paraformaldehitin% 0.5'i kullanılarak sabitlenebilir ve 15 gün sonrasına kadar analiz edilebilir. Boyama panelinden elde edilen sonuçlar, müdahale ile ilgili olarak zaman içinde T hücre konsantrasyonlarındaki değişiklikleri izlemek için kullanılabilir ve belirli T hücresi alt türlerinin aktivasyon durumlarını değerlendirmek için kolayca geliştirilebilir. Bu çalışmada, CAVD patofizyolojisinde adaptif bağışıklığın rolünü daha iyi anlamak için taze kireçlenmiş aort kapak örnekleri üzerinde gerçekleştirilen T hücrelerinin izolasyonunu ve akış sitometrisi kullanarak T hücre klonlarının analiz edilmesinin adımlarını gösteriyoruz.

Şiddetli aort kapak darlığı olan insan hastalardan elde edilen taze aort kapak örneklerinin lökosit popülasyonu karakterize etmek için basit ve uygun maliyetli bir yöntem kullandık (protokole bakın). PBMC'leri izole etme yöntemi, deneyin her adımında (klonlama, yeniden besleme ve bölme aşamaları) kullanılan besleyici hücrelerin elde edilmesinde hayati bir adımdır ve aort valf örneklerinde lökositlerin algılanmasını ve karakterizasyonunu sağlar. Bu yöntemin temel adımları Şekil 1'de gösterilm...

Bu çalışmada, akış sitometrisi analizi kullanılarak adaptif lökosit alt kümelerinin karakterizasyonu için taze kireçlenmiş aort kapakçıkları örneklerinden T lenfosit izolasyonu sürecini ve T hücre klonlama analitik adımlarını açıklarız.

Işınlanmış Buffy Coat'dan Besleyici Hücreler Kullanılarak T Lenfositlerin İzolasyonu ve Kültürü Yoluyla Aort Kapak Kireçlenmesinin Araştırılması

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high ...

Bu protokolün gerçekleştirilmesi kolaydır. Klonlama aşaması, taze örneklerden daha fazla sayıda T klonu elde edilmesine izin verir. Ayrıca, T hücrelerinin fenotipi ve işlevi kolayca analiz edilebilir.Prosedürü gösteren mary Christopher olacak, laboratuvarımdan bir doktora öğrencisi. T hücreli klonlamayı teşvik etmek için, laminer akış davlumbazında ışınlanmış buffy palto çantasını açmak için iğnesiz valfli torba çivisini kullanın. Torbadan 50 mililitreye kadar kanı bir T-150 şişesine aktarın ve şişeye 70 mililitre PBS ekleyin.Seyreltilmiş kanın 30 mililitresini dört 50 mililitre konik tüpün her birinde 20 mililitre yoğunluk gradyanı üzerine dikkatlice katlayın ve hücreleri yoğunluk gradyan santrifüjleme ile ayırın. Süpernatantı dikkatlice emiş edin ve PBMC'yi her tüpten tek bir yeni 50 mililitre tüpe aktarın. Son hacmi 50 mililitreye çıkarmak ve PBMC'yi santrifüjleme ile toplamak için PBS'yi kullanın.Aynı koşullar altında ikinci bir yıkamadan sonra, izole edilmiş besleyici hücrelerini sayım için 10 mililitre hücre kültürü ortamında askıya alın ve iki 50 mililitre tüpün her birine 50 birim IL-2 çözeltisi ile desteklenmiş 70 mililitrelik bir hücre kültürü ortamının 25 mililitresini ekleyin. Daha sonra IL-2 konsantrasyonu ile desteklenmiş hücre kültürü ortamının mililitre başına 6. Bir T lenfosit kültürü kurmak için, stenotik kapak örnek şişesinden süpernatantlar içeren T hücre klonunu tek bir 50 mililitrelik tüpe bir araya toplayın ve hücreleri santrifüjleme ile toplayın.Hücreleri saymak için 1 mililitre hücre kültürü ortamında canlandırmadan önce, peleti yıkama başına 50 mililitre PBS'de üç kez yıkayın. Hücreleri mililitre konsantrasyonu başına 1'e 10 ila 3. Besleyici hücre süspansiyonunu plastik bir 100'e 15 mililitre Petri kabına ekleyin ve deney için uygun sayıda U-bottom 96 kuyu plakasının her kuyusuna 100 mikrolitre besleyici hücresi ekleyin.Daha sonra T hücrelerini bir Petri kabına ekleyin ve hücre kültürü inkübatörde bir hafta boyunca iyi desteklenmiş her besleyici hücreye 100 mikrolitre T hücresi ekleyin. PBMC izolasyonu, besleyici hücrelerin elde edilmesi ve aort kapak örneklerinde lökositlerin sızmasının tespiti ve karakterizasyonu için hayati öneme sahiptir. İki haftalık inkübasyondan sonra, bir klon T hücre popülasyonu elde edilebilir.Burada kalsfik aort kapak hastalığı olan hastalarda T hücreli subpopulasyonların analizi için gating şeması gösterilmiştir. Bu hastada da gözlendiği gibi CD8+T hücrelerinden daha fazla CD4+T hücresi vardı. Kavunlanmamış T hücrelerinin akış sitometrik analizi, hem doğal valf hem de klon örneklerinde aynı T hücre işaretleyicilerinin bulunduğunu doğrular.Birlikte ele alındığında, bu veriler T hücrelerinin CD45 + lökositli kireçlenmiş aort kapaklarında bulunduğunu göstermektedir, bu da kalsfiik aort kapak hastalığının bağışıklık sisteminin aktivasyonu ve enflamatuar aktivite ile bağlantılı olduğunu göstermektedir. Bu yöntem çok yönlüdür. Fonksiyonel karakterizasyon için araştırmacının bir dokudan hücreleri izole edebilmesi gereken farklı protokollere uygulanabilir.Kirlenmeyi önlemek için steril koşullar altında çalışmanın ve mikroskop altındaki hücreleri eleştirel bir şekilde gözlemlemenin önemli olduğunu unutmayın.

investigating-aortic-valve-calcification-via-isolation-culture-t

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Yalıtma ve kalp kapakçığı endotel hücreleri (VEC) saf kültür popülasyonları için bir yöntem sağlar. VEC tüberkülü veya broşürün her iki taraftan da izole edilmiş ve hemen şu olabilir, altta yatan interstisyel hücre (VIC) izolasyonu basittir.

Kapak Endotel Hücreleri İzolasyon

Bu yazıda, aorta bağışıklık kompozisyonu araştırmak için flow sitometri tabanlı bir yöntem sunmaktadır. Kağıt aynı zamanda çevresindeki adventisya ve damar duvarında ayrı ayrı inceleyerek sağlayan ek bir teknik göstermektedir. Bu yöntem, aort lökositlerin fenotipik analizler gerçekleştirmek ve ateroskleroz çalışmalar için çeşitli immünolojik testleri uygulamak için imkanlar açılır.

Bağışıklık Hücreleri murin aorta içinde Sitometrisi Analizi

Bu videoda, aort kapak interstisyel hücrelerinin iki aşamalı bir kollajenaz prosedürü kullanılarak yetişkin bir farenin kalbinden izolasyonunu ve ardından düşük hacimli büyüme ortamında kültürlerini gösteriyoruz.

Fare Valf İnterstisyel Hücrelerinin İzolasyonu: Fare Aort Kapağından VIC'leri İzole Etmek ve Kültürlemek İçin Enzimatik Bir Yöntem

Bu video, vasküler düz kas hücrelerinin arteriyel medial kalsifikasyonunu in vitro olarak değerlendirmek için bir boyama tekniğini göstermektedir. Von Kossa yöntemi, kalsifikasyon bölgelerinde metalik gümüş biriktirmek ve siyah bir renk vermek için bir fotokimyasal reaksiyon kullanır.

Aortik Vasküler Düz Kas Hücrelerinin Von Kossa Boyama: Arteriyel Medial Tabaka Kalsifikasyonunun Değerlendirilmesi İçin İn Vitro Teknik

Bu video, aort kapak interstisyel hücrelerinin kalsifikasyonunu in vitro olarak değerlendirmek için bir test tekniğini göstermektedir. Test, mor renkli bir kalsiyum-arsenazo kompleksi oluşturmak için kalsiyum iyonları ile reaksiyona giren kalsiyuma duyarlı bir boya olan arsenazo III reaktifi kullanılarak kalsiyum konsantrasyonunun ölçülmesine yardımcı olur.

Aort Kapak İnterstisyel Hücrelerinde Kalsiyum Konsantrasyonunu Ölçmek için Kalsifikasyon Testi

Vasküler kalsifikasyon, insan kardiyovasküler hastalığının önemli bir belirleyicisi ve katkıda bulunan bir faktördür. Bu protokol, kültürlenmiş primer vasküler düz kas hücrelerinin kalsifikasyonunu indüklemek ve yakın kızılötesi floresan görüntüleme kullanarak hayvan aortlarında kalsifikasyon ve makrofaj yükünü ölçmek için yöntemleri açıklar.

Aort Kalsifikasyon ve Enflamasyon Vasküler düz kas hücrelerinin ve Görüntüleme Kalsifikasyon

Bu makalede, tanımlamak ve hücre içi boyama ile fare böbrek, aort ve lenf düğümleri içinde mevcut fonksiyonel T lenfosit alt grupları ölçmek ve akım sitometri ayrıntılı bir metodoloji sağlar. anjiotensin II hipertansiyon modeli açıklamak adım-adım, usul ve flow sitometri temel ilkelerine ve hücre içi boyama seçildi.

Hücre içi Boyama ve Sitometrisi Hipertansiyon Modelinde Fare Aort, Böbrek ve Lenf düğümleri içinde lenfosit alt tanımak

Bu iletişim kuralı yalıtım, kültür ve kalsifikasyon sıçan kaynaklı Vana interstisyel hücrelerin son derece fizyolojik vitro manken kireçlenmeler aort kapak hastalığı (CAVD) açıklanmaktadır. Bu fare modeli sömürü CAVD araştırma hücre ve moleküler mekanizmaları bu karmaşık patolojik süreç altında yatan Exploring kolaylaştırır.

Birincil fare malzemelerin yalıtım ve Vana interstisyel hücreleri: Aort Kapak kalsifikasyon eğitim için yeni bir Model

Bu makalede, fare aort kapak hücrelerinin iki adımlı bir kollajenaz prosedürü ile izolasyonu açıklanmaktadır. İzole fare valf hücreleri, bu in vitro kireçlenme tahlilleri gibi farklı tahlillerin yapılması ve aort kapak mineralizasyonuna yol açan moleküler yolların araştırılması için önemlidir.

Aort Kapak In Vitro Kalsifikasyonu Çalışmak için Fare Interstisyel Kapak Hücrelerinin İzolasyonu

Bu protokol, cerrahi aort kapak replasman prosedürleri sırasında veya kadavra dokusundan ekstrakte edilen insan aort kapaklarının toplanmasını ve ardından hastaya özgü primer kapak endotel ve interstisyel hücrelerinin izolasyonunu, genişlemesini ve karakterizasyonunu tanımlar. Hücre canlılığını ve fenotip spesifikliğini sağlamak için gereken süreçlerle ilgili önemli detaylar dahildir.

In vitro Hastalık Modellemesi için İnsan Primer Kapak Hücrelerinin İzolasyonu

Bu yazıda, murin aortlarının izole edilmesi, ardından mineralizasyon potansiyelini gözlemlemek için kalsifiye hücre dışı veziküllerin ekstraksiyonu ile vasküler kalsifikasyonun elde edilmesi ve değerlendirilmesi için metodoloji sunulmaktadır.

Hücre Dışı Vezikül Aracılı Vasküler Kalsifikasyonun In Vitro ve In Vivo Modeller Kullanılarak Analizi

Keşfedin, aort kapağı kireçlenmesinde T lenfositlerinin izolasyonu ve kültürü için besleyici hücrelerle klonlama yöntemini. Akış sitometrisi ile hücre alt gruplarını analiz ederek immün aktivasyonun rolünü açıklayın.

Işınlanmış Buffy Coatdan Besleyici Hücreler Kullanılarak T Lenfositlerin İzolasyonu ve Kültürü Yoluyla Aort Kapak Kireçlenmesinin Araştırılması (Video) | JoVE Journal

Işınlanmış Buffy Coat'dan Besleyici Hücreler Kullanılarak T Lenfositlerin İzolasyonu ve Kültürü Yoluyla Aort Kapak Kireçlenmesinin Araştırılması

Daha fazla video keşfet