Programlanabilir In vitro Transkripsiyon ve Moleküler Hesaplama için DNA-Bağlı RNA Polimeraz

Yapay nükleik asit transkripsiyon faktörlerini kullanarak polimeraz aktivitesini düzenlemek için bir yöntem öneriyoruz. Bu gen düzenleyici mimari, gelecekteki in vitro genetik cihazlar için bir yapı taşı görevi görebilirsiniz. Dna bağlama etki alanını bir T7 RNA polimerazına bağlayarak, bu teknik DNA tabanlı devrelerin ölçeklenebilirliğini transkripsiyon devrelerinin işlevselliğiyle birleştirir.

Tabloda belirtildiği gibi, beş ila bir ila bir ila beş oran arasında 50 mikrolitre çift damıtılmış su hacmine kadar tek iplikli BG oligonükleotid dokuz seyreltme yaparak başlayın. İki mikrolitre SNAP tamponunu dört mikrolitre BG oligonükleotid ve dört mikrolitre SNAP T7 RNAP ile karıştırarak her seyreltme için bir reaksiyon karışımı hazırlayın. Oligonükleotidini çift damıtılmış suyla, DNA kontrolünü de SNAP T7 RNAP'ı çift damıtılmış suyla değiştirerek RNAP kontrolünü hazırlayın.

Dört mikrolitre SNAP tampona her numuneden iki mikrolitre ve numune başına iki mikrolitre protein yükleme boyası ekleyerek 11 reaksiyon ayarlayın. Reaksiyonları 70 santigrat derecede 10 dakika ısıtın, her numunenin iki mikrolitresini 200 voltta buz üzerinde 35 dakikalık jel elektroforezi için% 4 ila% 12 vitreus protein jeline yüklemeden önce. Koşunun sonunda, jeli yıkama başına en az 10 dakika çalkalayıcı üzerinde üç su değişimi ile yıkayın, ardından 15 dakika siyanin boyası ile nükleik asit lekesi.

Jeli uygun bir jel görüntüleme sistemine görüntüleyin ve jeli 20 mililitre Coomassie mavisi ile tekrar lekelenin. Bir saat sonra, jeli tekrar görüntülemeden önce en az bir saat çift damıtılmış su ile lekeyi çözün. Oligonükleotid bağlı SNAP T7 saflaştırma için, ilk olarak, bir azı dişi izinin 50 mikrolitresini, beş azı dişi sodyum klorürün 100 mikrolitresini, 850 mikrolitre çift damıtılmış su ile karıştırarak elüasyon tamponu hazırlayın.

Daha sonra, numune başına bir iyon değişim sütununu tek tek iki mililitre santrifüj tüpüne yerleştirin ve her sütundan tüm arabellek elde edilene kadar sütunları santrifüjleme ile saflaştırma tamponu ile yıkayın. Her numuneyi numune oranına üç ila bir saflaştırma tamponu ile seyreltin ve her sütuna 400 mikrolitre numune yükleyin. Tüm arabellek gösterildiği gibi elde edildiğinde, her örnek için akışı toplayın ve etiketleyin.

Tüm tampon yıkama başına elde edilene kadar, akışı uygun şekilde toplayıp etiketleyene kadar, sütunları yıkama başına 400 mikrolitre arıtma tamponu ile üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, sütunun ortasına 50 mikrolitre elüsyon tamponu ekleyerek ve 50 mikrolitre tamponun tümü geçene kadar sütunu üç kez santrifüjleyarak eluted proteini toplayın. Her santrifüjden sonra elute toplayın ve etiketleyin, son santrifüjden sonra elute'yi tek bir tüpte biriktirirken, jel analizi için her bir elütenin küçük bir hacmini bırakın.

Kalan elute aliquots absorbansını 260 ve 280 nanometre olarak ölçün ve kullanımlarına kadar eksi 20 derece depolama için bire bir oranında numunelere gliserol ekleyin. Toplam elute ürününü 2x depolama tamponu ile tampon değişimi için 500 mikrolitre 30 kilodalton santrifüj filtre ünitesi kullanın. Ve emiciliği gösterildiği gibi ölçün.

Daha sonra eksi 20 santigrat derece depolama için ürüne bire bir oranında gliserol ekleyin. SDS-PAGE tarafından elutes değerlendirmek için, örnekleri uygun bir protein merdiveninde 200 voltta 35 dakika boyunca veya boya cephesi jelin sonuna göç edene kadar% 12 vitreus jel üzerinde çalıştırın. Bağlı RNAP'ın isteğe bağlı kontrol aktivitesini göstermek için, her şablonun 2,4 mikrolitresini beş mikrolitre 5x tavlama tamponu ve 14,2 mikrolitre çift damıtılmış su ile karıştırın.

Elde edilen bir mikromolar çift iplikli DNA CAGE'i 75 santigrat derecede iki dakika kuluçkaya yatırın. Ve organizatör ve malakit yeşil aptamer DNA şablonunun duyu ve anti-duyu suşlarını tabloda belirtildiği gibi tavla. Kuluçkaların sonunda, bağlı SNAP T7 RNAP'ı çift iplikli DNA CAGE'e 500 nanomolar RNAP'lık son konsantrasyona bir ila beş molar oranında ekleyin.

Oda sıcaklığında 15 dakika sonra, numuneyi buza yerleştirin, ve 25 milimoler ribonükleozid trifosfattan oluşan bir mikrolitre, bir milimoler malakit yeşili bir mikrolitre, RNAP CAGE karışımının 2,5 mikrolitresi, A ve B oligonükleotidler iplikçiklerinin her biri 2,5 mikrolitre ile 10x in vitro transkripsiyon tamponunun 2,5 mikrolitresini karıştırın, ve 10 mikrolitre çift damıtılmış suda bir milimoler malakit yeşil aptamer şablonunun üç mikrolitresi. 15 mikrolitre çift damıtılmış suda, 2,5 mikrolitre 10x in vitro transkripsiyon tamponu, 25 milimoler ribonikleozit trifosfat karışımının bir mikrolitresini, bir milimoler malakit yeşilinin bir mikrolitresini, RNAP CAGE karışımının 2,5 mikrolitresini ve bir milimolar malachite yeşil aptamer şablonunun üç mikrolitresini içeren ikinci bir reaksiyon ayarlayın. Sadece tampon içeren bir reaksiyon ayarlamak için, 10x in vitro transkripsiyon tamponunun 2,5 mikrolitresini, 25 milimoler ribononikozit trifosfat karışımının bir mikrolitresini, bir milimoler malakit yeşilinin bir mikrolitresini ve bir milimolar malakit yeşil aptamer şablonunun üç mikrolitresini 17,5 mikrolitre çift damıtılmış suda karıştırın.

Tüm reaksiyonlar hazırlandığında, her reaksiyonu 384 kuyulu bir plakaya aktarın ve floresan plaka okuyucusunda malakit yeşil aptamer transkripsiyonunu 610 nanometre eksitasyonda 37 santigrat derecede iki saat boyunca izleyin ve 655 nanometre emisyonu. Okumanın sonunda, plakayı buza yerleştirin ve RNA ürününü her kuyudan 70 santigrat derece TBE tamponunda 20 dakika boyunca 280 voltta veya boya önü jelin sonuna ulaşana kadar 12% TBE-üre poliakrilik jelde çalıştırın. Daha sonra, gösterildiği gibi görüntülemeden önce, jeli bir yörünge çalkalayıcı üzerinde 10 dakika boyunca siyanin boyası nükleik asit lekesi ile lekeleyin.

Rekombinant SNAP T7 RNAP proteininin başarılı bir şekilde ifade edilmesi ve saflaştırılması SDS-PAGE kullanılarak doğrulanabilir. SDS-PAGE'den sonra enmatik aktivite in vitro transkripsiyon reaksiyonu ile doğrulanabilir. BG fonksiyonelleştirilmiş oligonükleotitlerin başarılı bir şekilde birleştirilmesi% 18 denaturing TBE-üre PAGE ile doğrulanabilir.

Değiştirilmemiş oligonükleotid ile karşılaştırıldığında, BG moiety'nin oligonükleotide eklenmesi moleküler ağırlığını arttırır. Dna ile bağlanmış T7 RNAP'ın aşırı BG oligonükleotidlerden arındırılmasını doğrulamak için bu temsili siyanine boya lekesi jelinde gözlemlendiği gibi, fraksiyondan geçen ilk akış çoğunlukla fazla BG oligonükleotid ve katyon değişim reçinesine bağlanmayan DNA bağlı polimerazın küçük bir kısmını içeriyordu. Havuz seyreltme fraksiyonları, siyanin boyasının oligonükleotid bağına bağlanmasının neden olduğu tek RNAP oligo bandını içeriyordu, yukarı konsantre ürün şeridi aynı, ancak daha koyu bant başarılı bir konsantrasyona işaret ediyordu.

Aynı desenler Coomassie mavisi boyama ile gözlenir ve konjuge olmayan RNAP kontrolünde küçük bir jel hareketliliği kayması gözlenir. Burada gerçek zamanlı kinetikte in vitro transkripsiyonun sonunda üretilen floresan sinyal gösterilmiştir. Bu analizde, floresan sinyalde 336 kat aktivasyon gözlendi ve polimeraz aktivitesinin sağlam bir kontrolünü gösterdi.

Bu protokolü denerken, nükleik asit lekelemeden önce SDS'yi jelden iyice yıkamayı unutmayın. Bunun nedeni, STS'nin boyayı jelde hapsederek yüksek arka plan sinyaline neden olmasıdır. Yöntemimizi birden fazla basamaklı büyük bir gen devresine uygulamak, bağlı transkripsiyon sisteminin ölçeklenebilirliğini ve birlenebilirliğini gösterecektir.

Bu teknik şu anda sinir ağı tarzı hesaplama yapabilen gen devreleri geliştirmek için kullanılmaktadır.