Name: Click Kimya Kullanarak Yağ Asillenmiş Proteinlerin Tespiti için Alkinil Yağ Asidi Analoglarının Optimize Edilmiş Birleştirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Keşfedin, yağ asillenmiş proteinlerin tespiti için click kimya kullanarak alkinil yağ asidi analoglarının optimize edilmiş birleştirilmesini. Bu yöntem, HEK-293T hücrelerinde uzun zincirli yağ asitleri için etiketleme verimliliğini artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Bilim ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC; RGPIN-2019-04617). Lucia Liao, Waterloo Üniversitesi Biyoloji Bölümü aracılığıyla Ram ve Lekha Tumkur Memorial Bursu ve IODE Ontario aracılığıyla Lucy Morrison Memorial Bursu'nun yanı sıra, Waterloo Üniversitesi'nden Lisansüstü Araştırma Öğrenciliği (50503-11072), Fen Bilimleri Yüksek Lisans Ödülü ve Lisansüstü Öğretim Asistanlığı'nı içeren lisansüstü araştırma fonuna ek olarak finanse edildi. Yazarlar, Martin laboratuvarının tüm üyelerine, bu makalenin hazırlanmasındaki destekleri için, özellikle de bu çalışmalara hazırlık için Martin Laboratuvarı'nın kurulmasına yardımcı olan Stephanie Ryall, Harleen Gill ve Sadia Khan'a teşekkür etmek istiyor. Yazarlar ayrıca ctHTT-GFP yapılarının nazik hediyesi için Dr. Luc Berthiaume'ye ve el yazmasının hazırlanmasında kritik katkılar için Dr. Shaun Sanders'a teşekkür eder. Şekil 3, BioRender.com ile oluşturulmuştur.

1. Hücre kültürü
<ol><li>Hücre kültürü için DMEM'i (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı) desteklemek için,% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS), 1x Penisilin-Streptomisin, 2 mM L-glutamin ve 100 mM sodyum piruvat (% 1 hacim / hacim) ekleyin.</li>
	<li>6 kuyucuklu bir doku kültürü kabının yaklaşık 5 x 105 HEK293T hücresini/kuyusunu tabak edin ve %75 -%80 akıcılığa ulaşmak için %5 CO2 ile 37 °C nemlendirilmiş inkübatörde 18 saat boyunca büyür.</li>
	<li>Yağ asidi serum yoksunluğu<ol>
<li>Etiketleme ortamını hazırlamak için, DMEM'i %10 FBS olmadan yukarıdaki gibi hazırlayın (adım 1.1). FBS'yi %5 dekstran-kömür kaplı FBS (DCC-FBS) ile değiştirin. Kullanmadan önce 37 °C'ye kadar ısıtın.</li>
		<li>Hücreleri oda sıcaklığında 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile nazikçe yıkayın ve etiketleme ortamıyla değiştirin. NOT: HEK293T hücreleri doku kültürü plakalarından kolayca ayrılır. Hücreleri yıkarken ve ortamları değiştirirken dikkatli olun. İnkübatöre ve inkübatörden transfer sırasında ajitasyonu mümkün olduğunca en aza indirin.</li>
		<li>Hücreleri% 5 CO2 ile 37 ° C inkübatöre geri döndürün ve yağ asitleri ile metabolik etiketlemeye devam etmeden önce yaklaşık 45 dakika (minimum 15 dakika etkilidir), 60 dakikaya kadar inkübe edin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Yağ asidi analoglarının hazırlanması ve sabunlaştırılması
<ol><li>Aşağıdaki konsantrasyonları elde etmek ve -20 ° C'de saklamak için DMSO'da çözündürerek alkinil yağ asitlerinin stok çözeltilerini önceden hazırlayın. Gerektiğinde oda sıcaklığında çözün. En iyi performansları için hazırlıkları N2 veya Ar altında saklayın. Alkinil-miristat (13-tetradesinoik asit, 13-TDYA): 25 mM Alkinil-palmitat (15-hekzadesinoik asit; 15-HDYA): 100 mM Alkinil-stearat (17-oktadesinoik asit; 17-ODYA): 100 mM
</li>
	<li>% 20 yağ asidi içermeyen BSA (FAFBSA) hazırlamak için, 50 mL'lik tek kullanımlık bir tüpte 2 g FAFBSA tartın.<ol>
<li>Önceden ısıtılmış (37 ° C) DMEM ile 10 mL'ye kadar getirin.</li>
		<li>Uçtan uca rotasyonla veya girdapla karıştırın ve FAFBSA'yı tamamen çözmek için 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin.</li>
		<li>Ortamı sterilize etmek için 0,2 μm filtre kullanın.</li>
		<li>Aliquot yaklaşık 1 mL hacimlerde ve -20 ° C'de saklayın. Gerektiğinde çözün ve kullanmadan önce bir su banyosunda 37 ° C'ye kadar ısıtın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yağ asidi ve yağ asidi analoglarının çözünürlüğünü arttırmak için, 3 mL cam konik reaksiyon şişelerinde% 20 molar fazla potasyum hidroksit (KOH) ile inkübe ederek sabunlaştırın. NOT: Bu şişeler, FAFBSA'nın yüksek ısıdan dolayı birleşmemesini sağlarken tuzun çözünür kalmasını sağlar. Cam kullanımı ayrıca yağ asitlerinin plastiğe yapışmasını da önler.<ol>
<li>Pipet, en az 2 μL alkinil yağ asidi analogunu doğrudan 3 mL'lik bir konik reaksiyon şişesinin dibine boşaltın. Kullanılan 6 delikli bir plakanın kuyucuğu başına 2 μL lipit hazırlayın (bkz. Tablo 1). NOT: Yağ asitlerinin hidrofobikliği nedeniyle, pipetin ucunu, reaksiyon şişesine dağıtmadan önce istenen hacmi birkaç kez çekerek kaplamak en iyisidir.</li>
		<li>1 M KOH'u, alkinil yağ asidi etiketinin% 20 molar fazlalığına eşit konsantrasyonlara seyreltin (13-TDYA için 30 mM ve 15-HDYA ve 17-ODYA için 120 mM).</li>
		<li>Pipet, camın kenarındaki reaksiyon şişesinin dibine yakın eşit miktarda seyreltilmiş KOH (1 μL: 1 μL yağ asidi : KOH), böylece KOH'un dağıtılan hacmi yağ asidi ile karışır.</li>
		<li>Şişenin kapağını kapatın ve çözeltileri karıştırmak için hafifçe dokunun. NOT: Karışım, özellikle yağ asidinin hidrokarbon zincirinin artan uzunlukları ile hızlı bir şekilde katılaşabilir. Katıyı pipetlememeye dikkat edin (yani, pipetleme ile karıştırmayın).</li>
		<li>Reaksiyon şişesini yaklaşık 5 dakika boyunca 65 ° C'de veya yağ asidi dahil edilir edilmez ısıtın (çözelti netleşir). NOT: Stearat (17-ODYA) gibi daha fazla sayıda karbon ve düşük çözünürlüğe sahip yağ asitleri, 65 ° C'de KOH'ye tam olarak dahil edilmek için daha uzun inkübasyon süreleri gerektirebilir. Gerekirse sıcaklığı 70 ° C'ye yükseltin. Bir su banyosu en iyisidir. Sıvının çok fazla buharlaşmamasına dikkat edin.</li>
		<li>Yağ asitleri çözeltiye girdikten ve görünür katı madde kalmadıktan sonra, pipet% 20 FAFBSA'yı önceden ısıttı, böylece yağ asitlerinin hacim oranı: KOH: FAFBSA, 20x BSA'ya bağlı alkinil yağ asitlerinin nihai konsantrasyonunu elde etmek için 1: 1: 50'dir.</li>
		<li>Yukarı ve aşağı pipetle indirerek karıştırın. Çözelti tipik olarak görünür katı madde olmadan net görünür. NOT: Tipik olarak, küçük katı maddeler 37 °C'de inkübasyondan sonra çözeltiye girer.</li>
		<li>Yağ asidini ve FAFBSA'yı 37 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin. NOT: Bu noktada sabunlaştırılmış etiket 15 dakikadan fazla sabittir. 
		 </li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Toplam ortam hacmi (mL)</td>
			<td>Hacim yağ asidi veya yağ asidi analoğu (μL)</td>
			<td>Cilt KOH (μL)</td>
			<td>Cilt %20 FAFBSA (μL)</td>
			<td>BSA konjuge sabunlaştırılmış etiketin toplam hacmi (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>200</td>
			<td>208</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>100</td>
			<td>104</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: Saponifiye yağ asidi etiketleme oranları. Kullanılan ortamın hacmine göre yağ asidi etiketinin sabunlaştırılması için yağ asidi, KOH ve FAFBSA'nın deneysel hacimleri.
<ol start="4"><li>Denetim olarak, adım 2.3'ü yineleyin. alkin etiketi olmayan yağ asitleri ile.</li>
	<li>Alkinil-miristat için% 1 BSA ve 25 μM veya alkinil-palmitat ve alkinil-stearat için 100 μM nihai konsantrasyonu elde etmek için hücreleri doğrudan açlık ortamına (tipik olarak, 2 mL ortam / hücrelerde 100 μL) konjugat 1/20 hacimli 20x yağ asidi-BSA ile etiketleyin. NOT: Bağlı hücrelerdeki fiziksel rahatsızlık miktarını en aza indirmek için, doğrudan ortama pipet yapmak yerine, pipetin ucunda ortamın yüzeyine yakın bir yerde bir damlacık oluşturun. Asilasyon inhibitörleri kullanıyorsanız, etiketli yağ asitlerinden en az 15 dakika önce ekleyin. Süreler, kullanılan hücrelere veya inhibitöre bağlı olarak değişebilir. Bu adım için de sabunlaştırmanın kullanılması önerilmiştir28.<ol>
<li>Karşılaştırma için, etiketsiz yağ asidinin 2 μL'sini (veya sabunlaştırılmış hacme eşdeğer) pipetleyerek, sabunlaşmamış lipitleri doğrudan açlık ortamına ekleyin.</li>
		<li>Hücreleri tekrar inkübatöre yerleştirin ve 3-6 saat boyunca inkübe edin. NOT: Her hücre tipi veya deneysel durum için optimum etiketleme zamanlamasının belirlenmesi gerekebilir. Daha uzun inkübasyon süreleri, yağ asitlerinin β-oksidasyon ve / veya fosfolipitler gibi diğer lipit gruplarına dahil edilmesiyle potansiyel olarak parçalanmasına neden olabilir28.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücreleri oda sıcaklığında 1x PBS ile nazikçe yıkayın.</li>
	<li>500 μL etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içermeyen modifiye radyoimmünopresipitasyon testi (RIPA) tamponu (% 0.1 SDS, 50 mM N-2-hidroksietipiperazin-N-etansülfonik asit (HEPES) pH 7.4, 150 mM NaCl,% 1 denatüre olmayan deterjan,% 0.5 sodyum deoksikolat, taze eklenmiş 1 mM fenilmetilsülfonil florür (PMSF) ile 2 mM MgCl2 ve 10 μg / μL Pepstatin A (veya EDTA içermeyen tam proteaz inhibitörü kokteyli)) ile lizatları 4 ° C'de 15 dakika sallayarak hücreleri toplayın ve lize edin.<ol>
<li>Lisatları 4 ° C'de 10 dakika boyunca 16.000 x g'de santrifüj yapın.</li>
		<li>Süpernatantı 1.7 mL mikrosantrifüj tüplerinde toplayın ve tıklama reaksiyonuna devam etmeye hazır olana kadar -20 ° C'de saklayın. NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Lisatlar -20 ° C'de 1 aya kadar stabildir. Bununla birlikte, tıklama reaksiyonuna zamanında devam etmeniz önerilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deterjan uyumlu (DC) bir test gibi üreticinin protokolüne göre uygun bir tahlil kullanarak protein konsantrasyonlarını ölçün.</li>
</ol>3. Hücre lizatlarına tıklama reaksiyonu
<ol><li>Reaktifleri tıklama kimyası için hazırlayın.<ol>
<li>Tris-(benziltriazolilmetil) amini (TBTA) DMSO'da 2 mM'ye kadar çözün. 2-3 aya kadar -20 ° C'de kurutucu küçük alikotlarda saklayın. En iyi N2 veya Ar altında saklanır.</li>
		<li>50 mM'ye ulaşmak için CuSO4'ü ddH2O suda çözün. Oda sıcaklığında 2 aya kadar saklayın.</li>
		<li>Tris-karboksiyetilfosfin (TCEP) ddH2O suyunda 250 mM'ye kadar çözün. 4 °C'de karanlıkta saklayın ve tıklama reaksiyonundan hemen önce taze 50 mM seyreltmeler yapın.</li>
		<li>DMSO'da 2 mM azid hazırlayın. 6 aya kadar -20 ° C'de kurutucu küçük alikotlarda saklayın. En iyi N2 veya Ar altında saklanır. NOT: Üç veya daha fazla polietilen glikol grubuna sahip ürünlerin biyotin ile en iyi şekilde çalıştığı gözlenmiştir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1.7 mL mikrosantrifüj tüplerinde 50-100 μg protein lizatlarını yukarıdaki gibi aynı lizis tamponunu kullanarak aynı hacme getirin. NOT: Reaksiyon hacmini mümkün olduğunca küçük tutun (20-100 μL).<ol>
<li>Son %1'lik konsantrasyona ulaşmak için her numuneye sodyum dodesil sülfat (SDS) ekleyin.</li>
		<li>Lizatlara eklendikten sonraki son konsantrasyonların şunlar olması için bir ana tıklama reaktifleri karışımı hazırlayın: 100 μM TBTA (2 mM stok), 1 mM CuSO4, (50 mM stok) 1 mM TCEP (50 mM stok) ve 100 μM azid probu (2 mM stok). Stok çözümlerini buna göre birleştirin (bkz. Tablo 2). NOT: Sipariş önemlidir. Her bileşenin eklenmesinden sonra tamamen karıştırın.</li>
		<li>Ana karışımın uygun hacimlerini lizatlara ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetle indirerek karıştırın.</li>
		<li>37 °C su banyosunda karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe edin. Ara sıra ajitasyon yapın/karıştırın.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Toplam reaksiyon hacmi (μL)</td>
			<td>Hacim proteini (μL)</td>
			<td>Cilt TBTA (2 mM) (μL)</td>
			<td>Cilt CuSO4 (50 mM) (μL)</td>
			<td>Cilt TCEP (50 mM) (μL)</td>
			<td>Hacim azido probu (2 mM) (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>50</td>
			<td>43</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>2.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>100</td>
			<td>86</td>
			<td>5</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>5</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: Reaktif ve protein hacim oranlarına tıklayın. Protein numunelerinin hacimlerine ek olarak, tıklama kimyası reaktiflerinin deneysel hacimleri ve karşılık gelen stok konsantrasyonları.
4. İmmünsüpresitlenmiş proteinler üzerindeki reaksiyona tıklayın
<ol><li>Alternatif olarak, tıklama reaksiyonunu immünoçökeltilmiş (IP) proteinler üzerinde boncukların üzerinde veya dışında gerçekleştirmek mümkündür. NOT: Tipik olarak, boncukları tıklatmak en az arka plana yol açar ve ilgilenilen yeni proteinleri test ederken en iyisidir.<ol>
<li>İlgilenilen protein için transfekt hücreleri, bu durumda, wildtype myristoylated C-terminal huntingtin (HTT), daha önce tarif edildiği gibi, kalsiyum fosfat DNA birlikte çökeltme kullanarak, bir G2A ikamesi ile GFP (myr-ctHTT-GFP) ve ctHTT-GFP ile kaynaştırılmıştır41.<ol>
<li>6 kuyucuklu doku kültürü plakalarında 2.5 x 105 hücreli / kuyucuklu plaka ve gece boyunca ~% 70-80 akıcılığa kadar büyür.</li>
			<li>DNA karışımını, 1.7 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne 99.75 μL moleküler sınıf H2O ile 10 μL'ye 2.5 μg DNA ekleyerek hazırlayın. Ardından, DNA karışımına damla damla 15.25 μL CaCl2 ekleyin.</li>
			<li>DNA/CaCl2 karışımını 125 μL 2x HEPES tamponlu salin (HBS, pH 7.0) içeren ayrı bir tüpe damla damla karıştırma ile ekleyin.</li>
			<li>DNA / CaCl2 / HBS karışımını yavaşça hücrelere ekleyin. 2-4 saat sonra, medyayı değiştirin ve gece boyunca inkübe edin. 1.3-2.8 arasındaki adımlardan etiketlemeye devam edin.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Lizis tamponunda eşit miktarda 500 μg protein hazırlayın.</li>
		<li>4 ° C'de gece boyunca dönen ctHTT-GFP için tavşan anti-GFP ile inkübe ederek IP gerçekleştirin.</li>
		<li>Her tüpe lizis tamponu ile önceden dengelenmiş 15-20 μL protein G boncukları ekleyin ve 3 saat boyunca 4 ° C'de uçtan uca reaksiyona girmesine izin verin.</li>
		<li>Boncukları lizis tamponu ile yıkayın ve 45 μL %1 SDS 50 mM HEPES tamponunda tekrar askıya alın.</li>
		<li>Boncukları 80 ° C'de 15 dakika ısıtın ve tüpleri ters çevirin veya yaklaşık her 5 dakikada bir çalkalayın. Tüpleri kısaca döndürün ve 80 ° C'ye geri dönün.</li>
		<li>Numuneler hala sıcakken proteinleri içeren süpernatantı toplayın. NOT: Protokol burada duraklatılabilir ve immünoçökeltilmiş numuneler, tıklama kimyası için hemen kullanılmazsa, -20 ° C veya -80 ° C'de saklanabilir.</li>
		<li>43 μL süpernatantın 7 μL ana tıklama reaktifi karışımı ile reaksiyona girmesine izin verin.</li>
		<li>Adım 3.2.3'te belirtildiği gibi reaksiyona devam edin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. SDS-PAGE ve batı lekeleme
<ol><li>25 mM ditiyotreitol (DTT) içeren 1x numune yükleme tamponu ekleyerek reaksiyonu durdurun ve denatüre edin ve 5 dakika boyunca 95 °C'de ısıtın. NOT: 100 mM'ye kadar DTT kullanılabilir28. β-asillenmiş proteinlerle birlikte kullanmayın, çünkü tiyoester bağlarını hidrolize edebilir ve tıklanmış yağ asidi analogunu çıkarabilir.</li>
	<li>Örnekleri kısaca aşağı doğru döndürün.</li>
	<li>Proteinleri SDS-PAGE ile bir poliakrilamid jel üzerinde, kopyalar halinde ayırın. NOT: Tiyoester bağlarının varlığını doğrulamak için KOH ile alkali muamele için iki jel gereklidir. Bir floresan azid probu kullanılıyorsa, asilasyon jel içinde veya belirtilen uyarma kanalı kullanılarak transferden sonra tespit edilebilir.</li>
	<li>Poliviniliden florür (PVDF) membranlarına (metanol içinde aktive edilir ve ddH2O'da durulanır - her biri 5 dakika) 25 V, 1.0 A'da (sabit) yarı kuru transfer aparatı ile 30 dakika boyunca aktarın.</li>
	<li>Membranları ddH2O ile kısa bir süre duruladıktan sonra, bir replika membranı metanol / su içinde 0,1 M KOH'da (9: 1 v / v) ve diğeri metanol / suda (9: 1 v / v) 0.1 M Tris-HCl pH 7.0'da alkali olmayan bir kontrol olarak oda sıcaklığında 60 dakika boyunca yumuşak sallanma ile ıslatın.</li>
	<li>Membranları ddH2O suyunda kısa bir süre durulayın, ardından PBS-T'de 6 kez 5 dakikalık yıkama (1x PBS, %0,1 Ara 20). NOT: İyice yıkayın.</li>
	<li>Membranları gece boyunca %5 yağsız süt bloke edici tamponda (1x PBS, %0,1 Tween20) bloke edin.</li>
</ol>6. Batı lekesi yapın
<ol><li>Belirtildiği yerlerde, floresan etiketli Streptavidin (1:5000) ve yükleme kontrollü prob, anti-GAPDH rodamin (1:5000) %5 BSA bloke edici tamponda (%0,01 SDS, 1x PBS, %0,1 Tween20) oda sıcaklığında 45-60 dakika boyunca karanlıkta hafifçe sallanır.<ol>
<li>İmmün çökeltilmiş protein lekesini önce %5 yağsız süt bloke edici tamponda primer anti-GFP antikoru ile, daha sonra adım 6.1'de olduğu gibi %5 BSA'da uygun sekonder antikorlarla araştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Membranları PBS-T'de (1x PBS, %0,1 Tween20) toplam dört kez 5 dakika boyunca yıkayın ve görüntülemeden önce ddH2O su ile durulayın.</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Yağ asitlerinin kültürdeki hücrelere doğrudan eklenmesi, çözünmezliğe, lipitlerin çökelmesine ve lipotoksisiteye neden olabilir40. Sonuç olarak, yağ asitlerinin doğrudan hücrelere eklenmesi, sadece zayıf hücresel alıma ve yağ asidi etiketinin düşük mevcudiyetine neden olmakla kalmaz, aynı zamanda aşağı akış analizi için canlı hücre sayısının azalmasına ve hedef dışı yolların aktivasyonuna neden olabilir. Bununla birlikte, tıklama kimyası tespiti için birçok metabolik etiketleme protokolü, yağ asitlerinin doğrudan eklenmesini ve bugüne kadar tıklama kimyası tespitini kullanan çok sayıda palmitoyl-proteom çalışmasını içerir, nadiren yağ asitleri etiketlerini sabunlaştırır veya BSA8,36 ile inkübe eder. Yağ asillenmiş proteinlerin tıklama kimyası tespitinin etkinliği ve duyarlılığının, yağ asidi analoglarının yeterli hücresel alımına bağlı olduğu gerçeğini göz önünde bulundurmak önemlidir. Bu nedenle, birçok S-asillenmiş proteinin, özellikle daha uzun zincirli yağ asidi 17-ODYA kullanıldığında, yağ asidi etiketlerinin hücrelere zayıf bir şekilde dahil edilmesinden kaynaklanan düşük mevcudiyeti nedeniyle proteomik çalışmalarda tespitten kaçmış olabileceğini tahmin etmek mantıklıdır. 17-ODYA veya alkinil-stearat, ticari mevcudiyeti ve erken kullanımı nedeniyle çeşitli çalışmalar için yaygın olarak kullanılan etiket olmuştur8,36. Bununla birlikte, bu protokolün sonuçları, 17-ODYA'nın sabunlaştırılmasının, palmitat veya miristat gibi daha kısa zincirli yağ asitlerine kıyasla, S-asillenmiş proteinlerin tespitinde en büyük artışa neden olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, bu deneylerin sabunlaştırılmış etiketlerle tekrarlanması, daha önce göz ardı edilmiş olabilecek ek S-asilasyon substratları verebilir. Ayrıca, çoğu palmitoil asiltransferaz, S-asilasyon için palmitatı tercih ederken, bazılarının stearat gibi diğer yağ asitleri uzunlukları için tercihleri vardır15,38,44. Ek olarak, bazı proteinler ve hatta proteinler içindeki belirli bölgeler, bir yağ asidini diğerine tercih eder15,45. Bu nedenle, 17-ODYA kullanan çalışmalar, palmitat değil, stearat ile S-asillenmiş proteinlere karşı bir önyargıya sahip olabilirken, aynı zamanda daha düşük tespit nedeniyle bu proteinleri yeterince temsil etmeyebilir.
Klik kimyası için geliştirilmiş metabolik etiketleme verimliliği, lipitlerin sabunlaştırılmasına ve FAFBSA adımlarıyla inkübasyona ve ayrıca delipide edilmiş FBS'ye dayanır. Tüm yağ asitleri, FAFBS ile inkübasyona devam etmeden önce görünür katı madde kalmadan, KOH'da tamamen sabunlaştırılmalıdır. Bu zor bir adım olabilir ve zamanlama çok önemlidir. Sabunlaşmış yağ asitleri 65 ° C'de çözeltiye girdikten sonra, daha fazla ısıtma DMSO'nun yağ asitlerinden buharlaşmasına neden olacağından hemen ılık BSA ekleyin. Ek olarak, sabunlaşmış etiket, soğumaya başlar başlamaz yeniden katılaşmaya başlayacaktır. Bu nedenle, FAFBSA ılık olmalı ve tuz çözünür hale geldikten sonra hızla eklenmelidir. Cam reaksiyon şişeleri ve şekilleri bu adım için önemlidir. Sabunlaşmış lipitin çözünür kalacak kadar sıcak olmasını, FAFBSA'nın ise birleşmemesini sağlayacak kadar soğuk olmasını sağlarlar. Bu adımda, etiketleme için homojen bir çözelti sağlamak amacıyla pipetleme yoluyla yeterli karıştırma da önemlidir.
Klik kimyası için reaktiflerin, tipik olarak kurutucularla veya -20 ° C ila -80 ° C'de N2 veya Ar gazı altında uygun şekilde depolanması gerekir. Asilasyon sinyali eksikliği veya zayıf sinyal, kararsız reaktiflerden, özellikle eski TBTA ve azid stok çözeltilerinden kaynaklanabilir. Ayrıca, mümkün olduğunca ışıktan korunması gereken floresan azid stok çözeltilerine dikkat edilmelidir. Ek olarak, lipit yoksunluğu yöntemi ve etiketleme süresi gibi değişkenlerin, kullanılan hücrenin tipine bağlı olarak en uygun koşulları belirlemek için test edilmesi gerekebilir. Örneğin, nöronal hücrelerin daha uzun etiketleme sürelerine ihtiyacı olabilir, çünkü ortam değişiklikleri ve lipit yoksunluğu zordur (yayınlanmamıştır).
Bu protokolün yararı, daha uzun zincirli yağ asitleri için kullanıldığında en dramatik olanıdır. Daha kısa zincirler için, sinyal yoğunluğundaki artış daha az dramatik hale gelir, ancak yine de hücreler için koruyucu olması muhtemeldir. Önerilen modifikasyonlar genel olarak protein asilasyon tespitini iyileştirecek olsa da, tıklama kimyası hala stabil olarak değil, dinamik olarak S-asillenmiş proteinlerin1 tespiti ile sınırlı olan lipit merkezli bir yöntem1 olarak kabul edilir. Göz önünde bulundurulması gereken diğer sınırlamalar arasında, etiketlemeyi teşvik etmek için yağ asidi yoksunluğunun gerekliliği ve S-asilasyonun asil-biyotin değişimi (ABE) tespiti ile karşılaştırıldığında nispeten sınırlı uyumlu hücre tipleri aralığı bulunmaktadır16. Bu sınırlamalara rağmen, tıklama kimyası tespiti çoğu açil değişim tahlilinden daha hızlıdır ve açil değişim testleri için gerekli tekrarlanan protein çökeltme adımlarını tolere etmeyen proteinlerin tespiti için daha uygundur. Ek olarak, bu yaklaşım darbe kovalama analizi38 gibi diğer tıklama tahlilleri kullanılarak eşzamanlı etiketleme ile birleştirilebilir.
Tıklama kimyası için metabolik etiketleme için bu modifikasyonun kullanılması, tıklama kimyası ile birlikte kullanılan çeşitli proteomik tekniklerle, özellikle S-asillenmiş asillenmiş proteinlerin genel tespitini arttırmıştır. Gösterildiği gibi, florojenik tespit biyotine alternatif olarak kullanılabilir (Şekil 1)28. Bu özellikle yararlıdır, çünkü hücre lizatlarında endojen floresan proteinleri yoktur. Ek olarak, yalnızca tıklama kimyasından sonra aktive olan floroforlar kullanılabilir46. Tıklama kimyası etiketlemesi için sabunlaştırılmış ve FAFBSA'ya bağlı yağ asidi, hücrede bulunan etiket miktarındaki genel bir artış nedeniyle ve yağ asitlerinin doğrudan ortama eklenmesinin toksik etkilerini sınırlayarak ilgilenilen proteinleri tespit etmede zorluklara yardımcı olabilir. Ayrıca, düşük bolluk proteinlerinin tespitini artırmak için kütle spektrometrisi27 ile birlikte kullanılabilir, özellikle de en bol proteinlerin tespitini destekleyen mevcut veriye bağımlı edinimin aksine, düşük bolluk proteinlerine duyarlılığı artırmak için gereksiz ölçümleri önleyen makine öğrenme algoritmaları kullanılarak yapılan son gelişmelerle birlikte ele alındığında47 . Ek olarak, tıklama kimyası, dinamik protein S-asilasyonu hakkında ölçülebilir veriler üretmek için hücre kültüründeki amino asitlerle (SILAC) kararlı izotop etiketleme ve nabız kovalama yöntemleri ile birleştirilebilir27. Son olarak, Hannoush grubu, palmitoylatlanmış proteinlerin hücre altı dağılımına tek hücreli görselleştirme ve incelemelere izin vermek için tıklama kimyasını yakınlık ligasyon testi (PLA) ile birleştirmiştir43,48.

Yağ asilasyonu, yağ asitlerinin proteinlere kovalent ilavesini içerir ve protein-membran etkileşimlerini teşvik etmedeki önemi ile iyi bilinir, ancak aynı zamanda protein-protein etkileşimlerini, konformasyonel değişiklikleri teşvik ettiği ve enzimlerin katalitik bölgelerini düzenlediği gösterilmiştir1,2,3,4,5,6,7 . Yağ asilasyonu, palmitoilasyondaki bozulmaların belgelendiği enfeksiyon, kanser, inflamasyon ve nörodejenerasyon dahil olmak üzere sayısız hastalıkta potansiyel bir ilaç hedefi olarak ortaya çıkmıştır8,9,10,11,12,13. Bu, öncelikle, S-asillenmiş protein hedeflerinin büyük ölçekli tanımlanmasını sağlayan yeni kimyasal tespit yöntemlerinin geliştirilmesiyle teşvik edilmiştir.
Yağ asilasyonu, doymuş ve doymamış yağ asitlerinin kovalent ilavesini içeren çeşitli modifikasyonları içerebilir, ancak tipik olarak N-miristoilasyon ve S-asilasyonunu ifade eder. N-miristoilasyon, miristik asidin N-terminal glisinlere ya yeni ortaya çıkan polipeptitler üzerinde birlikte translasyonel olarak ya da proteolitik bölünmeyi takiben yeni maruz kalan N-terminal glisinler üzerinde post-translasyonel olarak eklenmesini ifade eder2,14. N-miristoilasyon, geri dönüşümsüz bir amid bağı yoluyla gerçekleşir. Öte yandan, S-asilasyon tipik olarak uzun zincirli yağ asitlerinin bir tiyoester bağı yoluyla sistein kalıntılarına geri dönüşümlü olarak eklenmesini ifade eder. Bu modifikasyonun en yaygın şekli palmitatın dahil edilmesini içerir ve bu nedenle genellikle S-palmitoylation veya sadece palmitoylation olarak adlandırılır11,15. Birçok yönden, S-palmitoilasyon fosforilasyona benzer. Dinamiktir, enzimatik olarak düzenlenir ve oldukça izlenebilir olduğu kanıtlanmıştır.
Son on yıla kadar, yağ asilasyonunun incelenmesi, radyoaktif olarak etiketlenmiş yağ asitleri gerektiren sınırlı tespit yöntemleri tarafından engellendi. Bunun maliyet, güvenlik sorunları ve çok uzun algılama süreleri gibi çeşitli dezavantajları vardı. Tipik olarak, S-asilasyonun tespiti için tritiye veya iyotlu palmitat kullanılmıştır16. Tritiated palmitate, otoradyografi filmi ile haftalar ila aylar sürebilen uzun tespit süreleri gerektiriyordu. [125I] iyot-yağ asidi analogları tespit sürelerini kısaltırken, çok daha yüksek bir güvenlik riski sundu ve deneycilerin yakın tiroid izlemesini gerektirdi. Ek olarak, bu yöntemler nicel değildi, bu nedenle dinamik palmitoilasyonu ölçme yeteneğini sınırladı ve ayrıca ekstra kişisel koruyucu ekipman ve radyoaktif izleme nedeniyle kurulum ve temizlik için zaman aldı. Son olarak, radyoaktif etiketler proteomik çalışmalar için uygun değildi ve tipik olarak ilgilenilen spesifik proteinlerin düşük verim tespiti ile sınırlıydı. Daha fazla substrat tespit edildikçe ve kaçınılmaz olarak her modifikasyona aracılık eden enzimler tanımlandıkça, yeni tespit yöntemlerinin gerekli olduğu açıktı17,18,19,20,21. Neredeyse eşzamanlı olarak, yağlı asillenmiş proteinlerin tespiti için birkaç yeni yöntem ortaya çıktı. Birincisi, S-asilasyonun tiyoester bağının geri dönüşümlülüğünden ve reaktivitesinden yararlanır. Açil-biyotin değişimi (ABE) testi, avidin agaroz boncukları kullanılarak S-asillenmiş proteinlerin daha sonra çekilmesi ve batı blot22,23,24 ile doğrudan tespiti için palmitatın biyotin ile kimyasal olarak yerini alır. Daha sonra, yağ asitlerinin biyo-ortogonal etiketlenmesi ve Staudinger ligasyonunun kullanımını içeren etiketlere veya tutamaçlara kemoselektif ilaveler geliştirildi25,26,27,28,29,30,31,32,33 . Son olarak, ABE'ye benzer şekilde, açil-reçine destekli yakalama (RAC), S-asillenmiş proteinlerin yakalanması ve tespiti için S-asillenmiş bölgeleri tiol-reaktif boncuklarla değiştirir34,35. Değişim ve tıklama kimyası tabanlı analizler birlikte, aşağı akış analizi için daha verimli ve hassas asilasyon tespiti ve afinite saflaştırma yöntemleri sağlamış ve daha sonra binlerce S-asillenmiş proteinin keşfine yol açmıştır8,36.
Tıklama kimyası terimi bir grup kimyasal reaksiyonu kapsar, ancak en yaygın olarak bir alkinil grubu ile bir azido grubu arasındaki Cu(I)-katalizörlü azido-alkin [3+2] sikloekleme reaksiyon mekanizmasını ifade eder27,28,37. Özellikle, yağ asilasyonu durumunda, tıklama kimyası, endojen olarak asillenmiş proteinleri etiketlemek için sırasıyla hücrelere biyo-ortogonal 16-karbon alkinil-palmitat (15-hekzadesinoik asit; 15-HDYA) veya 14-karbonlu alkinil-miristat (13-tetradesinoik asit; 13-TDYA) dahil edilerek S-palmitoylation veya N-myristylation tespitini içerir28 . İlgilenilen proteinin hücre lizisi ve immünopresipitasyonundan sonra, batı blot28,37 tarafından tespit edilmek üzere bir afinite probunu, tipik olarak biyotini bağlamak için bir tıklama kimyası reaksiyonu (bir alkin ve bir azid arasındaki kovalent bağlantı) gerçekleştirilir. Alternatif olarak, toplam hücre lizatı üzerinde tıklama kimyası yapılabilir ve yağ asillenmiş proteinler, kütle spektrometrisi ile tanımlanmak üzere afinite saflaştırılabilir. Azido-biyotin ile ilk tıklama kimyası reaksiyonu, radyoaktiviteye kıyasla tespitin seçiciliğini ve duyarlılığını bir milyondan fazla artırmıştır2. Tıklama kimyasının bir diğer avantajı, kantitatif analiz için azido-homoalanin kullanılarak protein döngüsünün nabız kovalama analizi gibi diğer klasik etiketleme yöntemleriyle birleştirilebilmesidir38. Ek olarak, protein lokalizasyonunu incelemek için biyotin veya FLAG veya Myc etiketleri gibi diğer biyokimyasal problar yerine floresan problar kullanılabilir16,28,39.
Tıklama kimyasının göreceli kullanım kolaylığına rağmen, hücre kültüründe uzun zincirli serbest yağ asitlerinin kullanılmasının düşük çözünürlüğü ve potansiyel toksisitesi ile algılama sınırlandırılabilir40. Özellikle, proteinlerin çoğunluğu için S-asilasyonu sırasında palmitatın tercih edilmesine rağmen, birçok çalışma, ticari mevcudiyeti ve nispeten düşük maliyeti nedeniyle S-asillenmiş proteinleri tespit etmek için palmitat (15-HDYA) yerine 18-karbonlu stearat (17-oktadesinoik asit - 17-ODYA) kullanmıştır. Bununla birlikte, 17-ODYA çok çözünmezdir ve kullanılırken özel dikkat gerektirir. Ek olarak, tıklama kimyası, kimyasalların bazı nüanslı bir şekilde hazırlanmasını ve depolanmasını gerektirebilir. Burada protokol, yağ asitlerinin sabunlaştırılmasını, yağ asidi içermeyen BSA ile dağıtımı ve çözünürlüğü artırmak ve hücrelere serbest yağ asitleri eklemenin potansiyel toksik etkilerini atlamak için delipide fetal sığır serumu (FBS) ile dağıtımı optimize eden bir etiketleme yaklaşımını tanımlamaktadır28. Bu yöntem çeşitli hücre tiplerinde çalışır ve hatta canlı hayvanlarda bile kullanılmıştır28.

<table><tbody><tr><td>13-tetraksinoik asit (alkinil miristik asit) (25mM)</td><td>Click Kimya Araçları</td><td>1164</td><td></td></tr><tr><td>15-hekzadesinoik asit (alkinil palmitik asit) (100mM)</td><td>Click Kimya Araçları</td><td>1165</td><td></td></tr><tr><td>17-oktadesinoik asit (alkinil stearik asit) (100 mM)</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>90270</td><td></td></tr><tr><td>%30 akrilamid/bis çözeltisi 29:1</td><td>Biorad</td><td>1610156</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu plaka okuyucu</td><td>Biorad</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>AFDye 647 azide plus</td><td>Click Kimya Araçları</td><td>1482</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum persülfat (APS)</td><td>Biorad</td><td>1610700</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAPDH hFAB Rhodamine</td><td>Biorad</td><td>12004167</td><td></td></tr><tr><td>Anti-tavşan Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Tubulin hFAB Rhodamine Biorad</td><td></td><td></td><td></td>12004166</tr><tr><td>Biotin Azide</td><td>Click Kimya Araçları</td><td>1265</td><td></td></tr><tr><td>Bis-tris, ultra saf</td><td>VWR</td><td>715</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>JT Baker</td><td>1332-1</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj 16.000xg, 4 derece; C</td><td>Thermo Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kömür STRP FBS Tek Atış (DCC-FBS)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A3382101</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc Görüntüleyici</td><td>Biorad</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Bakır sülfat (1 mM)</td><td>VWR</td><td>BDH9312</td><td></td></tr><tr><td>Deoksikolik asit sodyum tuzu monohidrat</td><td>MP Biyomedikal</td><td>102906</td><td></td></tr><tr><td>Deterjan uyumlu (DC) tahlil</td><td>Biorad</td><td>Yok</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>VWR</td><td>0231-500 mL</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 1x</td><td>Wisent Inc</td><td>319015CL</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, susuz</td><td>N / A</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Yağ Asidi İçermeyen BSA</td><td>MP Biyomedikal</td><td>219989950</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı Leke Turbo Yarı kuru transfer</td><td>Biorad</td><td>Yok</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>FluoroTrans W PVDF (poliviniliden florür) transfer membranı</td><td>Pall Life Sciences</td><td>BSP0161</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (4- (2-Hidroksietil) -1-piperazinil] -etansülfonik) asit</td><td>VWR</td><td>5011</td><td></td></tr><tr><td>37 ° C'de Nemlendirilmiş İnkübatör; C ve %5 CO2</td><td>VWR</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Igepal CA-630</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61055</td><td></td></tr><tr><td>Görüntü Laboratuvarı Yazılımı</td><td>Biorad</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin takviyesi çözeltisi</td><td>Wisent Inc</td><td>609-065-EL</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>VWR</td><td>BDH1135</td><td></td></tr><tr><td>Miristik Asit (25 mM)</td><td>VWR</td><td>M0476-25G</td><td></td></tr><tr><td>Palmitik asit (100 mM)</td><td>VWR</td><td>P0002-25G</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin, 10x</td><td>Wisent Inc</td><td>450201EL</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A (sentetik)</td><td>Enzo Yaşam Bilimleri</td><td>ALX-260-085-M005</td><td></td></tr><tr><td>Fenilmetilsülfonil florür</td><td>Enzo Yaşam Bilimleri</td><td>ALX-270-184-G005</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin, 10x, pH 7.4</td><td>VWR</td><td>75801-000</td><td></td></tr><tr><td>GFP'ye Poliklonal Keçi antikoru (Afinite Saflaştırılmış)</td><td>Eusera</td><td>EU4</td><td></td></tr><tr><td>FluoroTrans W PVDF (poliviniliden florür) transfer membranı</td><td>Pall Yaşam Bilimleri</td><td>BSP0161</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum hidroksit</td><td>Ward's Science</td><td>470302-100</td><td></td></tr><tr><td>GFP Eusera'ya karşı tavşan poliklonal antikoru</td><td></td><td>EU1</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>VWR</td><td>0241-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfat (SDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat</td><td>Wisent Inc</td><td>600-110-EL</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Alexa Fluor 680 eşlenik</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S21378</td><td></td></tr><tr><td>Tris-(benziltriazolilmetil)amin (TBTA) (100 uM)</td><td>Tıklayın Kimya Araçları</td><td>1061</td><td></td></tr><tr><td>Tris-(2-karboksietil)fosfin HCl (TCEP) (1mM)</td><td>Soltec Ventures</td><td>M115</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin/EDTA Wisent</td><td>Inc</td><td>325-043-CL</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20 Reaktif Sınıfı 1L</td><td>VWR</td><td>97062-332</td><td></td></tr><tr><td>WHEATON NextGen V Şişeleri 3 mL</td><td>VWR</td><td>89085-424</td><td></td></tr></tbody></table>

click kimya kullanarak yağ asillenmiş proteinlerin tespiti için alkinil yağ asidi analoglarının optimize edilmiş birleştirilmesi

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Doymuş yağ asitlerinin protein substratlarına kovalent ilavesi olan yağ asilasyonu, kanser ve nörodejeneratif hastalıklardaki etkilerine ek olarak sayısız hücresel fonksiyonun düzenlenmesinde önemlidir. Yağ asilasyon tespit yöntemlerindeki son gelişmeler, özellikle biyo-ortogonal etiketlemeli klik kimyasının kullanılmasıyla, yağ asillenmiş proteinlerin verimli ve tehlikesiz bir şekilde algılanmasını sağlamıştır. Bununla birlikte, tıklama kimyası tespiti, hücre kültürüne uzun zincirli yağ asitleri eklemenin zayıf çözünürlüğü ve potansiyel toksik etkileri ile sınırlandırılabilir. Burada, yağ asidi içermeyen BSA ile birlikte sabunlaştırılmış yağ asitleri ve ayrıca tespit edilmesi zor yağ asillenmiş proteinlerin tespitini iyileştirebilen delipide edilmiş ortamlar kullanılarak optimize edilmiş bir etiketleme yaklaşımı açıklanmaktadır. Bu etki en çok, asillenmiş proteinlerin tıklama kimyası tespitinde en yaygın kullanılan yağ asidi analoğu olan alkinil-stearat analoğu 17-ODYA ile belirgindi. Bu modifikasyon hücresel katılımı artıracak ve asillenmiş protein tespitine duyarlılığı artıracaktır. Ek olarak, bu yaklaşım çeşitli hücre tiplerinde uygulanabilir ve nabız kovalama analizi, hücre kültüründeki amino asitlerle kararlı izotop etiketleme ve yağlı asillenmiş proteinlerin kantitatif profillemesi için kütle spektrometrisi gibi diğer tahlillerle birleştirilebilir.

Tıklama kimyası tespiti için sabunlaştırılmış ve sabunlaştırılmamış (sap olmayan) alkinil yağ asitleri arasındaki etiketleme verimliliğindeki fark, batı lekesi yoluyla yağ asillenmiş proteinlerin sinyal yoğunluğu ile görselleştirilebilir ve karşılaştırılabilir (Şekil 1). Açil zincirlerinin uzunluğunun artmasıyla gözle görülür bir etki gözlendi. Alkinil-stearat (alk-stear) ile etiketlenmiş hücrelerde, yağ asidinin sabunlaştırılması ve metabolik etiketleme için BSA ile verilmesi, tıklama kimyası yoluyla S-asillenmiş protein sinyalinin algılanmasını ve bir floresan azido probu ile tespitini büyük ölçüde arttırmıştır (Şekil 1, sağda), alkinil yağ asidi etiketinin hücresel katılımında genel bir artış olduğunu düşündürmektedir. Tersine, en kısa ve en çözünür yağ asidi olan alkinil-miristat (alk-myr; 13-tetradecynoic acid veya 13-TDYA) ile tedavi edilen hücrelerde gözle görülür bir fark gözlenmemiştir. Alkinil-palmitat ile etiketlenmiş hücreler (Şekil 1, orta), alkinil-miristat (13-TDYA) ile karşılaştırıldığında etikette bir ara artış gösterdi, ancak alkinil-stearattan daha azdı.
Önemli olarak, PVDF membranlarının 0.1 M KOH ile muamele edilmesi, yağ asidi etiketlerini alkinil-palmitat ve alkinil-stearat ile inkübe edilmiş hücrelerden büyük ölçüde kaldırdı ve sinyalin çoğunluğunun bir ester veya tiyoester bağından geçtiğini doğruladı (Şekil 1, orta ve sağ, alt paneller). Beklendiği gibi, alkinil-miristatın dahil edilmesi, miristatın bir amid bağı yoluyla proteinlere bağlanması nedeniyle çoğunlukla alkaliye dirençliydi (Şekil 1, sol, alt paneller).
Şekil 2, immünoçökeltilmiş proteinlerin yağlı asilasyonunu tespit etmek için tıklama kimyasının çok yönlülüğünü ve duyarlılığını göstermektedir. HEK293T hücreleri, GFP'ye (myr-ctHTT-GFP) kaynaştırılmış miristotelize C-terminal huntingtin (HTT) ile transfekte edildi ve daha önce tarif edildiği gibi alkinil-miristat ile etiketlendi18. İmmünopresipitasyonu takiben, ctHTT-GFP boncuklardan salındı ve lizatların yanında tıklama kimyasına tabi tutuldu. İmmünoçökitlerde sadece wildtype (WT) myr-ctHTT-GFP'nin myristoylasyonu tespit edilmekle kalmadı, aynı zamanda lizatlarda güçlü bir şekilde tespit edildi, oysa G2A mutasyonu ctHTT-GFP'nin miristoilasyonunu tamamen bloke etti (Şekil 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62107/62107fig01.jpg"> Şekil 1: Tıklama kimyası kullanılarak yağlı asillenmiş proteinlerin tespiti. HEK293T hücreleri, protokol 2.1-2.7'de tanımlandığı gibi, belirtilen yağ asitleri ile doğrudan (sap olmayan) veya sabunlaştırma (sap) ve taşıyıcı protein BSA ile inkübasyondan sonra inkübe edildi. Alkinil-yağ asitleri, 100 μg protein lizatını tıklama kimyasına maruz bırakarak, SDS-PAGE ile ayrılarak ve PVDF membranlarına aktarılarak floresan azide bağlandı. 0.1 M Tris pH 7.0 veya 0.1 M KOH ile tedaviden sonra, tiyoester bağlarını tersine çevirmek için, bir floresan azid kullanılarak yağ asilasyonu tespit edildi. GAPDH bir yükleme kontrolü olarak kullanıldı; anti-GAPDH rodamin (1:5,000). Alk-myr = 13-TDYA, alk-pal = 15-HDYA, alk-ste = 17-ODYA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62107/62107fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62107/62107fig2v3.jpg"> Şekil 2: Tıklama kimyası kullanılarak N-myristoylated ctHTT-GFP'nin tespiti. HEK293T hücreleri C-terminal kesilmiş (ct) ve HTT'nin miristolilabl formu (myr-ctHTT-GFP) ile transfekte edildi ve alkinil-miristat ile etiketlendi. Esansiyel glisin ile bir alanin ile değiştirilen miristoile edilemeyen bir form dahil edildi (G2A). Hasat ve lizisten sonra, ctHTT-GFP keçi anti-GFP kullanılarak immünopreprestite edildi. Lisatlar, boncuklardan salındıktan sonra immünopreçökitlerin yanı sıra tıklama kimyası reaksiyonuna (solda) maruz bırakıldı. Myristoylation Streptavidin Alexa 680 (SA680) kullanılarak tespit edildi. GFP, tavşan karşıtı Alexa 488 ile birlikte tavşan anti-GFP kullanılarak tespit edildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62107/62107fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62107/62107fig3v4.jpg"> Şekil 3: Deneysel protokolün iş akışı şeması. Protokoldeki ana deneysel adımların iş akışı taslağı. Protokolün duraklatılabileceği birkaç nokta belirtilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62107/62107fig3v3large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Yağ asilasyonunun incelenmesinin hücresel protein etkileşimleri ve hastalıklarda önemli etkileri vardır. Burada sunulan, çeşitli hücre tiplerinde uygulanabilen ve nabız kovalama ve kütle spektrometrisi de dahil olmak üzere diğer tahlillerle birleştirilebilen yağlı asillenmiş proteinlerin tıklama kimyası tespitini geliştirmek için modifiye edilmiş bir protokoldür.

Click Kimya Kullanarak Yağ Asillenmiş Proteinlerin Tespiti için Alkinil Yağ Asidi Analoglarının Optimize Edilmiş Birleştirilmesi

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Bu yöntem, yağ asitlerinin hücrelere verilmesini iyileştirir ve onları serbest yağ asidi dağıtımının toksik etkilerinden korur, böylece daha tutarlı etiketleme sağlar. Tıklama kimyası algılamasının hassasiyeti ve verimliliği, yağ asidi etiketinin etkili bir şekilde alınmasına bağlıdır. Bunun büyük ölçüde geliştirilebileceğini gösterdik.Protokolün birkaç adımı çok spesifiktir ve yakından takip edilmesi gerekir. Görsel bir gösterim, örneğin, etiketleme karışımında katı madde oluşumunun nasıl önleneceğini açıklığa kavuşturabilir ve gösterebilir. Etiketleme ortamını hazırlamak için, DMEM'i% 5 dekstran / kömür kaplı FBS, 1X penisilin streptomisin, iki milimolar L-glutamin ve 100 milimolar sodyum piruvat ile tamamlayın, ardından kullanmadan önce 37 santigrat dereceye ısıtın.Bir gün önce kaplanmış HEK-293 T hücrelerini PBS ile altı delikli bir doku kültürü kabında nazikçe yıkayın, ardından PBS'yi etiketleme ortamıyla değiştirin. Yağ asitleri ile metabolik etiketlemeye geçmeden önce hücreleri% 5 karbondioksit ile yaklaşık 45 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Yağ asidi analoglarını sabunlaştırmak için, pipet, alkinil yağ asidi analogunun en az iki mikrolitresini doğrudan üç mililitrelik bir konik reaksiyon şişesinin dibine yerleştirin.Pipet, camın kenarındaki reaksiyon şişesinin dibine yakın eşit miktarda seyreltilmiş potasyum hidroksit verir, böylece potasyum hidroksitin dağıtılan hacmi yağ asidi ile karışır. Şişenin kapağını kapatın ve çözeltileri karıştırmak için hafifçe dokunun. Reaksiyon şişesini yaklaşık beş dakika boyunca veya çözelti netleşene kadar 65 santigrat derecede ısıtın, bu da yağ asidinin dahil edildiğini gösterir.Bununla birlikte, sıvının çok fazla buharlaşmamasına dikkat edin. Daha sonra, pipet% 20 yağ asidi içermeyen BSA'yı önceden ısıttı, böylece yağ asitlerinin potasyum hidroksite yağ asidi içermeyen BSA'ya hacim oranı 1-1-50 olur ve 20X BSA'ya bağlı alkinil yağ asitlerinin nihai konsantrasyonuna ulaşır. Çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetleyerek, karıştırın, ardından 37 santigrat derecede 15 dakika boyunca inkübe edin.HEK-293 T-hücrelerini, 25 mikromolar alkinil miristat veya 100 mikromolar alkinil palmitat ve alkinil stearat içinde% 1'lik bir BSA nihai konsantrasyonu elde etmek için 20X yağ asidi BSA konjugatını doğrudan açlık ortamına ekleyerek etiketleyin. Karşılaştırma için, iki mikrolitre etiketlenmemiş yağ asidini doğrudan açlık ortamına pipetleyerek sabunlaşmamış sıvılar ekleyin, ardından hücreleri üç ila altı saat boyunca inkübatöre geri yerleştirin. Kuluçka tamamlandıktan sonra, hücreleri oda sıcaklığında PBS ile nazikçe yıkayın, ardından 500 mikrolitre EDTA içermeyen modifiye RIPA tamponu ekleyerek ve lizatları dört santigrat derecede 15 dakika döndürerek hücreleri toplayın ve lize edin.Lisatları dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 16.000 kez G'de santrifüj yapın, ardından süpernatantı 1.7 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerinde toplayın ve eksi 20 santigrat derecede saklayın. EDTA içermeyen modifiye RIPA tamponunu kullanarak 1.7 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerinde 50 ila 100 mikrogram protein lizatını eşit bir hacme getirin. Reaksiyon hacmini mümkün olduğunca küçük tutun.%1'lik son konsantrasyona ulaşmak için her numuneye STS ekleyinTıklama reaktiflerinin ana karışımını hazırlayın ve lizatlara uygun hacimler ekleyin, ardından yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Lisatları karanlıkta 30 dakika boyunca 37 santigrat derecelik bir su banyosunda ara sıra karıştırarak inkübe edin. İmmünopresipitasyon için, lizatları tavşan anti-GFP ile karıştırın ve dört santigrat derecede rotasyonla gece boyunca inkübe edin.Her tüpe %0,1 SDS RIPA ile önceden dengelenmiş 15 ila 20 mikrolitre manyetik boncuk ekleyin ve üç saat boyunca dört santigrat derecede uçtan uca reaksiyona girmesine izin verin. Boncukları lizis tamponu ile yıkayın ve% 1 SDS içeren 45 mikrolitre 50 milimolar HEPES tamponunda yeniden askıya alın. Boncukları 15 dakika boyunca 80 santigrat derecede ısıtın.Kuluçka sırasında, tüpleri yaklaşık her beş dakikada bir ters çevirin veya çalkalayın, ardından tüm tüpleri kısaca döndürün. Örnekler hala sıcakken, proteinleri içeren süpernatantı toplayın. Süpernatantın 43 mikrolitresini yedi mikrolitre tıklama reaktifleri ana karışımı ile birleştirin ve karanlıkta 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca reaksiyona girmelerine izin verin.Bir Batı grafiğinde, saponifiye edilmiş ve sabunlaştırılmamış alkinil yağ asitleri arasında tıklama kimyası tespiti için etiketleme verimliliğinde, açil zincirlerinin artan uzunluğu ile gözle görülür bir etki gözlenmiştir. Alkinil stearat ile etiketlenmiş hücrelerde, yağ asidinin sabunlaştırılması ve metabolik etiketleme için BSA ile verilmesi, tıklama kimyası ve floresan azitoprob ile tespit yoluyla S-asillenmiş protein sinyalinin tespitini büyük ölçüde artırdı ve alkinil yağ asidi etiketinin hücresel katılımında genel bir artış olduğunu düşündürdü. Tersine, en kısa ve en çözünür yağ asidi alkinil miristat ile tedavi edilen hücrelerde gözle görülür bir fark gözlenmedi.Alkinil palmitat ile etiketlenmiş hücreler, alkinil miristat ile karşılaştırıldığında etikette bir ara artış gösterdi, ancak alkinil stearattan daha azdı. Önemli olarak, PVDF membranlarının 0.1 molar potasyum hidroksit ile muamele edilmesi, yağ asidi etiketlerini alkinil palmitat ve alkinil stearat ile inkübe edilmiş hücrelerden büyük ölçüde kaldırdı ve sinyalin çoğunluğunun bir ester veya tiyoester bağından geçtiğini doğruladı. Beklendiği gibi, alkinil miristatın dahil edilmesi, sayısız statın bir amid bağı yoluyla proteinlere bağlanması nedeniyle çoğunlukla alkaliye dirençliydi.Klik kimyasını takiben, immünoçökitatların yanı sıra lizatlarda vahşi tip miristotelile C-terminal Huntington GFP'nin miristoilasyonu tespit edilirken, G2A mutasyonu C-terminali Huntington GFP'nin miristoilasyonunu tamamen bloke etti. Klik kimyasını takiben, kütle spektrometrisi için yağlı asillenmiş proteinlerin afinite saflaştırmasını gerçekleştirebiliriz. Bu, hücreleri toksisiteden koruyarak farklı bir yağ asillenmiş protein profili verebilir.

optimized-incorporation-alkynyl-fatty-acid-analogs-for-detection

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Adenovirüs parçacıklar doğal olmayan bir amino asit analog azidohomoalanine veya azido şeker içermesi için...

Bioorthogonal tıklayın Kimya ile Viral Yüzeylerin Kemoselektif Modifikasyonu

DNA ve proteinler dizi-spesifik afinite ya da DNA ya da protein Methyltransferases sentetik kofaktör analogları kullanılarak flüoresan raportör grup ile etiketlenir. Enzimler, aziridin veya çift aktif kofaktör benzerlerinin kofaktör özelliğine göre bir veya iki adım etiketleme için kullanılmaktadır.

Methyltransferases ve Kofaktör Analoglarının ile Nükleik Asitler ve Proteinler Dizi-spesifik Etiketleme

Burada, fotoafinite etiketlemesi kullanarak küçük molekül bağlayıcı proteinlerin tanımlanması için bir yöntem açıklıyoruz. Bu tekniğin avantajı, hedef proteinlerin bağlanma ve kovalent etiketlemesinin canlı hücresel ortamda gerçekleşmesi ve hücre lizizi üzerine doğal protein yapısını ve bağlanma koşullarını bozma riskini ortadan kaldırmasıdır.

Canlı hücre fotoafinite Etiketleme tarafından Yerli Hücresel Ortamında Küçük Molekül bağlayıcı proteinlerin belirlenmesi

Burada, bir etkinlik bazlı prob hazırlanmasını ve kullanımını tarif (ARN14686, undek-10-inil-N - [(3S) -2-oxoazetidin-3-il] karbamat) saptanması ve ölçülmesi için izin verir proinflamatuar enzimi N -acylethanolamine asit amidaz aktif formu (NAAA), hem in vitro ve ex vivo.

Hazırlama ve<em&gt; İn Vivo</em&gt; Bir Faaliyet tabanlı Sondası kullanılması için<em&gt; K</em&gt; -acylethanolamine Asit aminidaz

Burada, genetik olarak azid içeren bir amino asidi dahil ederek ve ardından azidi, suş destekli azid-alkin siklo ilavesi (SPAAC) ile kimyasal bir prob ile birleştirerek bir antikor fragmanına kimyasal probları bölgeye spesifik olarak sokmak için bir protokol sunuyoruz.

Verimli ve Siteye özgü Gerilme-terfi Azid-alkin Siklokatılma tarafından Antikor Etiketleme

Facile Floresans tahlil kanonik olmayan amino-asit (ncAAs) memeli hücrelerinde proteinlerin içine birleşmeyle amino-asil-tRNA-sentetaz/tRNA çiftleri verimliliğini değerlendirmek için sunulmuştur. G-protein birleştiğinde reseptörleri (GPCRs) çalışmaya ncAAs uygulanması siteleri ve bioorthogonal GPCR canlı hücreleri üzerinde etiketleme bağlama fotoğraf-çapraz eşleme dahil olmak üzere açıklanır.

Kimyasal ve genetik eklenmesi en iyi duruma getirme GPCRs fotoğraf-çapraz eşleme ve canlı memeli hücreleri Bioorthogonal kimyada probları

Proliferasyon hücresel fonksiyonun kritik bir parçasıdır ve yeni ilaçların potansiyel toksisitesini değerlendirmek için kullanılan yaygın bir okumadır. Bu nedenle, proliferasyonun ölçülmesi hücre biyolojisinde sıkça kullanılan bir ispondur. Burada, yapışık ve yapışık olmayan hücrelerde kullanılabilecek basit ve çok yönlü bir proliferasyon ölçme yöntemi salıyoruz.

Click Kimya kullanarak Vasküler Düz Kas Hücrelerinin Çoğalmasını Ölçme

Acyl-RAC (Acyl-Reçin Destekli Yakalama), çeşitli biyolojik örneklerde sistein kalıntılarının (S-aylasyon) geri dönüşümlü lipid modifikasyonunu tespit etmek için son derece hassas, güvenilir ve kolay bir yöntemdir.

Acyl-Reşin Destekli Yakalama ile Protein S-Acylation Tespiti

Burada, diyasilgliseril peptid ve alkin-fosfolipitleri klik-kimyası ile substrat olarak kullanarak apolipoprotein N-asiltransferaz aktivitesini izlemek için hassas bir floresan testi sunulmaktadır.

Enzim Karakterizasyonundan Yüksek Verimli Taramaya Kadar Apolipoprotein N-asiltransferaz için Click-Kimya Tabanlı Florometrik Analiz

Bu protokol, mutant L274G-Metiyonin tRNA sentetazı (MetRS*) ifade eden bir fare çizgisi kullanılarak azidonorlösin (ANL) ile hücre tipine özgü protein etiketlemesinin nasıl gerçekleştirileceğini ve etiketli hücre tipine özgü proteinlerin izolasyonu için gerekli adımları açıklar. Canlı farelerde (1) içme suyu ve (2) intraperitoneal enjeksiyonlarla iki olası ANL uygulama yolunu özetliyoruz.

Mutant Metiyonin tRNA Sentetaz Fare Hattı Kullanılarak Hücre Tipi Özgül Protein Saflaştırma ve Kompleks Dokulardan Tanımlama

Spesifik inhibitörleri taramak için hızlı ve doğru kimyasal tahliller, ilaç geliştirme cephaneliğinde önemli bir araçtır. Burada, HAT1 asetilasyon aktivitesinin inhibisyonunu ölçmek için ölçeklenebilir bir asetil-tıklama kimyası testi sunuyoruz.

Histon Asetiltransferaz 1 Asetilasyonunu Ölçmek için Bir Asetil-Tıklama Kimyası Testi

Keşfedin, yağ asillenmiş proteinlerin tespiti için click kimya kullanarak alkinil yağ asidi analoglarının optimize edilmiş birleştirilmesini. Bu yöntem, HEK-293T hücrelerinde uzun zincirli yağ asitleri için etiketleme verimliliğini artırır.

Click Kimya Kullanarak Yağ Asillenmiş Proteinlerin Tespiti için Alkinil Yağ Asidi Analoglarının Optimize Edilmiş Birleştirilmesi (Video) | JoVE Journal

Click Kimya Kullanarak Yağ Asillenmiş Proteinlerin Tespiti için Alkinil Yağ Asidi Analoglarının Optimize Edilmiş Birleştirilmesi

Daha fazla video keşfet