Kombine Ozon ve LPS kaynaklı Murine Akut Akciğer Hasarı Sırasında Akciğer Hücresel Adaptasyonlarının Görselleştirilmesi
21 Mart 2021
Kombine ozon ve bakteriyel endotoksin maruz fareler nötrofiller de dahil olmak üzere geniş yayılmış hücre ölümü gösterir. Sitoskeletal lamellipodia'nın bozulması, karmaşık V ATP sintaz alt β birliğinin hücresel ekspresyonunun artması ve bronko-alveoler lavajda anjiyostatin, akciğer immün yanıtının baskılanması ve nötrofil alımının gecikmesi gibi hücresel adaptasyonları gözlemledik.
Merhaba, benim adım Gurpreet. Laboratuvarımız akciğer iltihabı ve onarımı mekanizmalarını araştırır. Merhaba, benim adım Jessica ve floresan mikroskobik yöntemler kullanarak ozon kaynaklı laboratuvar faresi alveolleri araştırıyorum.
Herkese merhaba, benim adım Manpreet. Ve hayvan görüntüleme yöntemleriyle akciğer iltihabı üzerinde çalışıyorum. Akciğerler, ozon gibi steril ve bakteriyel lipopolisakkarit veya LPS gibi mikrobiyal bileşenlerden kaynaklanan doğrudan ve dolaylı hakaretlerle sürekli olarak karşı karşıyadır.
Ezici bir konak yanıtı, düzensiz konak immün, pıhtılaştırıcı ve doku tadilatı nedeniyle akciğer nötrofil alımı ile karakterize olarak solunum ve akut akciğer hasarına neden olabilir. Çeşitli bölmelerin, yani bronko-alveolar lavaj sıvısının, yani BAL'ın, akciğer vasküler perfüzyonun, yani LVP'nin, sol akciğer kriyo bölümlerinin, periferik kanın ve sternal ve femur kemik iliğinin kapsamlı bir analizini açıklıyoruz. Ozon maruziyetleri için, fareleri özel indüksiyon kutusuna hafifçe yerleştirin ve fareleri iki saat boyunca sürekli olarak 0,05 PPM ozona maruz kalın.
LPS maruziyetleri için, fareleri hafif intraperitoneal ketamin ve ksilazin karışımı altında uyuşturun. Şimdi LPS çözeltisine farelerin harici nares içine 50 mikrolitre aşıla. Kontrol farelerini 50 mikrolitre steril salin ile aşıla.
Belirtilen zaman noktalarında, fareleri tam doz ketamin ve ksilazin karışımı ile uyuşturun. Daha sonra fareleri sterilize edin ve pedal reflekslerini kontrol edin, yani arka uzuv basamaklarından birini kıstırın ve uzuvların geri çekilmesini gözlemleyin. Refleks olmaması derin anestezi demektir.
Şimdi göğüs kemiğinin altından bir kesik yap ve kalbi açığa çıkar. Heparinize şırıngaya bağlı 25 kalibrelik bir iğneyi sağ ventriküle yerleştirin ve kalp delinmesi ile kan alın. Heparinize şırıngalardaki kanı toplayın ve daha fazla işlem için mikroyakıt tüplerinde boşaltın.
Trakeal bölgeyi aşırı dokudan temizlemek için cımbız veya künt tokmakları dikkatlice kullanın. Şimdi akciğerleri açığa çıkarmak için göğüs kafesini kesin. Nefes borusunun altına pamuklu bir bağ geçirin ve şimdilik böyle bırakın.
Trakeostomi için akciğerlerden uzunluğunun yaklaşık üçte birinde aralıklı trakeayı kesin. Trakeaya 28 kalibrelik bir polietilen canül yerleştirin. Kanülü yerinde tutmak için pamuk bağını sıkıca bağlayın.
Canülü çökertmediğinizden emin olun. Şimdi yavaş yavaş bir mL şırınna yardımıyla 0,5 ml PBS'yi kanolaya enjekte edin. PBS enjekte ettikten sonra, emmeye direnmediği sürece şırınnayı epire edin.
Aspire sıvıyı etiketli bir mikrofaj tüpünde toplayın ve bu işlemi iki kez daha tekrarlayın. Akciğer perfüzyonu sırasında herhangi bir yedeklemeden kaçınmak için torasik ve karın yarıları arasındaki yerde azalan torasik aortu kesin. Kesilen aort ucunun yakınındaki boşluğu kansız olarak lekele.
Daha sonra akciğerleri 0,5 ML oda sıcaklığında heparinize salin ile perfuse, sağ ventrikülden enjekte edin. Vasküler perfüzyonu, alçalaşı torasik aortun kesik ucundaki boşluktan toplayın. Sağ bronşu lige ettikten sonra, sol akciğerin beş dakika boyunca 0,5 ML paraformaldehit ile şişmesine izin verin.
Şimdi karın kısmını sterilize edin. Karın kısmını kes ve pelvik kemikten ayır. Pelvik kemiği toplayın ve sol ve sağ uyluk kemiği kemiklerini buzda tutulan tuzlu su dolu bir petri kabında izole edin.
Ventral göğüs kafesini ve sternumu, aynı zamanda buzda tutulan tuzlu su dolu bir Petri kabına toplayın. Kemiklerin kesik uçlarını 1 ML şırınga üzerine iyi yerleştirilmiş iğneler kullanarak 0,5 ML tuzlu su ile dört kez perfuse edin. Kesirleri her kemikten etiketli Falcon tüplerine toplayın, filtrelerle donatılmış ve buza yerleştirin.
Tüm numuneleri 3000 RPM'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatantları toplayın ve flaş dondurun. Hücreleri en az 200 mikrolitre PBS'de yeniden inşa edin.
Toplam lökosit sayısını gerçekleştirin. Bal'ın başka bir sıvısını kalsein yeşili ve kırmızı ethidium homodimer bir leke karışımı ile lekelenin. Kemokinler ve toplam protein konsantrasyonu için süpernatant analiz edin.
Biyokimyasal ve immün proteinler için her slaytta iki sitospin ve leke hazırlamak için hücreleri santrifüjleyin. Tüm gruplar için akciğer kriyoseksiyonlarında değiştirilmiş H ve E boyama gerçekleştirin. Birleştirilmiş görüntü panelinde 150 ila 200 hücreyi el ile anahat olarak özetleyin.
Anahattılan ilgi alanlarını tüm kanallara kopyalayın. Tüm kanallar için önceden ayarlanmış parametreleri ölçün. Lekeli molekülün floresan yoğunluğunu DAPI veya CD61 ile bölün.
Bunlar DAPI veya CD 61 normalleştirilmiş floresan yoğunluk oranları olarak terimlendirilir. Daha sonra pozlamadan sonra değişiklikleri değerlendirmek için parametreleri çizin. Kombine maruziyetler toplam BAL, LVP veya sternal kemik iliği hücre sayılarında herhangi bir değişikliğe neden olmamasına rağmen, fareler 24 saatte sistemik lökositoz gösterdi ve bunu maruziyet sonrası 72 saatte lökopeni izledi.
Bunlar periferik kan hücresi sayımlarında görüntülenir. Uyluk kemiği iliği hücre sayıları, tüm zaman noktalarına kıyasla 72 saatte geç ani artış gösterir. Bal sitospin görüntüsünde 24 saatte polimorfonukleer hücrelerde Siglec-F ve CX3CRI lekelerinin olmamasına dikkat edin.
BAL ve LVP sitospinleri sıfır saatte büyük CD11b ve GR1 pozitif mononükleer hücrelerin varlığını gösterdi. Polimorfonuklear hücreler maruziyet sonrası tüm bölmelerde baskın hücre tipi olarak sunulmuştur. BAL toplam protein içeriği kombine maruziyet sonrası 36 saat ile en yüksek düzeydeydi.
Ancak maruziyet sonrası LVP proteini değişmedi. Eotaxin-2 ve interlökin-2 düzeyleri LVP'de dört saat içinde en yüksekti. Bu kemokinler BAL fraksiyonunda azaltıldı.
İlginçtir ki, nötrofil endişe verici IL-16 ve birçok doğuştan gelen kemokin LVP'de değiştirildi, ancak BAL fraksiyonunda değil. Bal hücrelerinin %95'inden fazlası kortikal aktin, lamellipodia, stres ve tübulin lifleri gösteren mono nükleerdi ve mitotracker lekelerinin azalması için güçlü bir şekilde pozitifti. Dört saat içinde, aksin kaybetmiş, ancak kırmızı ve daha düşük azaltılmış mitotracker lekelemesinde gösterildiği gibi yayılmış bir mikrotübül ağı gösteren dairesel BAL hücreleri gözlemledik.
Kombine maruziyetten erken sonra, BAL hücreleri kısmen tehlikeye giren hücreleri gösteren kalsenin ve etiyum homodimer-1 için çift pozitif göründü. 36 saatte BAL hücreleri büyük ölçüde uygulanabilirdi, bu yeşildi. BAL alveolar makrofajlarda ve nötrofillerde ayrık ATP alfa ve Ly6G lekelenmeleri gözlemledik.
DAPI normalleştirilmiş ATP alfasında azalma ve hücre içi Ly6G protein içeriğinde bir artış gözlemledik. Kombine maruziyetler Bal, doğal katil hücre ve K1.1, nötrofil ATP, alt birim PETA, çoğalma faktörü, Ki-67 ve maruziyet sonrası BAL hücrelerinde nötrofil GR1, trombosit CX3CRI ve anti-anjiyojenik anjiyostatin proteininin sürekli ekspresyonlarına neden oldu. Bronşiyolar ve alveolar septal hasar beklenmesine rağmen, maruziyetten 36 saat sonra daha büyük damarlarda hücresel agregaların gözlemlenerek gözlemlenerek tespit edildi.
Son olarak, bu tabloda özetleyici sonuçlarımız var. Murine modelimizin, invaziv hücre ölümü ve enfeksiyonlarının mekanizmalarını incelemek için ikinci seviye muhafaza laboratuvarlarında çoğaltılabilen kolayca erişilebilir bir prototip olarak hizmet ettiğini umuyoruz. Teşekkürler.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, kombine ozon ve bakteriyel endotoksin maruziyetinin farelerde akciğer inflamasyonu ve hücresel yanıtlar üzerindeki etkilerini incelemektedir. Temel bulgular arasında, özellikle nötrofillerde yaygın hücre ölümü ve belirgin hücresel adaptasyonlar yer almaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- İmmünoloji
- Solunum Biyolojisi
Arka Plan
- Ozon ve bakteriyel lipopolisakkaridlerin (LPS) akciğer inflamasyonunu tetiklediği bilinmektedir.
- Bu hasarlara verilen hücresel yanıtların anlaşılması, terapötik stratejilerin geliştirilmesi açısından kritik öneme sahiptir.
- Nötrofiller, akciğerlerdeki bağışıklık yanıtında önemli bir rol oynar.
- Hücresel adaptasyonlar, inflamasyonun şiddetini ve potansiyel iyileşme mekanizmalarını belirtebilir.
Çalışmanın Amacı
- Ozon ve endotoksin maruziyetinin akciğer hücresi canlılığı üzerindeki etkisini değerlendirmek.
- Akciğer enflamasyonu ve onarım mekanizmalarını araştırmak.
- Kombine maruziyetlere yanıt olarak gelişen spesifik hücresel adaptasyonları tanımlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Ozon ve bakteriyel endotoksinle maruz bırakılmış farelerin kullanıldığı hayvan modeli.
- Bronkoalveoler lavaj yoluyla hücre ölümü ve bağışıklık yanıtının değerlendirilmesi.
- Hücresel değişiklikleri analiz etmek için kullanılan floresan mikroskopik yöntemler.
- Enflamasyon ve hücresel fonksiyonla ilişkili protein ekspresyonunun ölçümü.
Temel Sonuçlar
- Özellikle nötrofillerde yaygın hücre ölümü gözlemlenmiştir.
- Etkilenen hücrelerde sitoskeletal lamellipodiaların bozulduğu kaydedilmiştir.
- Kompleks V ATP sentaz alt birimi 尾 ve anjiyostatinin ekspresyonunda artış tespit edilmiştir.
- Akciğer bağışıklık yanıtının baskılanması ve nötrofil göçünün gecikmesi önemli bulgular arasındaydı.
Sonuçlar
- Ozon ve endotoksinle kombine maruziyet, ciddi akciğer hücresi hasarına yol açar.
- Hücresel adaptasyonlar, inflamatuar stresle başa çıkma girişimlerini yansıtıyor olabilir.
- Bu mekanizmaları anlamak, akciğer hastalıkları için gelecekteki terapötik yaklaşımlara bilgi sağlayabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Kombine ozon ve LPS kaynaklı akut akciğer hasarının bu fare modeli, çevresel toksikoloji ve immünomodülatör taramasıyla ilgili inflamatuar yolakların ve hücresel stres yanıtlarının incelenmesi için kontrollü bir sistem sunmaktadır. Bu yaklaşım, nötrofil dinamiklerinin, kemokin gradyanlarının ve çoklu kompartmanlar genelindeki sitoskeletal yeniden şekillenmenin kantitatif görselleştirilmesine olanak tanıyarak, pulmoner hedefli adayların mekanistik risk analizini desteklemektedir. Gecikmiş immün yanıtları ve biyobelirteç ko-lokalizasyonunu (örneğin, ATP sentaz alt birimleri, anjiyostatin, Ly6G) yakalayan bu yöntem, preklinik güvenlik değerlendirmesinde hedef etkileşimi ve yolak modülasyonu için öngörücü değer sağlamaktadır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Nötrofil göçü ve alveolar makrofaj disfonksiyonunda TLR4 aracılı yolakların ve oksidatif stres mekanizmalarının incelenmesine olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Pulmoner inflamasyonu etkileyen hedeflerin riskini azaltmak amacıyla BAL sıvısı, akciğer dokusu ve kemik iliğinden çoklu okumalar (canlılık, kemokin seviyeleri, protein ekspresyonu) sağlar.
- Bilimsel Değer: Kombine hasar koşulları altındale sitoskeletal yeniden yapılanma, mitokondriyal fonksiyon ve hücre dışı matris etkileşimlerinde yer alan hedeflerin fonksiyonel validasyonunu destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: ATP sentaz alt birimleri ve Ly6G için DAPI-normalize edilmiş floresan yoğunluk oranları gibi standartlaştırılmış, ölçülebilir çıktılar üreterek laboratuvarlar arası analiz tekrarlanabilirliğini sağlar.
- Operasyonel Değer: Vasküler ve alveolar kompartmanlarda gecikmiş lökosit kinetiğinin (24. saatte lökositoz, 72. saatte lökopeni) ve kemokin gradyanlarının (eotaxin-2, IL-16) takibi yoluyla immünomodülatör ajanların taranmasını kolaylaştırır.
- Bilimsel Değer: Mitotracker ve hücre iskeleti markörleri ile eş boyama yoluyla, bileşiklerin hücre altı yapılar (aktin, tübülin, mitokondriyal membran potansiyeli) üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesine olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Kemik iliği perfüzat analizi aracılığıyla akut akciğer hasarı modellerini sistemik yanıtlarla ilişkilendirerek, acil miyelopoez için translasyonel biyobelirteç keşfini destekler.
- Operasyonel Değer: Preklinik çalışmalarda dozaj programları ve terapötik pencereler hakkında bilgi sağlamak amacıyla hücresel adaptasyonların (örneğin, sürekli angiostatin, geçici Ki-67) boylamsal olarak izlenmesine olanak tanır.
- Bilimsel Değer: Steril inflamatuar ortamlarda koagülasyon yollarını (örneğin, plazminojen/angiostatin ekseni) veya nötrofil hücre dışı tuzak oluşumunu hedefleyen bileşikleri değerlendirmek için hastalığa özgü bir sistem sunar.
İş Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, erken hedef hipotez testlerinden preklinik etkinlik taramasına kadar uzanan keşif sürekliliğine, özellikle de nötrofil kaynaklı akciğer hasarı ve stromal-immün etkileşim modifikatörleri için uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Gözlemlenen hücresel değişiklikleri belirli enflamatuar tetikleyicilere atfetmek için ozon dozu (0.05 ppm) ve LPS uygulaması (50 µL intranazal) gibi değişkenleri izole ederek yolak aydınlatmasını destekler.
- Tarama: Kemokin konsantrasyonları (eotaxin-2, IL-16), protein ekspresyonu (GR1, CX3CR1) ve viabilite metrikleri (kalsein/etidyum homodimer oranları) dahil olmak üzere ölçülebilir uç noktaları olan, assay'e hazır biyolojik sistemler sağlar.
- Analitik: Farklı zaman noktaları ve kompartmanlar arasında normalize edilmiş floresan yoğunluk oranlarının istatistiksel karşılaştırmasına olanak tanıyarak, bileşik kaynaklı hücresel adaptasyon değişimlerinin objektif değerlendirilmesini kolaylaştırır.
- Translasyonel Araştırma: Alveolar makrofaj ve nötrofil yanıtlarını kemik iliği çıktısı ile ilişkilendirerek, myeloid hedefli müdahalelere ilişkin preklinik kararlara veri sağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Standardize floresan mikroskopi ve kompartmanal örnekleme kullanarak çeşitli pulmoner hasarların (kirleticiler, patojenler, terapötikler) değerlendirilmesi için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Akciğer hasarında oksidatif stres, mitokondriyal disfonksiyon ve nötrofil aktivasyonu arasındaki mekanistik bağlantıları ortaya çıkararak hedef validasyonundaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Doku toplama, sitospin hazırlama ve çok kanallı görüntüleme için tanımlanmış protokoller aracılığıyla standardizasyonu teşvik ederek laboratuvarlar arası değişkenliği azaltır.
- Stratejik Değer: Fonksiyonel gerileme ortaya çıkmadan önce maladaptif onarımın erken biyobelirteçlerini (örneğin, kalıcı angiostatin, hücre iskeleti çökmesi) tanımlayarak devam/tamam kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Çok bölmeli modellerde gecikmiş nötrofil yanıtlarını ve kemokin gradyan çözünürlüğünü modüle etme yeteneğine dayanarak adayların riskle ayarlanmış önceliklendirmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Fare cerrahi teknikleri (kardiyak ponksiyon, trakeostomi, kemik iliği perfüzyonu) ve floresan mikroskobisi konularında uzmanlık gerektirir.
- Kriyoseksiyon ve sitospin analizi için kriyostat, santrifüj ve multispektral görüntüleme altyapısına bağımlıdır.
- Çalışmalar arasında veri karşılaştırılabilirliğini sağlamak için boyama panellerinin (örneğin, DAPI/CD61 normalizasyonu, Mitotracker, Ly6G) ekipler arası uyumlandırılmasını gerektirir.
- Fare strainlerinin ozona ve LPS'ye duyarlılığı ve örnekleme zamanının sirkadiyen ritmi gibi modele özgü değişkenler dikkate alınmalıdır.
- Doku hasadının uç nokta niteliği ile sınırlıdır; boylamsal intravital görüntüleme, gerçek zamanlı takip için tamamlayıcı yaklaşımlar gerektirecektir.
