Organoid Kaynaklı Epitel Tek Katmanlı: Bağırsak Bariyer Fonksiyonu için Klinik Olarak İlgili Bir In Vitro Model

Organoid türevi tek katmanlar, hastanın intestinal epitel bariyer fonksiyonunu özetler ve kişiselleştirilmiş tedavi stratejilerini belirlemek için her hastada disfonksiyonu arttırmayı amaçlayan tedavilerin etkisini test etmeye izin verir. Organoid monokatmanlar, hasarın meydana geldiği taraf olan epitelin apikal tarafına erişim sağlar ve 3D yapılar olarak büyüyen organoidlerde normal ve erişilebilirdir. Her organoid farklıdır, dolayısıyla mücadele.

Sıkı tek katmanlar oluşturmak için, proliferasyon fazında organoidler kullanın ve iki ila dört hücreli kümeler oluşturmak için hızlı bir şekilde sindirin. Her model için hücre tohumlamasını titre edin. Prosedürün gösterilmesi, HUB'ın kıdemli bir araştırma görevlisi olan Wies Van Dooremalen tarafından yapılacaktır.

Membran kesici uçları hücre dışı matris veya ECM ile kaplayarak başlayın. Bir biyogüvenlik kabininde çalışırken, membran eklerini destek plakasına yerleştirin. ECM 40X'i buz gibi soğuk DPB'lerde kalsiyum ve magnezyum ile seyreltin, ardından seyreltilmiş ECM'nin 150 mikrolitresini her bir kesici ucun apikal bölmesine pipetleyin.

Plakayı en az bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücreleri tohumlamaya hazırlamak için, 37 santigrat derecelik bir su banyosunda hücre ayrışma reaktifinin bir aliquot'unu önceden ısıtın. Altı kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğu için iki mililitre reaktif kullanın.

Organoidleri içeren kültür plakasını inkübatörden biyogüvenlik kabinine aktarın. Organoidleri metin yazısında açıklandığı gibi işleyin, ancak birden fazla tüpü tek bir tüpte toplamayın. Organoidleri topladıktan sonra, 12 mililitreye bazal orta veya BM ekleyin ve 85 kat G'de santrifüj yapın, ardından süpernatanı aspire edin.

Organoidleri içeren tüpü 12 mililitreye kadar DPBS ile doldurun, ardından 10 mililitrelik bir pipet kullanarak 10 kez yukarı ve aşağı pipet uygulayın. Sekiz santigrat derecede beş dakika boyunca 85 kez G'de santrifüj yapın ve organoid peleti rahatsız etmeden süpernatantı aspire edin. Önceden ısıtılmış hücre ayrışma reaktifini organoidlere ekleyin ve yeniden askıya alın, ardından tüpleri 37 santigrat derecede su banyosunda beş dakika boyunca çapraz veya yatay olarak inkübe edin.

Kuluçkadan sonra, beş mililitrelik steril plastik pipet veya P1000 pipet kullanarak 10 kez yukarı ve aşağı pipet kullanın. Tek hücrelerin ve iki ila dört hücreden oluşan bazı hücre kümelerinin bir karışımının oluşup oluşmadığını görmek için mikroskop altındaki organoid süspansiyonu kontrol edin. Hücre süspansiyonuna ROCK inhibitörü ile 12 mililitreye kadar BM ekleyerek hücre ayrışmasını durdurun.

Hücreleri santrifüj edin, daha sonra hücre peletini rahatsız etmeden süpernatantı aspire edin. Aynı organoid kültürü birkaç tüpte kullanırken, hücre peletlerini 12 mililitre BM'de yeniden askıya almadan önce havuzlayın. Hücre süspansiyonunu BM ile önceden ıslatılmış 40 mikrometrelik bir süzgeçten süzün ve akışı 50 mililitrelik bir konik tüpe toplayın, ardından süzgeci 10 mililitre BM ile yıkayın ve akışı aynı tüpe toplayın. Gergin hücre süspansiyonunu iki yeni 15 mililitrelik konik tüpe aktarın ve santrifüjlemeyi tekrarlayın.

Hücre peletini bozmadan süpernatantı aspire edin ve başlangıç malzemesi olarak kullanılan tam kültür plakası başına 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile desteklenmiş dört mililitre IEM'deki hücreleri yeniden askıya alın. Saymak için Trypan Blue ile bire bir oranında az miktarda hücre süspansiyonunu karıştırın, ardından hücreleri sayın ve her bir hücreyi küçük kümeler halinde sayarak toplam canlı hücre sayısını hesaplayın. 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile desteklenmiş IEM'nin mililitresi başına 3X 10 ila altıncı canlı hücre içeren bir hücre süspansiyonu hazırlayın.

Hücreleri tohumlamak için, plakayı yatay tutarak ECM kaplı kesici uçlardan DPBS'yi dikkatlice aspire edin. Her bazolateral bölmeye ROCK inhibitörü ile desteklenen 800 mikrolitre IEM pipeti ve apikal bölmedeki ECM kaplı membran üzerine damla damla hazırlanan 150 mikrolitre hücre süspansiyonu. Plakayı inkübatöre 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit olarak yerleştirin.

Hücreler membran üzerine çökeldikten sonra, her gün transepitelyal elektrik direncini veya TEER'yi ölçün ve membran eklerini mikroskop kullanarak görüntüleyin. Tek katmanları yenilemek için, ortamı membran eklerini içeren plakanın bazolateral bölmelerinden çıkarın, ardından ortamı apikal bölmelerden dikkatlice aspire edin. Her apikal bölmeye damla damla 150 mikrolitre taze IEM ekleyin ve her bazolateral bölmeye 800 mikrolitre taze IEM ekleyin.

Manuel bir TEER ölçüm cihazı kullanıyorsanız, elektrotu% 70 etanol ile temizleyin ve biyogüvenlik kabininin içinde hava ile kurumasını bekleyin, ardından elektrodu BM içeren bir tüpe yerleştirin. Elektrodu manuel TEER ölçüm cihazına bağlayın ve ohm cinsinden ölçüm yapmak için işlev anahtarını çevirin ve güç düğmesini açın. Kısa elektrotu kesici ucun apikal bölmesine, uzun elektrodu ise tek katmana dokunmadan bazolateral bölmeye yerleştirin. Boş kuyucukta, ardından kalan numunelerde direnci ölçün.

Elektrodu farklı koşullara sahip numuneler arasında BM ile yıkayın. İşiniz bittiğinde, elektrodu yarı su ve% 70 etanol ile temizleyin, ardından havanın kurumasını bekleyin. Bu protokol, bağırsak organoidlerini toplamak ve epitel hücrelerinin tek katmanlarını hazırlamak için kullanıldı.

IEM'de sekiz gün boyunca kültürlenen tek katmanlı bir tabaka burada gösterilmiştir. Tek katmanları enterosit farklılaşma ortamına veya EDM'ye maruz bırakırken bir yapı gözlemlenebilirken, kombinasyon ortamına veya CDM'ye maruz kalan tek katmanlar daha pürüzsüz bir yapı gösterir. Tek katmanlı oluşum kantitatif olarak TEER ölçümü ile takip edildi.

Tamamen akıcı bir tek katman, yaklaşık 100 ohm santimetre karelik bir TEER değerine sahipti ve bu da her iki farklılaşma ortamına maruz kaldığında artmıştır. Tüm orta koşullardaki tek katmanlar, Lucifer sarısına daha düşük bir görünür geçirgenlik gösterdi. IEM'de kültürlenen ileal monokatmanlar tarafından lizozim sekresyonu, IEM'de kültürlenen tek katmanlı tabakalardan daha yüksekti ve EDM veya CDM'de dört gün daha sürdü.

IEM, IEM ve müteakip EDM veya IEM ve müteakip CDM'de kültürlenen tek katmanlar, H&E, Ki67, MUC2 ve Alcian Blue boyamaları ile gözlenen morfolojide farklılıklar göstermektedir. Farklılaşma üzerine, proliferatif hücreler azalırken, goblet hücresi ve enterosit belirteci gen ekspresyonu, LGR5, MUC2 ve alkali fosfataz gen ekspresyonu ile gösterildiği gibi IEM koşulları altında gözlenenlere kıyasla artmıştır. Tek katmanlı hazırlarken, organoidleri sindirdikten sonra organoidlerdeki anoikisin önlenmesi önemlidir.

Ek olarak, hücrelerdeki ECM, Transwell membranları üzerinde eşit olarak dağıtılmalıdır. Organoid türevi monokatmanlar, farklı floresan substratlar kullanılarak molekül taşımalarının hastaya özgü bir şekilde değerlendirilmesine izin verir.