Name: Polisome Profilleme Kullanarak Gelişen Fare Beyninde Çeviri Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Keşfedin, gelişen fare beyninde mRNA çeviri verimliliğini değerlendirmek için polisom profilleme yöntemini. Bu düşük maliyetli protokol, nöral doku çalışmalarında çeviri düzenlemesini incelemek için güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma bir NSERC Discovery Grant (RGPIN/04246-2018 to G.Y.) tarafından finanse edildi. G.Y. Kanada Araştırma Başkanı. S.K., Mitacs Globalink Lisansüstü Bursu ve ACHRI Lisansüstü Öğrenci Bursu tarafından finanse edildi.

Tüm hayvan kullanımı Calgary Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından denetlendi. Deney için kullanılan CD1 fareleri ticari satıcıdan satın alındı.
1. Çözümlerin hazırlanması
NOT RNA bozulmasını önlemek için, RNase dekontaminasyon çözeltisi ile tezgahı ve tüm ekipmanları püskürtün. Deney için RNase içermeyen ipuçları kullanılır. Tüm çözümler RNase içermeyen suda hazırlanır.
<ol><li>DMSO'da sikloeximide stok çözeltisi (100 mg/mL) hazırlayın ve -20 °C'de saklayın.</li>
	<li>RNase içermeyen suya 75,3 g sakkaroz ekleyerek ve hacmi 100 mL'ye yükselterek 2,2 M sakkaroz stok çözeltisi hazırlayın (~16 gradyan hazırlığı için). Çözelti uzun süreli depolama için -20 °C'de tutulabilir.</li>
	<li>10x tuz çözeltisi hazırlayın (1 M NaCl; 200 mM Tris-HCl, pH 7.5; 50 mM MgCl2).</li>
	<li>30 g sakkaroz, 5 mL 10x tuz çözeltisi içeren% 60 (w/ v) sakkaroz kovalama çözeltisi hazırlayın ve hacmi RNase içermeyen su ile 50 mL'ye kadar üst üste yerleştirin.</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, kovalama çözümüne RNase içermeyen suda bromofenol mavisi veya yaklaşık 5 μL% 1 bromofenol mavisi ekleyin. 1.6. Çözümleri 4 °C'de saklayın.</li>
</ol>2. Sakkaroz gradyanının hazırlanması
NOT: Sakkaroz gradyanlarının hazırlanmasında doğruluk, tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmede kritik öneme sahiptir.
<ol><li>Altı adet % 10-50 sakkaroz gradyan hazırlamak için, Tablo 1'deolduğu gibi 2,2 M sakkaroz çözeltisini seyreltin.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Sakkaroz çözeltisi</td>
			<td>10%</td>
			<td>20%</td>
			<td>30%</td>
			<td>40%</td>
			<td>50%</td>
		</tr>
<tr>
<td>2.2 M sakaroz</td>
			<td>2 mL</td>
			<td>4 mL</td>
			<td>6 mL</td>
			<td>8 mL</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>10X tuz çözeltisi</td>
			<td>1,5 mL</td>
			<td>1,5 mL</td>
			<td>1,5 mL</td>
			<td>1,5 mL</td>
			<td>1,5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cycloheximide</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>15 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Su</td>
			<td>11,5 mL</td>
			<td>9,5 mL</td>
			<td>7,5 mL</td>
			<td>5,5 mL</td>
			<td>3,5 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Toplam birim</td>
			<td>15 mL</td>
			<td>15 mL</td>
			<td>15 mL</td>
			<td>15 mL</td>
			<td>15 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Sakkaroz gradyanlarının preparatları için sakkaroz seyreltmeleri.
NOT: Ultrasantrifüjleme sırasında ağırlığı dengelemek için her zaman sakkaroz gradyanlarını iki kat olarak hazırlayın.
<ol start="2"><li>Metal künt uç iğnesini RNase dekontaminasyon çözeltisi ile silin. Ultracentrifuge tüplerini, boruları ve şırınnayı RNase içermeyen su kullanarak kısaca durulayın. Tüpleri, kalan su sakkaroz konsantrasyonu değiştireceği için tüplerde su damlası kalmayacak şekilde havayla kurutun.</li>
	<li>Metal iğneyi kelepçe tutucusuna ve santrifüj tüpünü motorlu sahneye yerleştirin. Degradeleri tutarlı bir şekilde hazırlamak için, ultrasantrifüj tüpünü tutmak için motorlu bir aşama ve sakkaroz çözeltilerini enjekte etmek için bir şırıngar pompası içeren ev yapımı bir sistem kullanılmıştır (Şekil 1, ayrıntılar için adım 9'a bakın).</li>
	<li>30 mL'lik bir şırıngayı ~16 mL%10 sakkarozla doldurun (altı gradyan için yeterlidir), şırınga pompasına yerleştirin ve iğneye bağlayın. Şırınga, tüp ve iğnede hava kabarcıkları olmadığından emin olun. Kalan çözeltiyi çıkarmak için iğnenin ucunu silin.</li>
	<li>Motorlu sahneyi, iğnenin ucu alttaki tüpün ortasına değdirene kadar yukarı taşıyın.</li>
	<li>Şırınd pompasını 2,3 mL hacim için 2 mL/dk akış hızına ayarlayın.</li>
	<li>% 10 sakkaroz çözeltisinin 2,3 mL'sini dağıttıktan sonra, motorlu aşamadan aşağı hareket edin ve altı degradenin tümü için işlemi tekrarlayın.</li>
	<li>Tüplerin altına% 20 sakkaroz çözeltisi eklemek için 2.4-2.7 adımlarını tekrarlayın, ardından% 30, % 40 ve% 50 sakkaroz çözeltileri benzer şekilde.</li>
	<li>Degradenin hazırlanmasından sonra, ultracentrifuge tüpünü bir parafin filmi kullanarak kapatın.</li>
	<li>Tüpleri 4 °C'de bir gece bırakın, böyle şekilde farklı sakkaroz katmanları birlikte yayılarak sürekli bir gradyan verin.</li>
</ol>3. Doku diseksiyonu
NOT: Gebe fareler% 5 izofluran ile anesteziden önce servikal çıkık ile ötenaziye tabi edildi.
<ol><li>Embriyonik 12. günde veya gerektiğinde diğer zaman noktalarında CD1 fare embriyolarını toplayın ve hücre canlılığını korumak için embriyoları buz gibi Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) içeren Ø 10 cm'lik bir tabağa yerleştirin.</li>
	<li>Diseksiyon kapsamı altında, bir embriyoyu buz gibi HBSS içeren Ø 6 cm'lik bir plakaya aktarın.</li>
	<li>Yaklaşık 45° açıyla gözlerden geçerek başın konumunu sabitlemek için 21-23 G iğneler kullanın ve iğnelerin plakaya sabit olduğundan emin olmak için kuvvet uygulayın (Şekil 2A).</li>
	<li>Deriyi ve kafatasını ortadan yanlara çıkarmak için No.5 tokmak kullanın.</li>
	<li>Koku ampullerini kesmek ve kortikal dokuları ortaya çıkarmak için menenjileri çıkarmak içinps kullanın.3.6.Kortikal dokuları buz üzerinde 2-3 mL nörobakal ortama kesmek için kavisli önksezi kullanın(Şekil 2B). Gerektiğinde farklı embriyolardan kortikal dokuları havuza edin. 8-10 embriyodan dokular genellikle ~200 μg toplam RNA verir.</li>
</ol>4. Hücre lizisi
<ol><li>Doku diseksiyonu gününde, Tablo 2'de açıklandığı gibi taze hücre liziz tamponu hazırlayın.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>çözüm</td>
			<td>Son konsantrasyon</td>
			<td>hacim</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris-HCl (pH 7.5)</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>100 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kartal</td>
			<td>100 mM</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>5 mM</td>
			<td>25 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
			<td>%1 (v/v)</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sodyum deoksikolat</td>
			<td>%0,5 (w/v)</td>
			<td>500 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cycloheximide</td>
			<td>100 μg/mL</td>
			<td>5 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase ücretsiz su</td>
			<td></td>
			<td>5 mL'ye kadar yükleme</td>
		</tr>
<tr>
<td>toplam</td>
			<td>5 mL</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: Polizom liziz tamponunun hazırlanması.
NOT: Proteaz ve fosfataz inhibitörleri ile takviye lizis tamponu.
<ol start="2"><li>100 μg/mL'lik son konsantrasyona parçalanmış dokularla nörobakal ortama sikloeximide ekleyin ve 10 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın. Cycloheximide çeviri uzamasını engeller ve bu nedenle ribozom çalıştırmasını önler 15.</li>
	<li>4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüj ve süpernatantı atın.</li>
	<li>Dokuları 100 μg/mL sikloeximid ile desteklenmiş buz gibi fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>4 μL RNaz inhibitörü ile desteklenmiş 500 μL hücre liziz tamponu ekleyin. Pipet yukarı ve aşağı lizis tamponunda dokuyu yeniden dirsindirmek için. Dokuyu hafifçe imsilmek için bir insülin iğnesi kullanın.</li>
	<li>Her 2-3 dakikada bir kısa girdap ile buzdaki dokuları 10 dakika kuluçkaya yatırın. NOT: Doku bozulmasını önlemek için doku lizizinin tüm adımlarının buz üzerinde gerçekleştirilmesini sağlayın.</li>
	<li>4 °C'de 5 dakika boyunca 2.000 x g'da santrifüj.</li>
	<li>Süpernatantı buz üzerinde yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>4 °C'de 5 dakika boyunca ~13.000 x g'da santrifüj.</li>
	<li>Süpernatantı buz üzerinde yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.</li>
	<li>UV-Vis spektrofotometresi kullanarak doku lysate'deki RNA konsantrasyonunu ölçün. NOT: Deneye birden fazla örnek dahil edilirse, varyasyonu en aza indirmek için örnekleri ekstra hücre liziz tamponu ile aynı konsantrasyonda seyreltin.</li>
</ol>5. Örnek yükleme ve ultrasantrifüjleme
<ol><li>Ultracentrifugation rotorunu ve salıncak kovalarını 4 °C'de önceden soğutun ve ultrasantrifüjün sıcaklığını 4 °C'ye ayarlayın.</li>
	<li>Toplam RNA girişi olarak doku lysate 20 μL tutun.</li>
	<li>Numuneleri (eşit hacimli 50-300 μg RNA) sakkaroz gradyanlarının üstüne, lisatı ultracentrifuge tüplerinin duvarlarına yavaşça dağıtarak yükleyin.</li>
	<li>Ultracentrifuge tüplerini salıncak kovasına hafifçe yerleştirin. Tüm çapraz zıt kovaların dengeli olduğundan emin olun.</li>
	<li>Salıncak kovalarını rotora yükleyin. Ultrasantrifüjü 90 dakika boyunca 4 °C'de 190.000 x g (~39.000 rpm) olarak ayarlayın.</li>
	<li>Santrifüjlemeden sonra degradeleri yavaşça buza yerleştirin.</li>
</ol>6. Fraksiyonasyon ve örnek toplama
NOT: Analiz ve degradelerden numune toplamak için ev yapımı kesirleme, kayıt ve toplama sistemi kullanılır (Şekil 3, bkz. Cihaz bileşenleri).
<ol><li>Tüp delicisine boş bir ultrasantrifüj tüpü yerleştirin ve alttan iğne ile tüpü hafifçe delin.</li>
	<li>UV monitörünü açın ve dijital sinyal kayıt yazılımını açın.</li>
	<li>30 mL'lik bir şırınnayı % 60 sakkaroz kovalama çözümünün 25 mL'si ile doldurun. Şırındağa yavaşça bastırın, böylece kovalama çözeltisi boş tüpü doldurur ve algılama için taban çizgisini ayarlamak için 254 nm UV monitöründen geçer.</li>
	<li>Algılama için bir taban çizgisi kaydetmek için UV monitöründe otomatik sıfıra basın. Kayda başlamak için yazılım üzerinde oynat tuşuna basın.</li>
	<li>Sistem bir taban çizgisi oluşturduktan sonra, yazılımdaki kaydı duraklatın ve chase çözümünü geri alın. Sistemde artık chase çözümü kalmadığından emin olun. NOT: Önceki çalıştırmadan kalan artık sakkaroz çözeltilerini çıkarmak için sistemi RNase içermeyen suyla durulayın.</li>
	<li>Tüp delicisine bir örnek tüp yükleyin. Alttan iğne ile tüpe hafifçe nüfuz edin.</li>
	<li>Yazılıma kaydetmeye başlayın. Şırınd pompasını (25 mL hacim için 1 mL/ dk akış hızı) ve kesir toplayıcıyı polisome fraksiyonları toplamak için başlatın. Kesirleyici ayarlarını 30 s olarak ayarlayın. NOT: Her çalıştırmadan önce, kovalamaca çözeltisinin iğneden sürekli akmasını sağlamak için şırıngaya hafifçe bastırarak şırıngada veya boruda hava kabarcıkları olmadığından emin olun.</li>
	<li>Kesirleri bir kesir toplayıcı kullanarak 1,5 mL tüpler (her biri 500 μL) halinde toplayın.</li>
	<li>Kesirler hemen işlenebilir veya -80 °C'de saklanabilir.</li>
	<li>Fraksiyon toplamadan sonra, herhangi bir kalıntı sakkarozunu çıkarmak için sistemi RNase içermeyen suyla durulayın.</li>
</ol>7. RNA'nın Çıkarılması
<ol><li>Her kesir için 10 ng luciferaz mRNA çivili kontrol ekleyin.</li>
	<li>Her kesir için üç hacim guanidiyum hidrokalrid bazlı ticari RNA izolasyon reaktifi ekleyin.</li>
	<li>Vortex kısaca 15 sn.</li>
	<li>7.2'de kullanılan çözelti ile uyumlu bir RNA çıkarma kiti kullanarak RNA çıkarın.</li>
</ol>8. Ters transkripsiyon ve gerçek zamanlı PCR
<ol><li>UV-Vis spektrofotometre kullanarak RNA konsantrasyonunu ölçün.</li>
	<li>Üreticinin protokolüne göre RNA'yı bir cDNA sentez kiti kullanarak ters transkripsiyona tabi edin.</li>
	<li>Örnek olarak gapdh mRNA'nın polizomal dağılımını incelemek için nicel gerçek zamanlı PCR (qPCR) kullanın. qPCR, aşağıdaki bisiklet koşullarına sahip bir qPCR algılama sistemi ve bir qPCR mastermix reaktifi kullanılarak gerçekleştirildi: 10 dakika için 95 °C, daha sonra 15 s için 95 °C 40 döngü, 30 s için 60 °C, 40 s için 72 °C, ardından 60 s için 95 °C.</li>
	<li>Amplifikasyon çizimlerinden Eşik döngüsü (Ct) değerleri elde edin ve ΔΔCt yöntemini kullanarak kat değişimini hesaplamak için kullanılır.</li>
</ol>9. Sakkaroz gradyan yapma sistemi montajı
NOT: Sakkaroz degrade makinesinin her bileşenini (Tablo 3'teaçıklandığı gibi) birleştirmek için adımları izleyin (Şekil 1).
<ol><li>Temel ekmek tahtasına (A1) iki dikey braket (A2) takın.</li>
	<li>Doğrusal kademeli aktüatörü temel ekmek tahtasına (A1) monte etmek için iki ince dik açılı braket (B2) kullanın.</li>
	<li>Ø12,7 mm alüminyum direk (C2) üzerindeki set vidasını tüp tutucu taban ekmek tahtasına (C1) sabitlemek için tüp tutucu için bir stand olarak kullanın.</li>
	<li>Dik açılı Ø1/2" ila Ø6 mm posta kelepçesini (C3) post (C2) ve mini serisi optik direk (C4) ile monte edin.</li>
	<li>Tüp tutucu olarak küçük bir V kelepçesi (C5) bağlamak için optik direkteki (C4) set vidasını kullanın.</li>
	<li>Tüp tutucusuna bir santrifüj tüpü koyun ve dikey hale getirmek için açıyı ayarlayın. Tüpün konumunu işaretleyin ve tüpü desteklemek için kaide posta tutucusunu (C6) temel ekmek tahtasına (C1) monte edin.</li>
	<li>Ekmek tahtasının (A1) diğer tarafında, düzeltmek için Ø12,7 mm alüminyum direğin (D1) set vidasını kullanın ve dik açılı Ø1/2" ila Ø6 mm post clamp (D2) kullanarak mini seri optik direği (D3) bağlayın.</li>
	<li>Minyatür V kelepçesini (D4) künt uçlu iğne (D5) ile direğe (D3) bağlayın. İğneyi dikey olarak ayarlamak için kelepçenin açısını ayarlayın ve iğnenin santrifüj tüpüyle buluştuğundan emin olmak için direğin uzunluğunu ayarlayın.</li>
	<li>Aktüatörü (B1) step motor sürücüsüne (E1) bağlayın ve aktüatörü kontrol etmek için UNO R3 kontrol panosunu ve UNO marş kitinin (E2) joystick modülünü kullanın. Motoru ayrı ayrı sürmek için bir güç adaptörü (örneğin, 9-24 V AC/DC ayarlanabilir güç adaptörü) kullanılabilir.</li>
	<li>Şırınga pompasını (F) gradyan yapma istasyonunun yanına yerleştirin ve şırıngayı iğneye bağlayın.</li>
	<li>Kumanda çubuğunu kullanarak tüp tutucu aşamasını yukarı ve aşağı kontrol edin.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>parça</td>
			<td>madde</td>
		</tr>
<tr>
<td>B1</td>
			<td>Doğrusal sahne aktüatörü</td>
		</tr>
<tr>
<td>E1</td>
			<td>Step motor sürücüsü</td>
		</tr>
<tr>
<td>E2</td>
			<td>UNO projesi süper başlangıç kiti</td>
		</tr>
<tr>
<td>A1</td>
			<td>Ekmek tahtası</td>
		</tr>
<tr>
<td>A2</td>
			<td>Dikey köşeli ayraç</td>
		</tr>
<tr>
<td>B2</td>
			<td>İnce dik açılı braket</td>
		</tr>
<tr>
<td>C1</td>
			<td>Mini seri ekmek tahtası</td>
		</tr>
<tr>
<td>C5</td>
			<td>Küçük V kelepçesi</td>
		</tr>
<tr>
<td>D4</td>
			<td>Minyatür V kelepçesi</td>
		</tr>
<tr>
<td>C2</td>
			<td>Ø12.7 mm alüminyum direk</td>
		</tr>
<tr>
<td>C4, D3</td>
			<td>Mini serisi optik direk</td>
		</tr>
<tr>
<td>D1</td>
			<td>Ø12.7 mm alüminyum direk</td>
		</tr>
<tr>
<td>C3, D2</td>
			<td>Dik açılı Ø1/2" ila Ø6 mm direk kelepçesi</td>
		</tr>
<tr>
<td>C6</td>
			<td>Mini seri kaide direği tutucu tabanı</td>
		</tr>
<tr>
<td>D5</td>
			<td>Künt uç iğnesi</td>
		</tr>
<tr>
<td>F</td>
			<td>Şırınd pompası</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 3: Degrade yapma sistemi bileşenleri.
10. Kesirleme ve sistem montajının algılanıyor (Şekil 2).
<ol><li>UV monitörün optik modülünü tüp deliiciye monte etmek için normal yuvarlak çeneli burette kelepçe kullanın. Borunun bir ucunu (1 cm uzunluğunda ve 0,56 mm iç çap) tüp delicinin bağlantı elemanına, diğer ucunu ise optik modülün Akışkan Giriş portine takın. Fluid Out bağlantı noktasını kesirleyiciye bağlayın.</li>
	<li>Optik modülü, üreticinin el kitabına göre UV monitörün kontrol ünitesine bağlayın.</li>
	<li>Üretici kılavuzuna göre, sinyal çıkış soketini yerdeki dijital dönüştürücüye ve analog giriş bağlantılarına bağlamak için bir koparma kablosu kullanın.</li>
	<li>Dijital dönüştürücüyü normal bir USB kablosu kullanarak bir dizüstü bilgisayara bağlayın ve veri toplama yazılımını kullanarak dönüştürülen dijital sinyalleri kaydedin.</li>
</ol>

<ol><li>Götz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of neurogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).</li>
<li>Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+temporal+specification+of+neural+fates+by+transcription+factor+codes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes.</a> Development. 134, 3771-3780 (2007).</li>
<li>Fiddes, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-Specific+NOTCH2NL+Genes+Affect+Notch+Signaling+and+Cortical+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis.</a> Cell. 173, 1356-1369 (2018).</li>
<li>Lennox, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+DDX3X+mutations+impair+RNA+metabolism+and+neurogenesis+during+fetal+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pathogenic DDX3X mutations impair RNA metabolism and neurogenesis during fetal cortical development.</a> Neuron. 106, 404-420 (2020).</li>
<li>Martynoga, B., Drechsel, D., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+control+of+neurogenesis%3A+A+view+from+the+mammalian+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular control of neurogenesis: A view from the mammalian cerebral cortex.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 4 (10), 008359(2012).</li>
<li>Amadei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Smaug2-based+translational+repression+complex+determines+the+balance+between+precursor+maintenance+versus+differentiation+during+mammalian+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A Smaug2-based translational repression complex determines the balance between precursor maintenance versus differentiation during mammalian neurogenesis.</a> Journal of Neurosci. 35, 15666-15681 (2015).</li>
<li>Yang, G., Smibert, C. A., Kaplan, D. R., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+eIF4E1%2F4E-T+complex+determines+the+genesis+of+neurons+from+precursors+by+translationally+repressing+a+proneurogenic+transcription+program%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">An eIF4E1/4E-T complex determines the genesis of neurons from precursors by translationally repressing a proneurogenic transcription program.</a> Neuron. 84, 723-739 (2014).</li>
<li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Glo1-Methylglyoxal+pathway+that+is+perturbed+in+maternal+diabetes+regulates+embryonic+and+adult+neural+stem+cell+pools+in+murine+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Glo1-Methylglyoxal pathway that is perturbed in maternal diabetes regulates embryonic and adult neural stem cell pools in murine offspring.</a> Cell Reports. 17, 1022-1036 (2016).</li>
<li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporally+defined+neocortical+translation+and+polysome+assembly+are+determined+by+the+RNA-binding+protein+Hu+antigen+R%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111, 3815-3824 (2014).</li>
<li>Rodrigues, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylglyoxal+couples+metabolic+and+translational+control+of+Notch+signalling+in+mammalian+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Methylglyoxal couples metabolic and translational control of Notch signalling in mammalian neural stem cells.</a> Nature Communications. 11, 2018(2020).</li>
<li>Iwasaki, S., Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+toolbox+for+protein+synthesis+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The growing toolbox for protein synthesis studies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).</li>
<li>Chekulaeva, M., Landthaler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyes+on+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Eyes on translation.</a> Molecular Cell. 63, 918-925 (2016).</li>
<li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Selective+mRNA+Translation+in+Mammalian+Cells+by+Polysome+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e52295(2014).</li>
<li>Chassé, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+translation+using+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45, 15(2017).</li>
<li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nature Chemical Biology. 6, 209-217 (2010).</li>
<li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamic+WNT3+secretion+spatiotemporally+regulates+the+neocortical+ribosome+signature+and+mRNA+translation+to+specify+neocortical+cell+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%3A+Official+Journal+of+Society+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Thalamic WNT3 secretion spatiotemporally regulates the neocortical ribosome signature and mRNA translation to specify neocortical cell subtypes.</a> Journal of Neuroscience: Official Journal of Society of Neuroscience. 35, 10911-10926 (2015).</li>
<li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e51455(2014).</li>
</ol>

Yazarlar rakip çıkarlar beyan etmemektedir.

Polisome profilleme, çeviri durumunu hem tek gen hem de genom çapında değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan ve güçlü bir tekniktir14 . Bu raporda, ev yapımı bir platform ve gelişmekte olan fare korteksini analiz etmek için uygulamasını kullanarak polisome profilleme protokolü sunuyoruz. Bu uygun maliyetli platformun montajı ve yüksek hassasiyete sahip sağlam, tekrarlanabilir sakkaroz gradyanları ve polisome profilleme üretilmesi kolaydır.
Tutarlı ve kaliteli sakk...

Memeli beyninin gelişimi sırasında, sinirsel kök hücreler nöronlar oluşturmak için çoğalır ve farklılaşır ve glia1,2 . Bu sürecin pertürbasyonu, birçok nörogelişimsel bozuklukta görüldüğü gibi beyin yapısında ve işlevinde değişikliklere yol açabilir3,4. Nöral kök hücrelerin uygun davranışı, belirli genlerin düzenlenmiş ifadesini gerektirir5. Bu genlerin epigenetik ve transkripsiyonel kontrolü yoğun olarak çalışılmış olsa da, son bulgular diğer seviyelerde gen düzenlemesinin nöral kök hücre çoğalması ve farklılaşması 6 ,7, 8,9,10koordinasyonuna da katkıda bulunduğunu göstermektedir. Bu nedenle, çevirisel kontrol programlarını ele almak, nöral kök hücre kader kararının ve beyin gelişiminin altında kalan mekanizmalar hakkındaki anlayışımızı büyük ölçüde ilerletecektir.
Ribozom profilleme, ribozom benzeşim saflaştırma (TRAP) ve polisome profilleme dahil olmak üzere mRNA'nın çeviri durumunu değerlendirmek için farklı güçlere sahip üç ana teknik yaygın olarak uygulanmıştır. Ribozom profilleme, ribozom korumalı mRNA parçalarını belirlemek için RNA dizilimini kullanır ve her transkriptteki ribozomların çeviri sayısının ve konumunun küresel analizinin, transkript bolluğu ile karşılaştırarak dolaylı olarak çeviri oranını çıkarabilmesini sağlar11. TRAP, ribozomlara bağlı mRNA'ları yakalamak için epitop etiketli ribozomal proteinlerden yararlanır12. Etiketli ribozomal proteinlerin genetik yaklaşımlar kullanılarak belirli hücre tiplerinde ifade edilebildiği göz önüne alındığında TRAP, çevirinin hücre tipine özgü bir şekilde analiz edilmesine izin verir. Buna karşılık, serbest ve kötü çevrilmiş kısmı (daha hafif monosomes) ribozomlar (daha ağır poliomlar) tarafından aktif olarak çevrilenlerden ayırmak için sakkaroz yoğunluğu gradyan fraksiyonunu kullanan polisome profilleme, mRNA13üzerinde ribozom yoğunluğunun doğrudan ölçümünü sağlar. Bu tekniğin sunduğu avantajlardan biri, belirli bir mRNA'nın çevirisini ve genom çapında translatom analizini incelemek için çok yönlülüğüdür14.
Bu yazıda, gelişmekte olan fare serebral korteksini analiz etmek için ayrıntılı bir polisome profilleme protokolünü açıklıyoruz. Sakkaroz yoğunluk gradyanları hazırlamak ve aşağı akış uygulamaları için fraksiyonları toplamak için ev yapımı bir sistem kullanıyoruz. Burada sunulan protokol, diğer doku ve organizma türlerini analiz etmek için kolayca uyarlanabilir.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL RNA içermeyen mikrotüpler</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>10 cm çanak</td><td>Greiner-Bio</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>1M MgCl2</td><td>Invitrogen</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>21-23G iğne</td><td>BD</td><td>305193</td><td></td></tr><tr><td>2M KCl</td><td>Invitrogen</td><td>AM8640G</td><td></td></tr><tr><td>30 mL şırınga</td><td>BD</td><td>302832</td><td></td></tr><tr><td>Künt uç iğne</td><td>VWR</td><td>20068-781</td><td></td></tr><tr><td>Breadboard</td><td>Thorlabs</td><td>MB2530/M</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol mavisi</td><td>Sigma</td><td>115-39-9</td><td></td></tr><tr><td>CD1 fare</td><td></td><td>Charles River Laboratuvarı</td><td></td></tr><tr><td>Kavisli uçlu forseps</td><td>Sigma</td><td>#Z168785</td><td></td></tr><tr><td>Sikloheksimid</td><td></td><td>Sigma</td><td>66-81-9</td></tr><tr><td>Veri toplama yazılımı TracerDAQ</td><td>Ölçüm Hesaplama</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dijital dönüştürücü</td><td></td><td>Ölçüm Hesaplama</td><td>USB-1208LS</td></tr><tr><td>Direct-zol RNA miniprep kiti</td><td>Zymo</td><td>R2070</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Biyo-temel</td><td>12-03-3483</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Bioshop</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Dumont No.5 forseps</td><td>Sigma</td><td>#F6521</td><td></td></tr><tr><td>Fraksiyon toplayıcı</td><td>Bio-Rad</td><td>Model 2110</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Wisent</td><td>311-513-CL</td><td></td></tr><tr><td>Doğrusal kademeli aktüatör</td><td>Rattmmotor</td><td>CBX1605-100A</td><td></td></tr><tr><td>Lusiferaz kontrolü RNA</td><td>Promega</td><td>L4561</td><td></td></tr><tr><td>Maxima birinci iplikçik cDNA sentez kiti</td><td>Themo Fisher</td><td>M1681</td><td></td></tr><tr><td>Minyatür V-kelepçe</td><td>Thorlabs</td><td>VH1/M</td><td></td></tr><tr><td>Mini serisi breadboard</td><td></td><td>Thorlabs MSB7515/M</td><td></td></tr><tr><td>Mini seri optik direk</td><td>Thorlabs</td><td>MS2R/M</td><td></td></tr><tr><td>Mini seri kaide direk tutucu tabanı</td><td>Thorlabs</td><td>MBA1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bio-basic</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Nörobazal medya</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>&Oslash; 12,7 mm alüminyum direk</td><td>Thorlabs</td><td>TRA150/M</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>PerfeCTa SYBR yeşil fastmix</td><td>Quanta Bio</td><td>CA101414-274</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>Wisent</td><td>311-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>Puromisin</td><td>Bioshop</td><td>58-58-2</td><td></td></tr><tr><td>Dik açılı kelepçe</td><td>Thorlabs</td><td>RA90/M</td><td></td></tr><tr><td>Dik açı ve eğik çizgi; 1/2" ila &oslash; 6 mm direk kelepçesi</td><td>Thorlabs</td><td>RA90TR/M</td><td></td></tr><tr><td>Rnase AWAY</td><td>Moleküler BiyoÜrünler</td><td>7002</td><td></td></tr><tr><td>RNaz içermeyen uçlar</td><td>Frogga Bio</td><td>FT10, FT200, FT1000</td><td></td></tr><tr><td>RNase ücretsiz su</td><td>Wisent</td><td>809-115-CL</td><td></td></tr><tr><td>RNasin</td><td>Promega</td><td>N2111</td><td></td></tr><tr><td>İnce dik açılı braket</td><td>Thorlabs</td><td>AB90B/M</td><td></td></tr><tr><td>Küçük V-kelepçe</td><td>Thorlabs</td><td>VC1 / M</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum deoksikolat</td><td>Sigma</td><td>302-95-4</td><td></td></tr><tr><td>Step motor sürücüsü</td><td>SongHe</td><td>TB6600</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Bioshop</td><td>57501</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>331362</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga pompası</td><td>Harvard Aparatı</td><td>70-4500</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga pompası</td><td>Harvard Aparatı</td><td>70-4500</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Biyo-temel</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermofisher Bilimsel</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Tüp delici</td><td>Brandel</td><td>BR-184</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj</td><td></td><td>Beckman Coulter</td><td>L8-70M</td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj tüpleri</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5</td><td>Invitrogen</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>UNO projesi süper başlangıç kiti</td><td>Elegoo</td><td>EL-KIT-003</td><td></td></tr><tr><td>UV monitörü</td><td>Bio-Rad</td><td>EM-1 Econo</td><td></td></tr><tr><td>Dikey braket</td><td>Thorlabs</td><td>VB01A/M</td><td></td></tr></tbody></table>

polisome profilleme kullanarak gelişen fare beyninde Çeviri analizi

Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

Memeli beyninin doğru gelişimi, nöral kök hücre çoğalması ve farklı nöral hücre tiplerine farklılaşmanın ince bir dengesine dayanır. Bu denge, transkripsiyon, transkripsiyon sonrası ve çeviri dahil olmak üzere birden fazla düzeyde ince ayarlı gen ekspresyonu ile sıkı bir şekilde kontrol edilir. Bu bağlamda, büyüyen bir kanıt kütlesi, nöral kök hücre kader kararlarının koordinasyonunda çeviri düzenlemesinin kritik bir rolünü vurgulamaktadır. Polizom fraksiyonasyonu, mRNA çeviri durumunun hem küresel hem de bireysel gen düzeylerinde değerlendirilmesi için güçlü bir araçtır. Burada, gelişmekte olan fare serebral korteksinden hücrelerde çevirisel verimliliği değerlendirmek için şirket içi bir polisome profilleme boru hattı sunuyoruz. Sükroz gradyan hazırlama, doku lizisi, ultrasantrifüjasyon ve mRNA çeviri durumunun fraksiyonasyona dayalı analizi için protokolleri açıklıyoruz.

Bir gösteri olarak, 75 μg RNA (8 embriyodan havuza) içeren kortikal lisat, sakkaroz gradyanı tarafından 12 fraksiyona ayrıldı. 254 nm'deki UV emicilik zirveleri, 40S alt birliğini, 60S alt birliğini, 80S monozomunu ve polizomlarını içeren fraksiyonları tanımladı (Şekil 4A). Büyük ribozomal alt bira için batı lekesi ile fraksiyonların analizi, Rpl10 60S alt birliği (fraksiyon 3), monozom (fraksiyon 4) ve polisomes (fraksiyonlar 5-12) (Şekil 4B)varlığını gösterdi....

Memeli beyninin gelişimi, gen ekspresyonunun çeviri düzeyinde uygun şekilde kontrolini gerektirir. Burada, gelişmekte olan beyindeki mRNA'ların çevirisel durumunu değerlendirmek için montajı kolay bir sakkaroz gradyan ve fraksiyonasyon platformuna sahip bir polisome profilleme sistemini tarif ediyoruz.

Polisome Profilleme Kullanarak Gelişen Fare Beyninde Çeviri Analizi

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...

Transkrasyon düzenlemesi beyin gelişiminde önemli bir rol oynar. Polisome profilleme, mRNA'nın çevirisel durumunu değerlendirmek için yararlı ve güçlü bir araç sağlar ve beyin gelişimi sırasında çevirisel kontrol fonksiyonlarının incelenmesini mümkün hale getirir. Bu yöntem, sakkaroz gradyanları yapmak ve polizom fraksiyonasyonunu değerlendirmek için kolay ve düşük maliyetli bir yaklaşımdır.Bu protokolde, gelişmekte olan fare korteksini analiz etmek için kullanılır. Ancak, diğer sistemleri incelemek için kolayca uyarlanabilir. Altı 10 ila 50% sakkaroz gradyanları hazırlamak için 2.2 azı dişi sakkaroz seyrelterek başlayın.30 mililitrelik bir şırıngayı yaklaşık 16 mililitre% 10 sakkarozla doldurun, şırınga pompasına yerleştirin ve iğneye bağlayın. Şırıngada, tüpte veya iğnede hava kabarcıkları olmadığından emin olun ve artık çözeltiyi çıkarmak için iğnenin ucunu silin. Motorlu sahneyi, iğnenin ucu alttaki tüpün ortasına değdirene kadar yukarı taşıyın.Şırınd pompasını 2,3 mililitrelik bir hacim için dakikada iki mililitrelik bir akış hızına ayarlayın. % 10 sakkaroz çözeltisinin 2,3 mililitresini dağıttıktan sonra, motorlu aşamadan aşağı hareket edin ve altı gradyan için işlemi tekrarlayın. Daha sonra tüplerin altına% 20 sakkaroz çözeltisi ekleyin ve ardından% 30, 40 ve% 50 Embriyonik gün 12'de CD1 fare embriyolarını toplayın ve buz üzerinde buz gibi HBSS içeren 10 santimetrelik bir plakaya yerleştirin.Diseksiyon kapsamı altında, bir embriyoyu buz gibi HBSS içeren altı santimetrelik bir plakaya aktarın. 45 derecelik bir açıyla gözlerden geçerek başın konumunu sabitlemek için 21 ila 23 ölçer iğne kullanın ve iğnelerin plakaya sabit olduğundan emin olmak için bir kuvvet uygulayın. Ortadan yanlara çalışan deriyi ve kafatasını çıkarmak için beş numaralı tokmakları kullanın, ardından koku ampullerini kesin ve kortikal dokuları açığa çıkarmak için menenjileri çıkarın.Kortikal dokuları buz üzerinde iki ila üç mililitre nörobakal ortama kesmek için kavisli tokmaklar kullanın. Dokuları gerektiği gibi farklı embriyolardan çekin. Sekiz ila 10 embriyodan dokular genellikle yaklaşık 200 mikrogram toplam RNA verir.Parçalanmış dokularla nörobakal ortama mililitre başına 100 mikrogramlık son konsantrasyona sikloeximide ekleyin ve 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. 500 x g'daki dokuyu dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin ve üst saltantı atın. Dokuları mililitre sikloeximide başına 100 mikrogram ile desteklenmiş buz gibi PBS ile iki kez yıkayın.Dokuyu yeniden canlandırmak için dört mikrolitre RNaz inhibitörü ve pipet ile desteklenmiş 500 mikrolitre hücre liziz tamponu ekleyin. Dokuyu hafifçe imsilmek için bir insülin iğnesi kullanın. Daha sonra her iki ila üç dakikada bir kısa girdap ile 10 dakika buzda kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra, 2000 x g'daki lisatı dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin ve süpernatantı buz üzerinde yeni bir santrifüj tüpüne aktarın. Bu işlemi 13.000 x g'da bir kez daha santrifüjleme tekrarlayın. Süpernatantı buz üzerinde yeni bir santrifüj tüpüne aktardıktan sonra, bir UV-Vis spektrofotometresi kullanarak doku lisatındaki RNA konsantrasyonunu ölçün.Numuneleri, lisatı ultracentrifuge tüplerinin duvarlarına yavaşça dağıtarak sakkaroz gradyanlarının üzerine yükleyin. Sakkaroz gradyanlarını kovalara hafifçe yerleştirin ve numuneleri 90 dakika boyunca 190, 000 x g ve dört santigrat derecede ultrasantrifüjleyin. Tüp delicisine boş bir ultrasantrifüj tüpü yerleştirin ve alttan iğne ile tüpü hafifçe delin.30 mililitrelik bir şırınnayı 25 mililitre%60 sakkaroz kovalama çözeltisi ile doldurun. Daha sonra şırınna yavaşça bastırın, böylece kovalama çözeltisi boş tüpü doldurur ve algılama için taban çizgisini ayarlamak için 254 nanometre UV monitöründen geçer. Algılama için bir taban çizgisi kaydetmek için UV monitöründe otomatik sıfıra basın, ardından kayda başlamak için yazılımda Oynat'a basın.Sistem bir taban çizgisi oluşturduktan sonra, yazılımdaki kaydı duraklatın ve sistemde artık bir kovalamaca çözümü kalmadığından emin olarak chase çözümünü geri alın. Tüp delicisine bir örnek tüp yükleyin ve alttan iğne ile tüpü hafifçe delin. Yazılıma kaydetmeye başlayın, hatta hava kabarcıkları olmadığından emin olun.Daha sonra şırındıcı pompayı ve kesir toplayıcıyı çalıştırarak polizom fraksiyonlarını toplayın, fraksiyonörü 30 saniyeye ayarlayın. Kesirleri 1,5 mililitrelik tüpler halinde toplayın. Sekiz embriyodan çekilen RNA içeren kortikal lisat, sakkaroz gradyanı ile 12 fraksiyona ayrıldı.254 nanometredeki UV absorbansının zirveleri, 40S alt birliği 60S alt birliğini ve 80S monozom ve polisomelerini içeren fraksiyonları tanımladı. Büyük ribozomal alt ünit Rpl10 için Batı blotunun fraksiyonlarının analizi, 60S alt birliği monozom ve poliomlarında varlığını gösterdi. Buna karşılık, sitoplazmik proteinler, Gapdh ve Csde1, ribozomlarla ilişkili değildi, ancak serbest RNA içeren fraksiyonlarda zenginleştirilmişti.Proteinlerin farklı fraksiyonlarda ayrılmasıyla tutarlı olarak, Gapdh ve sox2 mRNA'ları ağır poliomlar içeren fraksiyonlarda yüksek oranda zenginleştirilmiştir, bu da bu mRNA'ların gelişmekte olan kortekste verimli bir şekilde çevrildiğini düşündürmektedir. Buna karşılık, rpl7 ve rpl35 mRNA'lar monozom içeren fraksiyonda zenginleştirildi ve bastırılmış çeviri önerildi. Tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için sakkaroz gradyanlarının yapımında tutarlılığı korumak önemlidir.Şırınd pompaları sakkarodu çıkarmak için kullanılmalıdır. Fraksiyonasyon ve numune toplama sırasında, sistemin RNase içermeyen su ile yıkanması önemlidir. Bu, önceki örnekten kalan artık sakkarozları azaltır.Bu yöntem, çeşitli dokulardaki mRNA'ların çevirisel durumunu değerlendirmek için kullanılabilir. Platformu kullanarak, bu klasik ve kullanışlı teknik için düşük maliyetli bir çözüm sağlayan polisome profilleme için tutarlı degradeler elde edilebilir.

analysis-translation-developing-mouse-brain-using-polysome

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Burada, stres koşullarında tepki olarak ökaryotik hücrelerin mRNA çevirisi başlatılmasında değişiklikleri analiz etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem olmayan çeviri ribozom ribozomlan çeviri sakaroz Yokuşta hız ayrılık dayanmaktadır.

Polizom profilleme Stres Durumlardaki Çeviri başlatılması Analizi

Bu protokol, in vivo CNS numunelerin translatome incelemek amacıyla polyribosome fraksiyonasyon bölgesinin temel bir değişiklik göstermektedir. Bu, izolasyon ve bağlı RNA ribozom fraksiyonlarının toplam RNA ile karşılaştırılması, translasyon ve transkripsiyon düzenleme küresel değerlendirmesini sağlar.

Polyribosome Fraksiyonu tarafından Santral Sinir Sistemi Translatome in vivo sorguluyor

Ribozomlar protein sentezinde önemli bir rol oynamaktadır. Sükroz yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile Polyribosome (Polizom) fraksiyonlara ayırma, bir genom geniş bir ölçekte tek mRNA translasyon etkinliklerine doğrudan belirlenmesini sağlar. Buna ek olarak, bu yöntem, şaperonlar ve sinyal molekülleri gibi ribozom-ve Polizomdan ilişkili faktörleri biyokimyasal analizi için kullanılabilir.

Bir genom Ölçeği Polizom Fraksiyonu ve Memeli Translatomes Analizi

Hücrelerin strese uyum sağlama yeteneği, hayatta kalmaları için çok önemlidir. mRNA translasyonunun düzenlenmesi, proteomun hızlı bir şekilde düzenlenmesini sağlayan böyle bir adaptasyon stratejisidir. Burada, stres koşulları altında seçici olarak çevrilen spesifik mRNA'ları tanımlamak için standartlaştırılmış bir polizom profilleme protokolü sunuyoruz.

Polizom Profil Yöntemi ile memeli hücrelerine selektif mRNA dönüşümüyle Değerlendirilmesi

Protein sentezi kontrolü esas olarak translasyon başlatma adımında gerçekleşir, eksiklikler çeşitli bozukluklarla bağlantılıdır. Etiyolojilerini daha iyi anlamak için, burada translasyon başlatma faktörü eIF4G1'in bir mutantının varlığında mos transkriptinin translasyonunu değerlendiren Xenopus laevis oositlerini kullanan bir protokol tanımladık.

Ksenopus Translation Düşüklüğü Belirlemek için Bir Model Olarak laevis

Ribozom yapısı kapsamlı bir şekilde karakterize edilmiş olsa da, polizomların organizasyonu hala yeterince çalışılmamıştır. Bu bilgi eksikliğinin üstesinden gelmek için, burada memeli polizomlarının hava ve sıvıda atomik kuvvet mikroskobu (AFM) ile doğru görüntülenmesi için ayrıntılı bir hazırlık protokolü sunuyoruz.

Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Beyin Polisomlar de Peering

Polysome profil çıkarma tekniği genel amacı, protein sentezi sırasında translasyonel etkinlik bireysel mRNA'ların veya transcriptome mRNA'ların analizidir. Protein sentezi yönetmelik, çeviri harekete geçirmek ve baskı sağlık ve birden çok insan hastalıkları için önemli bir yöntemdir.

Polysome LEISHMANIA, insan hücreleri ve fare Testis profil oluşturma

Burada izole periosteum fare kalp üzerinde profil oluşturma polysome gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Biz kalp perfüzyon, profil oluşturma polysome ve polysome kesirler ile ilgili mRNA'ların, miRNAs ve polysome Proteom analizi için yöntemler açıklanmaktadır.

Dinamik proteomik ve miRNA analiz polizomlar izole fare kalp sonra Langendorff perfüzyon üzerinden

Burada RiboTag sistemini kullanarak erişkin erkek fare mikrop hücrelerinin belirli popülasyonlarından ribozomların ve ilişkili RNA'nın immünopresipitesini tanımladık. Stratejik üreme ve dikkatli immünopresipitasyon, germ hücre translatomu hakkında bilgi veren ve mutant fenotiplerin mekanizmaları hakkında bilgi veren temiz, tekrarlanabilir sonuçlar la sonuçlanır.

Erkek Farenin Germ Hücrelerinde RiboTag İmmünanyağış

Bu protokol, in vitro olgunlaşma sırasında tek oositlerde mRNA çevirisinin düzenlenmesini incelemek için bir muhabir testini açıklar.

Tek Bir Oocyte Reporter Tahlil Kullanarak In vitro Olgunlaşma Sırasında Maternal mRNA Çeviri Programını Tanımlama

Bu protokol, otomatik gradyan üreticileri veya gradyan fraksiyonasyon sistemleri kullanmadan bir çoklu profilin nasıl oluşturulacağını açıklar.

Degrade Yapıcılar veya Fraksiyonasyon Sistemleri Olmadan Polizom Profilleme

Keşfedin, gelişen fare beyninde mRNA çeviri verimliliğini değerlendirmek için polisom profilleme yöntemini. Bu düşük maliyetli protokol, nöral doku çalışmalarında çeviri düzenlemesini incelemek için güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlar.

Polisome Profilleme Kullanarak Gelişen Fare Beyninde Çeviri Analizi

Daha fazla video keşfet