Name: Canlı Memeli İşitsel Saç Hücrelerinde Nano ölçekli Çözünürlüğe Sahip Stereosilia Bundle Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Keşfedin, HPICM ile canlı kemirgen işitsel saç hücrelerinin stereosilia demetlerini nanometre çözünürlüğünde ve temassız olarak görüntüleme yöntemini. Bu teknik, canlı hücrelerin dinamik ultrastructural değişikliklerini saatler boyunca zarar vermeden incelemeyi mümkün kılar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Projenin tüm aşamalarında uzun vadeli destek ve tavsiyeler için Prof. Yuri Korchev'e (Imperial College, UK) teşekkür ederiz. Dr. Pavel Novak ve Andrew Shevchuk'un (Imperial College, UK) yanı sıra Oleg Belov'a (Rusya Ulusal Odyoloji Araştırma Merkezi) yazılım geliştirme konusundaki yardımları için de teşekkür ederiz. Çalışma NIDCD/NIH (R01 DC008861 ve R01 DC014658 ila G.I.F.) tarafından desteklenmiştir.

<ol><li>Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+inner+hair+cell+mechanotransducer+channels+using+high-speed+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging.</a> Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).</li>
<li>Effertz, T., Becker, L., Peng, A. W., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositol-4%2C5-bisphosphate+regulates+auditory+hair-cell+mechanotransduction-channel+pore+properties+and+fast+adaptation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositol-4,5-bisphosphate regulates auditory hair-cell mechanotransduction-channel pore properties and fast adaptation.</a> The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (48), 11632-11646 (2017).</li>
<li>Peng, A. W., Gnanasambandam, R., Sachs, F., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+independent+modulation+of+auditory+hair+cell+mechanotransduction+channel+open+probability+implicates+a+role+for+the+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience+the+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adaptation independent modulation of auditory hair cell mechanotransduction channel open probability implicates a role for the lipid bilayer.</a> The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (10), 2945-2956 (2016).</li>
<li>Engström, H., Engström, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+hairs+on+cochlear+sensory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+research%22%5BJournal%5D)">Structure of the hairs on cochlear sensory cells.</a> Hearing research. 1 (1), 49-66 (1978).</li>
<li>Conchello, J. A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 920-931 (2005).</li>
<li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361 (6405), 880-887 (2018).</li>
<li>Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348(2015).</li>
<li>Pickles, J. O., Comis, S. D., Osborne, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-links+between+stereocilia+in+the+guinea+pig+organ+of+Corti%2C+and+their+possible+relation+to+sensory+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Cross-links between stereocilia in the guinea pig organ of Corti, and their possible relation to sensory transduction.</a> Hearing Research. 15 (2), 103-112 (1984).</li>
<li>Furness, D. N., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-links+between+stereocilia+in+the+guinea+pig+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Cross-links between stereocilia in the guinea pig cochlea.</a> Hearing Research. 18 (2), 177-188 (1985).</li>
<li>Jacobs, R. A., Hudspeth, A. J. Ultrastructural correlates of mechanoelectrical transduction in hair cells of the bullfrog’s internal ear. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJacobs%2C+RA+%22Cold+Spring+Harbor+Symposia+on+Quantitative+Biology%22">Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology</a>. 55, 547-561 (1990).</li>
<li>Goodyear, R. J., Marcotti, W., Kros, C. J., Richardson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+properties+of+stereociliary+link+types+in+hair+cells+of+the+mouse+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Development and properties of stereociliary link types in hair cells of the mouse cochlea.</a> The Journal of Comparative Neurology. 485 (1), 75-85 (2005).</li>
<li>Kachar, B., Parakkal, M., Kurc, M., Zhao, Y., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+structure+of+hair-cell+tip+links%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-resolution structure of hair-cell tip links.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 13336-13341 (2000).</li>
<li>Vélez-Ortega, A. C., Freeman, M. J., Indzhykulian, A. A., Grossheim, J. M., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+current+is+essential+for+stability+of+the+transducing+stereocilia+in+mammalian+auditory+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction current is essential for stability of the transducing stereocilia in mammalian auditory hair cells.</a> eLife. 6, 1-22 (2017).</li>
<li>Ivanchenko, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+scanning+electron+microscopy+of+anti-PKHD1L1+immuno-gold+labeled+mouse+hair+cell+stereocilia+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">Serial scanning electron microscopy of anti-PKHD1L1 immuno-gold labeled mouse hair cell stereocilia bundles.</a> Scientific Data. 7 (1), 182(2020).</li>
<li>Hadi, S., Alexander, A. J., Vélez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin-XVa+controls+both+staircase+architecture+and+diameter+gradation+of+stereocilia+rows+in+the+auditory+hair+cell+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology+JARO%22%5BJournal%5D)">Myosin-XVa controls both staircase architecture and diameter gradation of stereocilia rows in the auditory hair cell bundles.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology JARO. 21 (2), 121-135 (2020).</li>
<li>Metlagel, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+cryo-tomography+of+vestibular+hair-cell+stereocilia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Electron cryo-tomography of vestibular hair-cell stereocilia.</a> Journal of Structural Biology. 206 (2), 149-155 (2019).</li>
<li>Langer, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stimulation+of+individual+stereocilia+of+living+cochlear+hair+cells+by+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Mechanical stimulation of individual stereocilia of living cochlear hair cells by atomic force microscopy.</a> Ultramicroscopy. 82 (1-4), 269-278 (2000).</li>
<li>Dufrêne, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+nanomicrobiology+using+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Towards nanomicrobiology using atomic force microscopy.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (9), 674-680 (2008).</li>
<li>Putman, C. A., van der Werf, K. O., de Grooth, B. G., van Hulst, N. F., Greve, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelasticity+of+living+cells+allows+high+resolution+imaging+by+tapping+mode+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Viscoelasticity of living cells allows high resolution imaging by tapping mode atomic force microscopy.</a> Biophysical journal. 67 (4), 1749-1753 (1994).</li>
<li>Gavara, N., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncontact+microrheology+at+acoustic+frequencies+using+frequency-modulated+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Noncontact microrheology at acoustic frequencies using frequency-modulated atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 7 (8), 650-654 (2010).</li>
<li>Cartagena-Rivera, A. X., Van Itallie, C. M., Anderson, J. M., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+surface+supracellular+mechanical+properties+in+polarized+epithelium+using+noninvasive+acoustic+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Apical surface supracellular mechanical properties in polarized epithelium using noninvasive acoustic force spectroscopy.</a> Nature Communications. 8 (1), 1030(2017).</li>
<li>Katsuno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRIOBP-5+sculpts+stereocilia+rootlets+and+stiffens+supporting+cells+enabling+hearing%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">TRIOBP-5 sculpts stereocilia rootlets and stiffens supporting cells enabling hearing.</a> JCI Insight. 4 (12), (2019).</li>
<li>Hansma, P. K., Drake, B., Marti, O., Gould, S. A., Prater, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+scanning+ion-conductance+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The scanning ion-conductance microscope.</a> Science. 243 (4891), 641-643 (1989).</li>
<li>Korchev, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+scanning+ion-conductance+microscope+for+imaging+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Specialized scanning ion-conductance microscope for imaging of living cells.</a> Journal of Microscopy. 188 (Pt 1), 17-23 (1997).</li>
<li>Shevchuk, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+proteins+in+membranes+of+living+cells+by+high-resolution+scanning+ion+conductance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+ed+in+English%22%5BJournal%5D)">Imaging proteins in membranes of living cells by high-resolution scanning ion conductance microscopy.</a> Angewandte Chemie (International ed in English. 45 (14), 2212-2216 (2006).</li>
<li>Novak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+live-cell+imaging+using+hopping+probe+ion+conductance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nanoscale live-cell imaging using hopping probe ion conductance microscopy.</a> Nature Methods. 6 (4), 279-281 (2009).</li>
<li>Vélez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+live+cochlear+stereocilia+at+a+nanoscale+resolution+using+hopping+probe+ion+conductance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of live cochlear stereocilia at a nanoscale resolution using hopping probe ion conductance microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1427, 203-221 (2016).</li>
<li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+scanning+patch-clamp%3A+new+insights+into+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal+Official+Publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">High-resolution scanning patch-clamp: new insights into cell function.</a> FASEB Journal Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 16 (7), 748-750 (2002).</li>
<li>Frolenkov, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-channel+recordings+from+the+apical+surface+of+outer+hair+cells+with+a+scanning+ion+conductance+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Single-channel recordings from the apical surface of outer hair cells with a scanning ion conductance probe.</a> Association for Research in Otolaryngology. Abs. 444, (2004).</li>
<li>Sánchez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncontact+measurement+of+the+local+mechanical+properties+of+living+cells+using+pressure+applied+via+a+pipette%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Noncontact measurement of the local mechanical properties of living cells using pressure applied via a pipette.</a> Biophysical Journal. 95 (6), 3017-3027 (2008).</li>
<li>Korchev, Y. E., Negulyaev, Y. A., Edwards, C. R., Vodyanoy, I., Lab, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+localization+of+single+active+ion+channels+on+the+surface+of+a+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional localization of single active ion channels on the surface of a living cell.</a> Nature Cell Biology. 2 (9), 616-619 (2000).</li>
<li>Shevchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angular+approach+scanning+ion+conductance+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Angular approach scanning ion conductance microscopy.</a> Biophysical Journal. 110 (10), 2252-2265 (2016).</li>
<li>Furness, D. N., Katori, Y., Nirmal Kumar, B., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dimensions+and+structural+attachments+of+tip+links+in+mammalian+cochlear+hair+cells+and+the+effects+of+exposure+to+different+levels+of+extracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The dimensions and structural attachments of tip links in mammalian cochlear hair cells and the effects of exposure to different levels of extracellular calcium.</a> Neuroscience. 154 (1), 10-21 (2008).</li>
</ol>

Yazarların rakip çıkarları yok.

Başarılı HPICM görüntüleri elde etmek için kullanıcıların düşük gürültü ve düşük titreşim sistemi kurmaları ve uygun pipetler üretmeleri gerekir. Canlı hücre görüntülemeyi denemeden önce sistemin kararlılığını test etmek için AFM kalibrasyon standartlarının kullanılmasını şiddetle öneririz. Sistemin çözünürlüğü test edildikten sonra, kullanıcılar herhangi bir canlı hücre görüntüleme denemeden önce görüntüleme ayarlarını tanımak için Corti örneklerinin sabit organını görüntülemeyi düşünebilirler.
<p class="jove_conten...

İşitsel saç hücrelerindeki stereosilia demetlerinin optik mikroskopi ile görselleştirilecek kadar büyük olmasına ve bir yama kelepçesi deneyinde canlı hücrelerde saptırılmasına rağmen, uç bağlantıları gibi transdüksiyon makinelerinin temel yapısal bileşenleri sadece ölü hücrelerdeki elektron mikroskopisi ile görüntülenebilir. Memeli işitsel saç hücrelerinde, transdüksiyon makineleri uç bağlantılarının alt uçlarında, yani daha kısa sıra stereosili1'in uçlarında bulunur ve stereosilia2,3'ünuçlarındaki sinyal yoluyla yerel olarak düzenlenir. Ancak stereosilinin küçük boyutları nedeniyle bu konumdaki yüzey yapılarının canlı saç hücrelerinde etiketsiz görüntülenmesi mümkün değildir.
Memeli koklea iki tür işitsel duyusal hücreye sahiptir: iç ve dış saç hücreleri. İç saç hücrelerinde, stereosili dış saç hücrelerindekilere kıyasla daha uzun ve kalındır4. Stereosilinin birinci ve ikinci sırası fare veya sıçan iç saç hücrelerinde 300-500 nm çapındadır. Işığın kırınımı nedeniyle, etiketsiz optik mikroskopi ile elde edilebilen maksimum çözünürlük yaklaşık 200 nm'dir. Bu nedenle, iç saç hücresi demetinin birinci ve ikinci sıraları içindeki bireysel stereosililerin görselleştirilmesi optik mikroskopi ile nispeten kolaydır. Buna karşılık, iç saç hücrelerinde daha kısa sıra stereosili ve dış saç hücrelerinin tüm stereosilileri 100-200 nm civarında çaplara sahiptir ve optik mikroskopi ile görselleştirilemez5. Süper çözünürlüklü görüntülemedeki son gelişmelere rağmen, bu temel sınırlama herhangi bir optik etiketsiz görüntülemede devam eder. Mevcut tüm ticari süper çözünürlük teknikleri bir tür floresan molekül gerektirir6, uygulamalarını sınırlar. Belirli floresan etiketli moleküllere duyulan ihtiyaç nedeniyle sınırlamalara ek olarak, yoğun ışık ışınlanmasına maruz kalmanın hücresel hasara neden olduğu ve hücresel süreçleri etkileyebileceği gösterilmiştir, bu da canlı hücreleri incelerken büyük bir dezavantajdır7.
Saç hücresi stereosilia demetlerinin ultrayapısal detayları hakkındaki güncel bilgimiz çoğunlukla çeşitli elektron mikroskopisi (EM) teknikleri ile elde edilmiştir, taramalı elektron mikroskopisi (SEM), iletim elektron mikroskopisi (TEM), donma-kırılma EM ve son zamanlarda odaklanmış iyon ışını veya kriyo-EM tomografisi ile seri kesitleme gibi 3D tekniklerle 8,9,10,11,12,13, 14,15,16. Ne yazık ki, tüm bu EM teknikleri numunenin kimyasal veya kriyofixasyonunu gerektirir. Fenomenin zaman ölçeğine bağlı olarak, bu gereksinim stereosilianın uçlarındaki dinamik süreçlerin incelenmesini imkansız veya çok emek yoğun hale getirir.
Atomik kuvvet mikroskopisi (AFM)17,18ile canlı saç hücrelerinin saç demetlerini görüntüleyemek için sınırlı çaba sarf edilmiştir. AFM fizyolojik çözümlerle çalıştığından, teoride, zaman içinde canlı saç hücrelerinin stereosilia demetlerindeki dinamik değişiklikleri görselleştirebilir. Sorun, AFM probu ile numune arasında belirli fiziksel teması ima eden yüksek çözünürlüklü AFM ilkelerinde yatmaktadır, hatta en az zarar veren "dokunma" modunda19. AFM probu bir stereosiyumla karşılaştığında, genellikle ona çarpar ve saç demetinin yapısına zarar verir. Sonuç olarak, bu teknik canlı, hatta sabit saç hücreleri demetlerini görselleştirmek için uygun değildir17,18. Numunenin yüzeyine sadece hidrodinamik kuvvetler uygulayan büyük bir top şeklindeki AFM probu kullanılarak sorun kısmen hafifletilebilir20. Bununla birlikte, böyle bir prob numune21'inmekanik özelliklerini test etmek için ideal olsa da, Corti22'nin organını görüntülerken sadece bir mikrometre altı çözünürlük sağlar ve yine de numune için son derece hassas stereosilia demetleri için önemli olabilecek bir kuvvet uygular.
Taramalı iyon iletim mikroskopisi (SICM), iletken bir çözelti23ile doldurulmuş bir cam pipet probu kullanan tarama probu mikroskopisinin bir sürümüdür. SICM, pipet hücreye yaklaştığında yüzeyi algılar ve pipetten geçen elektrik akımı azalır. Bu hücreye dokunmadan önce iyi gerçekleştiğinden, SICM fizyolojik çözelti24'tecanlı hücrelerin temassız görüntülenmesi için idealdir. SICM'nin en iyi çözünürlüğü, canlı bir hücrenin plazma zarında bireysel protein komplekslerinin çözülmesini sağlayan tek nanometreler sırasınagöredir 25. Bununla birlikte, diğer tarama prob tekniklerine benzer şekilde, SICM yalnızca nispeten düz yüzeyleri görüntüleyebilmektedir. Nanopipette'in her görüntüleme noktasında numuneye yaklaştığı atlamalı prob iyon iletkenlik mikroskobu (HPICM)26icat ederek bu sınırlamanın aşısını aştık (Şekil 1A). HPICM kullanarak, stereosilia demetlerini nano ölçekli çözünürlük27ile canlı işitsel saç hücrelerinde görüntüleyebildik.
Bu tekniğin bir diğer temel avantajı, HPICM'nin sadece bir görüntüleme aracı olmamasıdır. Diğer tarama prob tekniklerinin aksine, HPICM/SICM probu, elektrik kayıtları ve çeşitli uyaranların yerel teslimatı için hücre fizyolojisinde yaygın olarak kullanılan bir elektrotdur. İyon kanalı etkinliği genellikle HPICM görüntülemesini engellemez, çünkü HPICM probu aracılığıyla toplam akım, en büyük iyon kanalları25tarafından oluşturulan hücre dışı akımdan daha büyük birkaç büyüklük sırasıdır. Bununla birlikte, HPICM nanopipette'in ilgi çekici bir yapı üzerinde hassas bir şekilde konumlandırılmasına ve daha sonra bu yapıdan tek kanallı yama kelepçesi kaydına izin verir28. Dış saç hücresi stereosili29'unuçlarında tek kanallı aktivitenin ilk ön kayıtlarını bu şekilde elde ettik. Nanopipetten geçen büyük bir akımın bile, hücre dışı ortamın muazzam elektriksel şantları nedeniyle plazma zarı boyunca potansiyelde önemli değişiklikler üretemeyeceğini belirtmek gerekir. Bununla birlikte, bireysel iyon kanalları nanopipette30'dan sıvı akışı veya bir agonist31'inlokal uygulaması ile kimyasal olarak mekanik olarak aktive edilebilir.
HPICM'de görüntü, bir nanopipette bir noktada örneğe ardışık olarak yaklaştığında, geri çekildiğinde ve yaklaşımı tekrarlamak için yanal yönde hareket ettiğinde oluşturulur (Şekil 1A). Bir yama kelepçesi amplifikatörü, banyo çözeltisinde~1 nAakımı oluşturmak için pipetteki bir AgCl teline ( Şekil 1B ) sürekli voltaj uygular. Pipet hücre yüzeyinden uzaktayken bu akımın değeri referans akım olarak belirlenir (Iref, Şekil 1C). Daha sonra pipet, akım kullanıcı (setpoint) tarafından önceden tanımlanmış bir miktar azaltılana kadar örneğe yaklaşmak için Z ekseninde hareket eder, genellikle I hakeminin% 0.2-1'i (Şekil 1C, üst iz). Sistem daha sonra bu görüntüleme noktasının X ve Y koordinatlarıyla birlikte numunenin yüksekliği olarak şu anda Z değerini kaydeder. Daha sonra pipet, genellikle 700-900 nm/ms olmak üzere kullanıcı tarafından tanımlanan bir hızda yüzeyden(Şekil 1C, alt iz) geri çekilir. Geri çekildikten sonra, pipet (veya bizim durumumuzda örnek - bkz. Şekil 1B)yanal olarak bir sonraki görüntüleme noktasına taşınır, yeni bir referans akım değeri elde edilir ve pipet bir kez daha numuneye yaklaşır ve işlemi tekrarlar. Pipet X-Y hareketi, tipik olarak saç hücresi mekanotransdüksiyon akımlarının kayıtları için kullanılan dik bir mikroskop kurulumunda tercih edilir. Bu ayarda, HPICM probu saç hücresi demetlerine yukarıdan değil,32açıyla yaklaşır. Bununla birlikte, HPICM görüntülemenin en iyi çözünürlüğü, numunenin X-Y yönlerinde hareketinin nanopipette'in Z hareketinden birleştiği ve böylece potansiyel mekanik eserlerin ortadan kaldırıldığı ters bir mikroskop kurulumunda (Şekil 1A, B) elde edilir.
HPICM kullanarak, fare ve sıçan iç ve dış saç hücresi stereosilia demetlerinin topografik görüntülerini elde ettik ve hatta stereosili arasındaki yaklaşık 5 nm çapında26,27olan bağlantıları görselleştirdik. Bu teknikle saç hücresi demeti görüntülemenin başarısı çeşitli faktörlere dayanır. İlk olarak, nanopipette akımının gürültüsü (varyansı), HPICM görüntüleme için mümkün olan en düşük setpoint'e izin vermek için mümkün olduğunca küçük olmalıdır. Düşük bir setpoint, HPICM probunun stereosilia yüzeyini daha büyük bir mesafede ve prob yaklaşımına herhangi bir açıda "hissetmesini" sağlar ve şaşırtıcı bir şekilde HPICM görüntülemenin X-Y çözünürlüğünü iyileştirir (bkz. Tartışma). İkincisi, sistemdeki titreşimler ve sürüklenmeler 10 nm'nin altına düşürilmelidir, çünkü görüntüleme eserlerine doğrudan katkıda bulunurlar. Son olarak, HPICM probu ve numune aşaması, tek bir nanometre veya daha iyi bir hassasiyete sahip kalibre edilmiş geri bildirim kontrollü piezo aktüatörleri tarafından Z ve X-Y eksenlerinde hareket ettirilse de, nanopipette ucunun çapı akımın yayılmasını (algılama hacmi) ve dolayısıyla çözünürlüğü belirler (Şekil 1A). Bu nedenle, canlı saç hücrelerini görüntülemeden önce, yeterli pipetlerin çekilmesi, kalibrasyon örnekleri ile istenen çözünürlüğe ulaşılması ve kayıt sisteminde düşük gürültü elde edilmesi hayati önem taşır.
En az birkaç on yıldır, SICM tekniği ticari olarak mevcut değildir ve Imperial College'daki (İngiltere) Prof. Korchev'in önde gelen laboratuvarı ile dünyada sadece birkaç laboratuvar tarafından geliştirilmektedir. Son zamanlarda, hepsi orijinal HPICM ilkelerine dayanan çeşitli SICM sistemleri ticari olarak kullanılabilir hale geldi (bkz. Malzeme Tablosu). Bununla birlikte, saç hücrelerindeki stereosilia demetlerini görüntüleme, kapalı "kullanıma hazır" sistemlerde teknik olarak zorlayıcı (hatta imkansız) birkaç özel değişiklik gerektirir. Bu nedenle, bazı bileşen tümleştirmesi gereklidir. HPICM kurulumu, daha sıkı titreşim ve sürüklenme gereksinimlerine ve HPICM probunun ve numunenin piezo güdümlü hareketine sahip bir yama kelepçe makinesini temsil ettiği için (Şekil 1D), bu entegrasyon yama sıkıştırma konusunda yetkin olan herhangi bir araştırmacı için nispeten kolaydır. Bununla birlikte, uygun bir geçmişi olmayan bir bilim adamının kesinlikle önce elektrofizyoloji konusunda eğitime ihtiyacı olacaktır. Görüntüleme hızını artırmak gibi kalan zorluklara rağmen (bkz. Tartışma), canlı saç hücrelerindeki stereosilia demetlerini zarar vermeden nano ölçekli çözünürlükle görüntüleyebildik.
Bu makale, özel sistemimizi kullanarak genç postnatal sıçan veya fare koklear eksplantlarında canlı işitsel saç hücresi demetlerinin başarılı HPICM görüntülemesini gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunun. Entegre bileşenler Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir. Makalede ayrıca karşılaşılabilen yaygın sorunlar ve bunların nasıl giderileceği açıklanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>Analog osiloskop</td><td>B & Nanopipet</td><td>akımının ve Z ekseni yaklaşımının gerçek zamanlı izlenmesi için K</td>Precision <td>2160C</td> Analog osiloskop</tr><tr><td>AFM kalibrasyon standartları</td><td>TED PELLA, Inc</td>, <td>HS-100MG; HS-20MG</td><td>Bu 100 ve 20 nm kalibrasyon standartları, HPICM sisteminin performansını test etmek için kullanılır.</td></tr><tr><td>Tezgah üstü titreşim İzolatörü</td><td>AMETEK/TMC</td><td>Everstill K-400</td><td>Aktif titreşim izolasyonu</td></tr><tr><td>Borosilikat cam kılcal damarlar</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>1B100F-4</td><td>Nanopipetler için borosilikat cam kılcal damarlar</td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Ozmolariteyi ayarlamak için banyo çözümüne eklenecek</td></tr><tr><td>Sayısallaştırıcı</td><td>National Instruments Corporation</td><td>PCI-6221</td><td>Çok kanallı giriş/çıkış sayısallaştırıcı</td></tr><tr><td>Z hareketi için hızlı analog Oransal-İntegral-Türev (PID) kontrolü</td><td>Standford Araştırma Sistemleri</td><td>SIM900, SIM960, SIM980</td><td>Z hareketi için harici bir PID kontrol cihazına entegre edilmiş enstrümantasyon modülleri. Genellikle ticari piezo amplifikatörlerde uygulanmayan hızlı bir yanıt gerektirir.</td></tr><tr><td>Faraday kafesi</td><td>AMETEK / TMC</td><td>Tip II</td><td>Elektromanyetik girişimi korumak için gereklidir</td></tr><tr><td>Cam alt tabak</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>FD5040-100</td><td>Doku için hazne için çanak olarak kullanılır</td></tr><tr><td>Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td><td>14025092</td><td>Hücre dışı (banyo) çözeltisi</td></tr><tr><td>Enstrümantasyon amplifikatörü</td><td>Brownlee Hassas</td><td>Model 440</td><td>Enstrümantasyon amplifikatörü, gerekli ofsetleri, filtrelemeyi ve ikincil büyütme veya zayıflamayı sağlar</td></tr><tr><td>Lazer tabanlı mikropipet çektirme</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-2000/G</td><td>Nanopipetleri imal etmek için mikropipet çektirmesi. Keskin kuvars pipetler için lazer gereklidir.</td></tr><tr><td>Lebovitz'in L-15'i, fenol kırmızısı Gibco olmadan</td><td>, Thermo Fisher Scientific</td><td>21083027</td><td>Hücre dışı (banyo) çözelti</td></tr><tr><td>Mikromanipülatör</td><td>Scientifica</td><td>PatchStar</td><td>Z piezo aktüatörünün "rota" konumlandırması için kullanılır</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td>Ters optik mikroskop</td></tr><tr><td>Yama amplifikatörü</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>Axopatch 200B</td><td>Yama kelepçesi amplifikatörü, nanopipet</td></tr><tr><td>Piezo amplifikatörü (XY eksenleri)</td> <td>Physik Instrumente (PI)</td> <td>E-500.00, E-505.00, E-509 aracılığıyla akımı ölçer. </td><td>XY piezo çeviri aşaması için C2A Amplifikasyon ve PID kontrolü</td></tr><tr><td>Piezo amplifikatör (Z ekseni)</td> <td>Piezosystem jena</td><td>ENT 400 & 800</td><td>Maksimum 1.6 nA akım elde etmek için paralel olarak ENT 400 güç kaynağı ve iki ENT 800 amplifikatörden oluşan özel amplifikatör</td></tr><tr><td>Plastik Lameller</td><td>TED PELLA Inc</td><td>26028</td><td>Doku odalarının imalatında kullanılır&nbsp;</td></tr><tr><td>SICM denetleyici ve yazılım</td><td>*Ionscope, Birleşik Krallık (ionscope.com)</td><td>N/</td><td>A Innovative Integration Ltd'den SBC6711 dijital sinyal işleme kartına dayalı özel denetleyici</td></tr><tr><td>Silikon elastomer (Sylgard)</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>SYLG184</td><td>Esnek cam elyafları doku haznesine tutturmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Silikon yapıştırıcı</td><td>Dow Kimya Şirketi</td><td>734</td><td>Doku için odanın farklı kısımlarını yapıştırmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Tungsten çubuk</td><td>A-M Sistemleri</td><td>717500</td><td>Diş ipi iplerini doku haznesinde tutmak için kullanılır</td></tr><tr><td>XY piezo nano konumlandırıcı</td><td>Physik Instrumente (PI)</td> <td>P-733.2DD</td><td>Kapasitif sensörlü XY çeviri aşaması</td></tr><tr><td>Z piezo nano konumlandırıcı</td><td>Piezosystem jena</td><td>RA 12/24 SG</td><td>Gerinim ölçer sensörlü halka piezoaktüatör</td></tr><tr><td>*Ionscope artık ayrı SICM kontrolörleri satmamaktadır. Birkaç başka ticari sistem daha var:&nbsp; NX12-Bio ve NX10 SICM,&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Park Sistemleri, Kore ve ICAPPIC Limited, İngiltere'den (icappic.com) SICM modülleri. Tüm bu sistemler orijinal&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPICM ilkeleri. Bununla birlikte, saç hücrelerindeki stereocilia demetlerinin görüntülenmesi, teknik olarak birkaç özel değişiklik gerektirir&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>kapalı alanda zorlu (hatta imkansız) " Gitmeye hazır" Ionscope veya NX12-Bio/NX10 gibi sistemler. Şu anda sadece bir tane var&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>herhangi bir SICM/HPICM deneyine uyacak esnekliğe sahip ancak bazı bileşen entegrasyonu gerektiren modüler sistem (ICAPPIC);</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

canlı memeli İşitsel saç hücrelerinde nano ölçekli Çözünürlüğe sahip stereosilia bundle görüntüleme

Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells

İç kulak kılı hücreleri ses kaynaklı yer değiştirmeleri algılar ve bu uyaranları artan yükseklik sıralarına göre düzenlenmiş stereosiliden oluşan bir saç demetinde elektrik sinyallerine aktarır. Stereosilia saptırıldığında, mekanosensitive transdüksiyon kanallarına kuvvet aktaran stereosilia birbirine bağlı küçük (~5 nm çapında) hücre dışı uç bağlantılarını çekerler. Mechanotransdüksiyon on yıllardır canlı saç hücrelerinde çalışılsa da, stereosilisin uçlarındaki mekanotransdüksiyon makinelerinin işlevsel olarak önemli ultrayapısal detayları (uç bağlantı dinamikleri veya transdüksiyona bağımlı stereosilia remodeling gibi) hala sadece elektron mikroskopisi olan ölü hücrelerde çalışılabilir. Teorik olarak, atomik kuvvet mikroskopisi gibi tarama prob teknikleri stereosilia yüzeyini görselleştirmek için yeterli çözünürlüğe sahiptir. Bununla birlikte, görüntüleme modundan bağımsız olarak, atomik kuvvet mikroskopi probunun stereosilia demetiyle en ufak teması bile genellikle demete zarar verir. Burada canlı kemirgen işitsel saç hücrelerinin zıplayan prob iyon iletim mikroskopisi (HPICM) görüntülemesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu temassız tarama prob tekniği, saç hücreleri gibi karmaşık bir topografya ile canlı hücrelerin yüzeyinin tek nanometre çözünürlüğüyle ve numuneyle fiziksel temas kurmadan zaman atlamalı görüntülenmesini sağlar. HPICM, pipete yakın çevredeki hücre yüzeyini tespit etmek için cam nanopipetten geçen bir elektrik akımı kullanırken, 3D konumlandırmalı piezoelektrik sistem yüzeyi tarar ve görüntüsünü oluşturur. HPICM ile stereosilia demetlerini ve stereosiliyi canlı işitsel saç hücrelerinde birbirine bağlayan bağlantıları farkedilir bir hasar olmadan birkaç saat boyunca görüntüleyebildik. HPICM kullanımının, işlevlerinin daha iyi anlaşılması için canlı saç hücrelerinin stereosilisinde ultrayapısal değişikliklerin doğrudan araştırılmasına izin vereceğini öngörüyoruz.

Bu makalede sunulan protokol, karmaşık topografya ile canlı hücreleri görselleştirmek için kullanılabilir. Bu adımları izleyerek, rutin olarak canlı sıçan işitsel saç hücresi demetlerinin görüntülerini elde ediyoruz (Şekil 6B, D). SEM görüntülerle karşılaştırıldığında daha düşük X-Y çözünürlüğe sahip olmasına rağmen, HPICM görüntülerimiz farklı stereosiliya sıralarını, stereosilia ipuçlarının şeklini ve hatta bitişik stereosiliyi(Şekil 6F)bağlay...

Burada, canlı işitsel saç hücrelerindeki stereosilia demetlerinin nano ölçekli görüntülenmesini sağlayan temassız tarama probu tekniği olan Zıplayan Prob İyon İletkenliği Mikroskopisi (HPICM) için bir protokol sunuyoruz.

Canlı Memeli İşitsel Saç Hücrelerinde Nano ölçekli Çözünürlüğe Sahip Stereosilia Bundle Görüntüleme

Inner ear hair cells detect sound-induced displacements and transduce these stimuli into electrical signals in a hair bundle that consists of stereocilia ...

Bu pratik, saç hücresi stereosilia demetlerinin yüzeyindeki mekanik elektrik transdüksiyon makinelerinin nano yapısal bileşenlerinin dinamik değişikliklerini incelememize yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, tek nanometre çözünürlüğünde ve örneklem ile fiziksel temas kurmadan karmaşık topografya ile canlı hücrelerin yüzeyinin hızlandırılmış görüntülenmesidir. Bu teknik hemen hemen her canlı hücreye uygulanabilir.Daha önce My Image Bacteria Soon'da virüslerle, kas hücreleriyle enfekte olmuş akciğer epitel hücre çizgilerinin yüzeyini eşleştirmiştik. Nanopipettes her görüntüleme seansının başında test edin. Bir nanopipette imal ettikten sonra kabarcıkları kontrol edin, varsa kabarcıkları çıkarın ve nanopipette'i atlamalı prob iyon iletkenliği mikroskop pipet tutucusuna monte edin.Odaya dört mililitre banyo çözeltisinde ve odayı HPICM aşamasına yerleştirin. Zemin elektrodünü banyo çözeltisine tanıtın ve yama kelepçesi amplifikatöründen pipete uygulanan voltajın sıfır olduğundan emin olun. Mikro manipülatörü dikey konuma yerleştirdikten sonra, pipet akımını kontrol etmek için artı 100 milivolt eklemeden önce, pipeti sıvıya dokunana kadar Z'de hareket ettinin ve amplifikatör ofsetini sıfıra ayarlayın.AFM kalibrasyon standardını odaya bağlamak ve numuneyi dört mililitre HBSS ile örtmek için silikon yapıştırıcı kullanın. Hazneyi HPICM kurulumunun X Y aşamasına sabitlemek için çift taraflı bant kullanın ve gösterildiği gibi tutucuya yeni bir nanopipette yükleyin. Nanopipette direncini ve çapını test ettikten sonra, akımı bir nano amplifikap olarak ayarlayın.Nanopipette'i kalibrasyon standardının merkezinin yaklaşık üstüne konumlandırmak ve Z piezo aktüatörün sensöründen gelen sinyali gerçek zamanlı olarak bir osiloskop üzerinde izlerken ayarlanan noktayı artırmak için kaba bir yama kelepçe manipülatörü kullanın. Kararlı bir tekrarlanabilir Z yaklaşım döngüsü oluşturduktan sonra, ayarlanan noktayı kararsızlık noktasının hemen üzerindeki değere düşürin ve pipeti numuneye ulaşana kadar saniyede yaklaşık beş mikron hızında aşağı hareket ettirin. Gerçek zamanlı Z konumlandırma sinyalinin alt seviyesi artacak ve nanopipette'in numune yüzeyini algılaması nedeniyle geri çekildiğini gösterecektir.AFM standardına düzensiz montaj nedeniyle, ilgi alanının en yüksek noktası bilinmemeyebilir. Bu nedenle, pipet geri çekilmesinin genliğini en az 200 ila 500 nanometreye ayarlayın. Z piezo aktüatör hareketinin üst sınırını aşmamaya dikkat ederek, düşük çözünürlükte görüntülemeye başlayın.Görüntüleme alanındaki numunenin en yüksek noktası belirlendikten sonra, hop genliğini azaltın ve yeni bir X Y konumuna taşımadan önce numuneyle istenmeyen çarpışmayı önlemek için pipeti Z ekseni boyunca yaklaşık 200 mikron geri alın. İlgi alanı bulunduğunda, görüntülemeye daha yüksek çözünürlükte başlayın. İşitsel saç hücresi görüntüleme için, diş ipi veya esnek cam pipetler kullanarak corti'nin yeni izole edilmiş bir organını bir odaya sıkıca sabitleyin.Odayı X Y piezo aşamasına sıkıca sabitlemek ve gösterildiği gibi tutucuya yeni bir nanopipette yüklemek için çift taraflı bant kullanın. Nanopipette direncini kontrol ettikten sonra, Corti X bitkisinin organını ters bir mikroskopta gözlemlerken nanopiptiyi saç hücresi bölgesinin üzerine konumlandırmak için yama kelepçesi mikro manipülatörunu kullanın. Kayıt, sistemin %0,5%6 veya daha düşük bir ayar noktasıyla sabit olup olmadığını kontrol etmek ve en uygun ayar noktasını belirlemek ve numuneye gösterildiği gibi yaklaşmak için osiloskop üzerindeki gerçek zamanlı akım ve Z konumlandırma sinyali.En az altı ila sekiz mikronluk bir atlama genliği kullanarak gösterildiği gibi numunenin düşük çözünürlüklü görüntülemesini gerçekleştirin. Nanopipette'in yeni bir X Y konumuna taşınması gerekiyorsa, dokudaki herhangi bir uzun özellik ile çarpışmayı önlemek için pipeti yaklaşık 500 nanometre geri çekin ve saç hücrelerinin bulunduğu ilgi alanına kadar düşük çözünürlüklü HPICM görüntülemeyi tekrarlayın. Ardından, ilgi çekici bölgeyi 15 dakika veya daha kısa bir sürede daha yüksek bir çözünürlükte görüntüleyin.HPICM protokolü, canlı fare işitsel saç hücresi demetleri gibi karmaşık bir topografya ile canlı hücreleri görselleştirmek için kullanılabilir. Taramalı elektron mikroskopi görüntülerine kıyasla daha düşük bir X Y çözünürlüğü göstermesine rağmen, HPICM görüntüleri farklı stereosiliyal sıralarını başarıyla çözebilir. Stereosilia uçlarının şekli ve hatta bitişik stereosiliayı birbirine bağlayan küçük beş nanometre bağlantısı.HPICM görüntülemenin temassız doğası göz önüne alındığında, aynı saç hücresi demetinin sürekli zaman atlamalı görüntülemesi, demet uyumluluğuna zarar vermeden birkaç saat boyunca yapılabilir. Çok düşük bir ayar noktasıyla, sistemin akımdaki küçük dalgalanmaları hücre yüzeyiyle karşılaşmak olarak yorumlayabileceğine ve görüntüde beyaz nokta gürültüsüne yol açıp yol açıp, bu nedenle de bu dalgalanmalara yol açıp, bu dalgalanmaların hücre yüzeyinden kaynaklanabileceğini unutmayın. Benzer şekilde, büyük atlama genlikleri pipetin yanal rezonansını artırabilir ve gürültülü piksellerin üretilmesine neden olabilir.Buna karşılık, atlama genliği çok küçükse veya setpoint çok yüksekse, nanopipette örnekle çarpışarak görüntüleme yapıtları veya saç demeti hasarına neden olabilir. Bu prosedürü denerken hatırlanması gereken en önemli şey, canlı hücrelerle çalışırken saç hücresi demeti başına 15 dakikadan az zaman harcamaktır. Saç demetinin bir görüntüsünü aldıktan sonra, mekanotransdüksiyon kanalı özellikleri hakkındaki soruları yanıtlamak için stereosilia yüzeyindeki belirli konumlardan tek kanallı kayıtlar elde etmeye çalışılabilir.

stereocilia-bundle-imaging-with-nanoscale-resolution-live-mammalian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Memeli koklea iç saç hücresi şerit sinaps işitsel sinir lifi dendritler Tüm hücre yama klemp kayıtları.

Koklear İç Saç Hücreleri Ulaşın Afferent Dendritler postsinaptik Kayıtlar: Şerit Synapse Multivesicular Yayın İzleme

Electromotility, yavaş motilite ve eğilme gibi dış tüy hücresi (OHC) hareketli yanıtları, araştırmak için güvenilir bir yöntem açıklanmıştır. OHC motilite harici bir alternatif elektrik alan stimülasyonu ile ve yöntemi, yüksek hızlı görüntü kaydı, LED tabanlı aydınlatma, ve son nesil görüntü analiz yazılımı yararlanır.

Harici Alternatif Elektrik Alan Uyarılma ve Görüntü Analizi Yüksek hızlı bir kombinasyonu ile Dış Saç Hücre Motilite incelenmesi

Kaynak: Lukasz, D., et al. Larva Zebra Balıklarında Lateral Çizgi Tüy Hücrelerinin İn Vivo Kalsiyum Görüntülemesi. J. Vis. Uzm. (2018)Bu video, felçli bir transgenik zebra balığı larvasının lateral çizgi saç hücrelerindeki kalsiyum akışının konfokal mikroskop kullanılarak canlı olarak görüntülenmesini göstermektedir. Saç demetlerinin sıvı darbeleri yoluyla mekanik olarak uyarılması, floresan göstergeleri kullanılarak gerçek zamanlı olarak görselleştirilen mekanotransdüksiyon kanalları ve voltaj...

Larva Zebra Balıklarının Lateral Çizgi Tüy Hücrelerinde Kalsiyum Dinamiğinin Görüntülenmesi

Birincil kirpikler çeşitli sinyal yollarını etkiler. Memeli kokleası, düzlemsel hücre polaritesi (PCP) sinyalini incelemek için idealdir. Kirpikler disfonksiyonu koklear büyümeyi, hücresel paternlenmeyi ve saç hücresi oryantasyonunu, PCP okumalarını etkiler. Amacımız, fare kokleasında PCP sinyalizasyonunu fenotipik analiz, immünohistokimya ve taramalı elektron mikroskobu ile analiz etmektir.

Ciliopathy Fare Mutant Kohlea Planar-Hücre-Polarite fenotipleri Değerlendirilmesi

Amerikan bullfrog en (Rana catesbeiana) sakkuluslar saç hücre fizyolojisinin doğrudan muayene izin verir. İşte diseksiyon ve biyofiziksel çalışmaları için Bullfrog en sacculus hazırlanması tarif edilmektedir. Biz onun unforced bir hareket Paketin kuvvet-deplasman ilişkisi hesaplanması ve ölçümü de dahil olmak üzere, bu saç hücrelerinden temsili deneyler göstermektedir.

Amerikan Bullfrog of sacculus (Saç Hücrelerinin fizyolojik hazırlanması<em&gt; Rana catesbeiana</em&gt;)

Bu iletişim kuralı İşitsel Beyin Sapı Davranım Odyometrisi postnatal fare pups üzerinden kaydetmek için yöntemler açıklanır. Dış saç hücreleri fonksiyonel gelişimi incelemek için tüm hücreli yama kelepçe dış saç hücreleri izole kayıt deneysel işlemin adım adım açıklanmıştır.

İşitsel Beyin Sapı Davranım Odyometrisi ve dış saç hücre bütün hücreli yama kelepçe kayıt Doğum sonrası sıçanlarda

Zebra balığı optik netlik, hızlı harici diller, dahil olmak üzere birçok değerli özellikleri ve işitme ve denge için belirli önemini, dışarıdan duyu saç hücreleri bulunan bir modeli sistemidir. Bu makalede nasıl transgenik zebra balığı özetlenmektedir saç hücreli mechanosensation ve presynaptic fonksiyonu toto tahlil için kullanılabilir.

Larva zebra balığı sonradan içini kaplamak saç hücrelerinin vivo kalsiyum görüntüleme

Bu yazıda normal farelerde morfolojik özellikleri ve kurdele sinüslerinin fonksiyonel durumunu değerlendirmek için deneysel bir protokol açıklanmaktadır. Bu model aynı zamanda gürültüye bağlı ve yaşa bağlı Cochlear synaptopathy-kısıtlanmış modeller için de uygundur. Önceki fare çalışmalarından gelen göreli sonuçlar da tartışılmaktadır.

Fare koklea belirli frekans bölgelerinde şerit synapses morfolojik ve fonksiyonel değerlendirilmesi

Burada, fonksiyonel mekanotransdüksiyon kanalları ile işitsel saç hücrelerinde 3 kDa Texas Kırmızı etiketli dextran alımını görselleştirmek için bir yöntem salıyoruz. Buna ek olarak, 3-10 kDa dekstrans saç endositoz ve Corti organının destekleyici hücreleri çalışmak için kullanılabilir.

Canlı ve Fonksiyonel Murine Koklear Saç Hücrelerinde Dekstran Etiketleme ve Alımı

Civciv, çeşitli çalışmalar için uygun maliyetli, erişilebilir ve yaygın olarak bulunan bir model organizmadır. Burada, kuş iç kulağı gelişimi ve yenilenmesinin altında yatan moleküler mekanizmaları anlamak için bir dizi protokol detaylandırılmıştır.

Ovo ve Ex Ovo'da Kuş İç Kulak Gelişimini İnceleme Yöntemleri

Burada, farelerden birincil koklear saç hücrelerinin izole edilmesi ve kültürlenmesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Başlangıçta, Corti'nin organı yenidoğan (3-5 günlük) murin koklealarından mikroskop altında diseke edildi. Daha sonra, hücreler enzimatik olarak tek hücreli bir süspansiyona sindirildi ve kültürde birkaç gün sonra immünofloresan kullanılarak tanımlandı.

Yenidoğan Farelerden Primer Koklear Saç Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

Keşfedin, HPICM ile canlı kemirgen işitsel saç hücrelerinin stereosilia demetlerini nanometre çözünürlüğünde ve temassız olarak görüntüleme yöntemini. Bu teknik, canlı hücrelerin dinamik ultrastructural değişikliklerini saatler boyunca zarar vermeden incelemeyi mümkün kılar.

Canlı Memeli İşitsel Saç Hücrelerinde Nano ölçekli Çözünürlüğe Sahip Stereosilia Bundle Görüntüleme

Daha fazla video keşfet