CRISPR/Cas9 Genom Düzenlemeli Helicoverpa Armigera'nın (Hübner) Embriyo Mikroenjeksiyonu ve Nakavt Mutant Tanımlaması

Pamuk bollworm dünya çapında en yıkıcı zararlılardan biridir. CRISPR/Cas9 teknolojisi ile genom düzenlemesi, bu organizmadaki farklı genler arasındaki gen fonksiyonunun ve etkileşiminin daha fazla araştırılmasını sağlar. Bu tekniğin iki temel avantajı, yüksek özgüllükte olması ve bu şekilde ifade edilebilir olmasıdır.

SgRNA hedeflerini seçmek için CRISPR çevrimiçi web sitesine giderek olası kılavuz sitelerini ve genin beş ana çevrilmemiş bölgesine yakın eksonları arayın. Exon dizisini metin kutusuna girin ve Helicoverpa armigera'ya hedef genomun öğesini seçin. 20 BPNGG için PAM seçeneğini belirleyin ve web sitesinin kullanım kılavuzlarına göre diğer ayarları varsayılan parametrelerde bırakın.

Yazılımdan tahmin edilen kılavuz dizilerini karşılaştırın ve düzenleme verimliliğini artırmak ve hedef dışı düzenlemeyi azaltmak için en yüksek tahmin edilen verimlilik ve en az uyumsuzluk ile beş asal çevrilmemiş bölgenin yakınında bir veya iki guanin içeren 20 baz çiftten oluşan bir kılavuz dizisi seçin. Embriyo hazırlığı için, üç günlük erkeklerden ve iki günlük kadınlardan 50 sağlıklı birey seçin ve bunları temiz bir ağ kafesinde karıştırın. Kafese% 10 şeker çözeltisi içeren bir parça nemli pamuk yerleştirin.

Ağ kafeslerini gazlı bezle örtün ve gazlı bezi bir lastik bantla sabitleyin. Nemli tutmak için gazlı bez üzerine su püskürtün. Siyah bir bezi uygun boyutta kesin ve nemli gazlı bezi bu siyah bezle değiştirerek 30 dakika boyunca serbest yumurtalık pozisyonu sağlayın.

Çift taraflı bandı mikroskop slaydına yapıştırın. Kümesleri kullanarak, çift taraflı bandın yüzeyine yumurtaları bir sıra halinde yapıştırın. Teybe sıkıca yapıştıklarından emin olmak için her yamanın kenar boşluğuna basın.

Mikroskop slayt başına 50 ila 100 yumurta toplayın. Mikroenjeksiyondan önce, embriyoların gelişimini geciktirmek için mikroskobu buz üzerinde tutun. Metin el yazmasında açıklandığı gibi bir mikro pipet çekeceği kullanarak kılcal cam çekerek iğneyi hazırlayın.

Bir mikro öğütücü kullanarak iğne ucunu keskin kenarlı bir ulada öğütün. 10 mikrolitre hacimli karışım elde etmek için bir PCR tüpündeki RNace içermeyen suya iki mikrolitre ticarileştirilmiş Cas9 proteini ve sgRNA ekleyerek enjeksiyon çözümleri hazırlayın. Pipetle iyice karıştırın ve buza koyun.

Elektronik mikroinjektörün parametrelerini ayarlayın. Karışımın iki mikrolitresini bir mikro doldurucu pipet ucu kullanarak bir iğneye yükleyin ve iğnenin ucunda mümkün olduğunca fazla artık havayı tüketin. Enjeksiyon iğnesini bir mikromanipülatöre bağlayın ve iki parça arasında sıkı bir bağlantı sağlayın.

Petri kabına bir slayt yerleştirin ve mikroskop sahnesine koyun. İğne ucunu bir embriyonun üst yarımküresine 45 derecelik bir açıyla dikkatlice yerleştirin. Karışımı embriyoya teslim etmek için pedala basın ve embriyonun hafif bir genişlemesine yol açtı.

İğneyi hemen embriyodan geri çek ve petri kabını bir elinizle bir sonraki embriyo iğneye yakın olana kadar hareket ettir. Yeterli kuluçka miktarını sağlamak için aynı prosedürü kullanarak en az 300 embriyo enjekte edin. Enjeksiyondan sonra Petri tabaklarının kapağını kapatın.

Embriyoların yüzey rengi karardığında, mikroskop kaydırağının etrafındaki Petri kabına yapay diyet koyun. 24 kuyu kültür tabakları hazırlayın ve her kuyuyu yapay diyetle hacimsel kapasitesinin 1/3'üne doldurun. Küçük bir boya fırçası kullanarak kuluçkalık larvaları seçin ve onları 24 kuyu kültür tabağına aktarın, böylece bir larva vardır.

Larva üçüncü başlangıç aşamasına büyüdüğünde, onları yeni bir cam sünek ethrae aktarın. Yeni kapatılmış G-zero erkek yetişkinleri ve vahşi tip kadın yetişkinleri eşit oranda taze bir ağ kafesine aktarın. Onlara pamuk toplarına bırakılan% 10 şeker çözeltisi sağlayın.

G-one'ın yavrulanmasına kadar rutin yöntemler kullanan arka böcekler. Bir arka bacağı dikkatlice çıkarmak ve her bacağı bir Lysing Matrix tüpüne koymak için asalar kullanın. Doku homojenizatör kullanarak arka bacağı homojenize edin.

Homojenize numunenin genomik DNA'sını, üreticinin talimatlarına göre ticari bir gDNA ekstraksiyon kiti kullanarak çıkarın. Genotip astarlarını ve metin el yazmasından PCR reaksiyon koşullarını kullanarak gen segmentini güçlendirin. Genotipi gen dizileme servisiyle onaylayın.

Aynı genotipteki G-bir bireylerini bir ağ kafesine koyun, G-one soylarını kendiliğinden geçin ve aynı yöntemleri kullanarak taramaya devam edin. İlgi geninin hedef yeri ikinci ekinde bulundu. Bu bölge oldukça korunaklıydı ve sentezlenen sgRNA'nın hedef bant parçası agarose jel elektroforezi kullanılarak doğrulandı.

Tek bir sgRNA hedefinin mutant tespiti, PCR ürünlerinin G-one ebeveyn ünitelerinden sıralanarak gerçekleştirildi. Mutantların büyük ölçüde silinmesi vahşi tip tavalardan kolayca ayırt edildiği için, farklı eksonlarda örtüşmeyen sgRNA çiftleri kullanmanın etkinliği gösterilmiştir. Belirli sayıda mutant birey elde edildikten sonra, farklı genler arasındaki gen fonksiyonunu ve etkileşimini netleştirmek için elektrofizyolojik veya davranışsal deneyler yapılabilir.