Name: Escherichia colide Genetik Kod Genişlemesi Kullanılarak Nükleozom Rekonses için Histonların Siteye Özgü Lizin Asetilasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Keşfedin, histon H3'e siteye özgü asetil-lizin yerleştirme ve rekonstrüe mononükleozom üretme yöntemini. Escherichia coli'de genetik kod genişlemesi kullanarak epigenetik mekanizmaları araştırın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Wesley Wang'a bu protokole ve değerli akıl hocalığına zemin hazırlayıp verdiği için teşekkür ederiz. Bu çalışma Kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri (GrantS R01GM127575 ve R01GM121584) ve Welch Foundation (Grant A-1715) tarafından desteklendi.

1. Plazmid yapımı
<ol><li>Hangi histone proteinin asetilasyona ve hangi lizin bölgesine karar vererek başlayın. Siteye yönlendirilmiş mutagenezi kullanarak siteyi amber stop codon'a (TAG) yönlendirin. NOT: Histone proteinlerinin ekspresyonu için daha önce tasarlanmış dört plazmid vardır. Dört histone proteini de N-terminal histidin etiketiyle pETDuet-1 vektörüne klonlandı. Histone H4 ayrıca bir SUMO etiketi, yaklaşık 40 kopya numarasına sahip çoğaltma colE1'in kökeni, ampisiline dayanıklı ve bir T7 promotörü içerir.<ol>
<li>Dört histone protein plazmidinden birinde istenen yerde (mevcut bir lizin kodonunu kehribar durdurma kodonu ile değiştirerek) TAG mutasyonu içeren ileri ve ters astarlar tasarlayın.</li>
		<li>Plazmid içeren TAG'i yükseltmek için tam plazmid PCR kullanın. Astarlar için uygun bir tavlama sıcaklığı belirleyin. Genel olarak, astarların eksi 5 °C'nin erime sıcaklığı (Tm)yeterli olacaktır. Bir PCR ürünü elde etmekte zorluk yaşanırsa, tavlama sıcaklığını amplifikasyon için optimize etmek için Tm - 5 °C civarında bir sıcaklık gradyanı kullanılabilir. NOT: Bu deneyde, aşağıdaki koşullarla 30 döngü boyunca şirket içinde ifade edilen bir PFU polimeraz kullanılmıştır: 30 s (denatürasyon) için 94 °C, 30 s için tavlama sıcaklığı ve 6 dakika (veya kilobase çiftleri başına 1 dk) için 72 °C. Bu tür PCR yöntemi hakkında daha fazla bilgiiçin bkz.</li>
		<li>Üreticinin protokolüne uyarak PCR ürününü pcr temizleme kiti ile temizleyin. PCR ürününü agarose jel elektroforezi ve daha sonra ethidyum bromür lekeleme ile analiz edin.</li>
		<li>Plazmidi 16 °C'de bir gecede T4 ligaz ile inkübasyon yaparak lige edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İlk plazmid (AmpR)içeren TAG'i kimyasal olarak yetkin Escherichia coli'yedönüştürün. Dönüşümden en az 4 koloni seçin ve plazmidi arındırın. Standart yöntemleri kullanarak gliserol ile her birinin hücre stoklarını yapın ve -80 °C'de saklayın. İstenen TAG mutasyonu onaylamak için sıralama için gönderin.</li>
	<li>Dizi onaylandıktan sonra, pEVOL-AckRS (ChlR)ile TAG içeren plazmid (AmpR)ile birlikte ısı şoku yöntemini kullanarak BL21 hücrelerinin silinmesini kimyasal olarak yetkin CobB'ye (E. coli.)bilinen tek histone lizin deacetylazı) dönüştürün. pEVOL, düşük kopya numarası p15A kökenli bir orta kopya numarasına sahip bir plazmiddir. NOT: pEVOL plazmid serisi, ortogonal aaRS/tRNATyr çiftinin protein kesilmesini azaltmada ve mutant proteinlerin genel verimini artırmada etkili olduğunu gösteren önceki çalışmalara dayanarak inşa edilmiştir8. CobB silme hücrelerine erişilemediyse, kimyasal olarak yetkin BL21 hücreleriyle devam edin. CobB sirtuin benzeri bir histone lizin deacetylazdır ve Nicotinamide alternatif bir yaklaşım olarak CobB'yi inhibe etmek için histone protein ekspresyonu sırasında 5 mM son konsantrasyonda eklenebilir9.</li>
	<li>Bir hücre stoğu yapın ve -80 °C'de saklayın.</li>
</ol>2. Asetillenmiş histone protein ekspresyonu
<ol><li>Bir kültür şişesinde 1 L otomatik kapatılmış 2YT ortamı (veya seçim hacmi) hazırlayın.</li>
	<li>TAG içeren plazmid (AmpR)ve pEVOL-AckRS (Chl R) içeren ve 37 °C ila OD = 0,6(4-6 h) arasında büyüyen ortak dönüştürülmüş hücre stoğu ile uygun antibiyotikleri içeren 2YT ortam 20 mL aşıla.</li>
	<li>1 L otoklavlı 2YT ortama uygun antibiyotikleri ekleyin ve 20 mL başlangıç kültürü ile aşıleyin. 37 °C'de OD = 0,6-0,8 (2-3 saat) arasında büyüyün.</li>
	<li>IPTG 1 mM, %0,2 arabinoz ve AcK 5 mM'nin son konsantrasyonlarına indükleme ajanları ve asetilsin (AcK) ekleyin.</li>
	<li>Kültürü 37 °C'de 6-8 saat büyütün.</li>
	<li>Pelet hücreleri 15 dakika boyunca 2.700 x g'da.</li>
	<li>Hücre peletini gece boyunca -80 °C'de saklayın.</li>
	<li>Bu adımdan itibaren numuneyi her zaman buzda tutun. Hücre peletini 1 L kültür başına 50 mL histone lizis tamponunda çözün.</li>
	<li>Aşağıdaki döngüye göre sonicate: 1 s açık, 1 s kapalı, toplam zamanında: 3 dk% 60 genlik.</li>
	<li>Pelet dahil vücutları 45 dakika boyunca 41.600 x g'da.</li>
	<li>30 mL histone liziz tamponunda süpernatant ve resuspend inklüzyon gövdelerini atın. Pelet içerme 30 dakika boyunca 41.600 x g'dadır. </li>
	<li>Süpernatant atın ve 30 mL pelet yıkama tamponunda dahil etme gövdelerini yeniden dirsindirin. Pelet dahil vücutları 30 dakika boyunca 41.600 x g'da.</li>
	<li>Süpernatant atın ve 6 M Guanidine Hidroklorür (GuHCl) tamponunun 25 mL'sinde dahil etme gövdelerini çözün. 1 saat boyunca 37 °C'de ajitasyon ile kuluçkaya yaslanın. NOT: Gerekirse, dahil etme organları 4 °C'de bir gecede ajitasyon ile inkübe edilebilir.</li>
	<li>Pelet içerme 45 dakika boyunca 41.600 x g'dadır. 2 saat boyunca 6 M GuHCl tamponu ile dengelenmiş 1 mL Ni-NTA reçinesi ile süpernatantı kuluçkaya yaslanın.</li>
	<li>Denatüre koşullar altında Ni-NTA saflaştırma ile devam edin. Sütunu 3 sütun hacminde sütun yıkama arabelleğiyle yıkayın. Elute asetillenmiş histone proteini 10 mL elüsyon tamponu ile. NOT: Proteini burada konsantre etmeye çalışmak bir seçenektir, ancak asetillenmiş histonlar çok öngörülemezdir ve kolayca çökelebilir. Toplam hacimde 2 mL'yi geçmeniz önerilmez.</li>
	<li>Tuzları çıkarmak için asetilasyonlu histone proteinini% 5 asetik asit tamponuna karşı kapsamlı bir şekilde dialyze edin. Dialyze 4 °C'de bir seferde 3 saat, en az 6 kez taze tampon alışverişi. NOT: Geliştirilmiş protein saflığı için saf suya karşı diyalze etme seçeneği vardır. Bununla birlikte, bu, düşük verimli asetillenmiş histone proteinleri için istenmeyen önemli yağış ve verim azalmasına neden olur.</li>
	<li>Aliquot ve lyophilize protein, ve süresiz olarak -80 °C depolayın. Yabani tip histone proteinleri genellikle 10-50 mg/L verim, asetilasyonlu histone proteinlerisse özgü lizin bölgesine bağlı olarak 10 mg/L'den az verim verir. Örneğin, H3K79Ac ortalama 5 mg/L' dir.</li>
</ol>3. Vahşi tip histon proteini ekspresyonu
<ol><li>Tam nükleozomları birleştirmek için, 4 histone proteinini de ifade edin. Vahşi tip histonları ifade ederken ve arındırırken protokol, aşağıdakiler dışında asetilen histonları ile aynıdır:<ol>
<li>Birlikte dönüştürme gerçekleştirmeyin. Vahşi tip histone ifadesi için pEVOL-AcKRS kullanmayın. Antibiyotikleri buna göre ayarlayın.</li>
		<li>Hücresel ifadenin indüksiyonu sırasında CobB silme hücresi hattı kullanmayın veya Nikotinamid, AcK veya arabinoz eklemeyin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 601 DNA'nın hazırlanması
NOT: Nükleozom konumlandırmasını yönlendirmek için önceden tasarlanmış optimize edilmiş bir DNA dizisi, yüksek verimli mononükleozom üretmek için histone oktamers ile birleştirilir. Bu dizi 601 DNA veya Widom dizisi olarak adlandırılır. Bu dizi, kromatin remodeling testlerinden tek molekül ölçümlerine kadar nükleozomların in vitro çalışmaları için standart DNA dizisi haline gelmiştir10.
<ol><li>Nükleozom montajı için önemli miktarlarda 601 DNA hazırlamak için pGEM-3z/601'i Top 10 hücrelerine dönüştürün ve plazmid amplifikasyon ve ekstraksiyon için 10 mL kültür yetiştirin. Plazmid çıkarma kiti kullanın ve üreticinin tavsiyesine uyun.</li>
	<li>Bu amplifikasyon protokolü için şirket içinde ifade edilmiş bir PFU polimeraz (daha verimli) kullanın. PCR reaksiyonsu ayarlama: 250 μL reaksiyon için, 207.5 μL otoklavlı MQ H2O, 25 μL 10x PFU Tampon, 5 μL İleri Astar: ctggagaatcccggtgccg, 5 μL Ters Astar: acaggatgtatatctgacacg, 5 μL dNTP karışımı, 2.5 μL PFU enzimi kullanın. Genellikle aynı anda 60 reaksiyon çalıştırarak bir araya yetecek kadar DNA elde ederiz.</li>
	<li>PFU polimeraz kullanıyorsanız, 30 s için 52 °C tavlama sıcaklığı ve 30 s uzatma süresi kullanın. Aksi takdirde üreticilerin önerdiği koşulları izleyin.</li>
	<li>PCR yapıldıktan sonra, PCR ürününü saflaştırmak için tercih edilen bir PCR temizleme kiti kullanın.</li>
</ol>5. Histone oktamer montajı
<ol><li>H2A, H2B, H3 ve H4 histone protein peletlerinin aliquotlarını çözün, böylece GuHCl Buffer'daki her histone proteininin ayrı bir stoğu vardır ve toplam hacmi 100 μL'dir.</li>
	<li>A280 emiciliği ölçerek her bir histon proteininin konsantrasyonunu hesaplayın.</li>
	<li>Emicilik herhangi bir protein için 1'den büyükse, daha doğru bir konsantrasyon elde etmek için GuHCl tamponu ile seyreltin.</li>
	<li>H2A ve H2B proteinlerini 1:1 molar oranında birleştirin ve toplam 4 μg/μL protein konsantrasyonuna seyreltin.</li>
	<li>Dialyze bir gecede 2 M TE arabelleğe karşı 4 °C'de sırayla, 2 h için 1 M TE arabellek ve 5 saat için 0,5 M TE arabellek. NOT: Diyalizin ikinci ve üçüncü adımları, çökeltmek için kararsız protein uyumlarına neden olur. Bu adımlarda yoğun yağış görülmesi bekleniyor.</li>
	<li>4 °C'de 16.800 x g'da santrifüjleme ile çökeltmeleri çıkarın.</li>
	<li>Yine, A280 emiciliğini ölçen histone dimer (H2A/H2B karışımı) ve tetramerlerin (H3/H4 karışımı) konsantrasyonunu hesaplayın.</li>
	<li>Dimerleri ve tetramerleri 1:1 molar oranında karıştırın ve katı NaCl ilavesi ile NaCl'i 2 M'ye ayarlayın.</li>
	<li>Histone oktamer 4 °C'de saklanabilir ve dimer ve tetramerlerden daha kararlıdır. Demonteye neden olabileceği için asla histone oktamerini dondurmayın.</li>
	<li>Asetillenmiş histonlarla bir araya getiriyorsanız, vahşi tip proteini prosedürdeki asetilasyonlu proteinle değiştirmenız yeterlidir.</li>
</ol>6. Nükleozom montajı
<ol><li>601 DNA'yı 2M TE arabelleğe ayarlamak için 100x TE arabellek ve katı NaCl kullanın. 2M TE tampondaki 601 DNA'yı 0.85:1 ila 0.90:1 molar oranında histone oktamerine ekleyin. Jel kayma analizinde serbest DNA varsa daha düşük bir DNA oranı eklenebilir.</li>
	<li>DNA-histon karışımını bir diyaliz torbasına aktarın ve yaklaşık 200 mL 2M TE tampona (veya birden fazla numuneyi monte ediyorsanız daha fazla) yerleştirin ve 4 °C'de çok hafifçe karıştırın.</li>
	<li>Tuz TE tamponunda yavaşça damlatmak için temizlemek için peristaltik bir pompa ayarlayın. Hacim kabaca iki katına çıktığında, hacmin yarısını dökün. Bunu toplamda en az 4 kez yapın. Bir pompa ile bu, başlangıç hacmine bağlı olarak 4-8 saat sürebilir. Tuz konsantrasyonu 150 mM'ye düşürüldüğünde nükleozomlar oluşur (tuzluluk ölçer ile ölçülür).</li>
	<li>Tuz konsantrasyonu 150 mM'ye düşürüldükten sonra, bir gecede 20 mM TE tampona karşı dialyze edin.</li>
	<li>Çökeltme ile çökeltmeleri çıkarın ve bir plaka okuyucu kullanarak nükleozomların konsantrasyonunu A260 okuma ile ölçün.</li>
	<li>His-TEV proteazını ekleyin (TEV: nükleozom 1:30, w:w) ve tüm histidin etiketlerini kaldırmak için 4 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın. Ni-NTA reçinesi aşağı çekerek nükleozom çözeltisinden histidin etiket safsızlıklarını çıkarın.</li>
	<li>Nükleozomları konumlandırmak ve numuneyi homojenize etmek için 1 saat boyunca 60 °C'de kuluçkaya yatırın. NOT: Özellikle kararsız olan asetillenmiş siteler için bu adım tavsiye edilmeyebilir.</li>
	<li>Nükleozomları 4 °C'de kısa süreli (birkaç hafta) saklayın.</li>
	<li>Uzun süreli depolama için, nükleozomları depolama tamponuna karşı dialyze edin ve -80 °C'de saklayın.</li>
</ol>

<ol><li>Srinivasan, G., James, C. M., Krzycki, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrrolysine+encoded+by+UAG+in+Archaea%3A+Charging+of+a+UAG-Decoding+specialized+tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding specialized tRNA.</a> Science. 296 (5572), 1459-1462 (2002).</li>
<li>Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrrolysyl-tRNA+synthetase%3A+an+ordinary+enzyme+but+an+outstanding+genetic+code+expansion+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1844 (6), 1059-1070 (2014).</li>
<li>Umehara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Acetyl+lysyl-tRNA+synthetases+evolved+by+a+CcdB-based+selection+possess+N-acetyl+lysine+specificity+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">N-Acetyl lysyl-tRNA synthetases evolved by a CcdB-based selection possess N-acetyl lysine specificity in vitro and in vivo.</a> FEBS Letters. 586 (6), 729-733 (2012).</li>
<li>Hsu, W. W., Wu, B., Liu, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sirtuins+1+and+2+are+universal+histone+deacetylases%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Sirtuins 1 and 2 are universal histone deacetylases.</a> ACS Chemical Biology. 11 (3), 792-799 (2016).</li>
<li>Wang, W. W., Zeng, Y., Wu, B., Deiters, A., Liu, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+biology+approach+to+reveal+Sirt6-targeted+histone+H3+sites+in+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A chemical biology approach to reveal Sirt6-targeted histone H3 sites in nucleosomes.</a> ACS Chemical Biology. 11 (7), 1973-1981 (2016).</li>
<li>Wang, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+click+chemistry+approach+reveals+the+chromatin-dependent+histone+H3K36+deacylase+nature+of+SIRT7%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A click chemistry approach reveals the chromatin-dependent histone H3K36 deacylase nature of SIRT7.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (6), 2462-2473 (2019).</li>
<li>Liu, H., Naismith, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+one-step+site-directed+deletion%2C+insertion%2C+single+and+multiple-site+plasmid+mutagenesis+protocol%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.</a> BMC Biotechnology. 8 (1), 91(2008).</li>
<li>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+system+for+unnatural+amino+acid+mutagenesis+in+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli.</a> Journal of Molecular Biology. 395 (2), 361-374 (2010).</li>
<li>Gallego-Jara, J., Écija Conesa, A., de Diego Puente, T., Lozano Terol, G., Cánovas Díaz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+CobB+kinetics+and+inhibition+by+nicotinamide%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of CobB kinetics and inhibition by nicotinamide.</a> PLoS One. 12 (12), 0189689(2017).</li>
<li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+tight+nuclear+tethering+and+inactivation+of+cGAS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of tight nuclear tethering and inactivation of cGAS.</a> Nature. 587 (7835), 673-677 (2020).</li>
<li>Burdette, D. L., Vance, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STING+and+the+innate+immune+response+to+nucleic+acids+in+the+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">STING and the innate immune response to nucleic acids in the cytosol.</a> Nature Immunology. 14 (1), 19-26 (2013).</li>
<li>Barber, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+DNA+sensing+pathways%3A+STING%2C+AIMII+and+the+regulation+of+interferon+production+and+inflammatory+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Innate immune DNA sensing pathways: STING, AIMII and the regulation of interferon production and inflammatory responses.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (1), 10-20 (2011).</li>
<li>Ablasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cGAS+produces+a+2%27-5%27-linked+cyclic+dinucleotide+second+messenger+that+activates+STING%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">cGAS produces a 2'-5'-linked cyclic dinucleotide second messenger that activates STING.</a> Nature. 498 (7454), 380-384 (2013).</li>
<li>Gao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+%5BG%282%27%2C5%27%29pA%283%27%2C5%27%29p%5D+is+the+metazoan+second+messenger+produced+by+DNA-activated+cyclic+GMP-AMP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cyclic [G(2',5')pA(3',5')p] is the metazoan second messenger produced by DNA-activated cyclic GMP-AMP synthase.</a> Cell. 153 (5), 1094-1107 (2013).</li>
<li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+PLPLRT%2FSD+motif+of+STING+mediates+the+recruitment+and+activation+of+TBK1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A conserved PLPLRT/SD motif of STING mediates the recruitment and activation of TBK1.</a> Nature. 569 (7758), 718-722 (2019).</li>
</ol>

Yazarların hiçbiri tarafından beyan edilen rakip finansal çıkarlar yoktur.

Bir deney sırasında bu protokolü her ayrıntıya uymak önemlidir. Nükleozomlar çok kararlı değildir ve bu protokolün belirlenmesinde çok fazla deneme yanılma olmuştur. Partiküller montaj işlemlerine kolayca müdahale edebileceğinden, her adımda (veya gözlendiği zaman) çökeltileri kaldırmak anahtardır. Her zaman ton örneklerini buzda tut. Nükleozomlar 4 °C'de çok uzun süre saklanırsa, kendiliğinden sökülebilirsiniz. Herhangi bir denemede kullanılmadan önce 2 haftadan uzun bir süre 4 °C'de saklanırsa, herhangi bir örneği Nati...

Biz sentezlemek ve siteye özgü asetillelenmiş histonlar ile yeniden inşa mononükleozomları birleştirmek içinPylRS ve tRNA Pyl kullandık. PylRS, post translational modifikasyonlara (PTM) sahip proteinler üretmek için genetik kod genişletme aracı olarak paha biçilmez olduğunu kanıtlamıştır ve genetik olarak yaklaşık 200 farklı nTA'yı içerecek şekilde evrimleştirilmiştir. PylRS, çeviri sırasında diğer amino asitlerden kaynaklanan rekabeti ortadan kaldırarak kehribar stop kodonuna dahil olur. PylRS ilk olarak metanojenik arkealarda keşfedilmiştir ve o zamandan beri kimyasal biyolojide yeni reaktif kimyasal grupları proteinlere dahil etmek için1,2.
MmAcKRS1, Methanosarcina mazei PylRS'den evrimleşmiştir ve laboratuvarımızda asetillenmiş proteinlerin sentezi için sıklıkla3, 4,5,6. MmAcKRS1, Escherichia coli'deçeviri sırasında tercih ettiği mRNA'daki bir kehribar mutasyon bölgesinde AcK sunar. Bu teknik daha önce K4, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64 ve K79 histone H3 lizin sitelerinde Sirtuin 1, 2, 6 ve 7'nin asetilasyonlu mononükleozomlar4,5,6üzerindeki aktivitesini incelemek için kullanılmıştır. Burada asetillenmiş histonları ifade etmek ve asetillenmiş nükleozomları yeniden inşa etmek için bu yöntemi detaylandırıyoruz.

<table><tbody><tr><td>0,5 m TE tampon</td><td>NA</td><td></td><td>NA 0,5 m NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8</td></tr><tr><td>1 m TE tampon</td><td>NA</td><td></td><td>NA 1 m NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8</td></tr><tr><td>100x TE tampon</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>2 m TE tampon</td><td>NA</td><td>NA</td><td>2 m NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8</td></tr><tr><td>20 mM TE tampon</td><td>NA</td><td></td><td>NA 20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td></tr><tr><td>6 M GuHCl</td><td></td><td></td><td>6M guanidinyum klorür, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0</td></tr><tr><td>Asetillisin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolonu Yıkama Tamponu</td><td>NA</td><td>NA 6</td><td>M üre, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazol pH 7.8</td></tr><tr><td>Elüsyon Tamponu</td><td>NA</td><td>NA Fisherbrand</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Değişken Akışlı Kimyasal Transfer Pompası</td><td>Fischer Scientific</td><td>15-077-67</td><td></td></tr><tr><td>His-TEV proteaz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Histon Lizis Tamponu</td><td>NA</td><td>NA</td><td>60 mM Tris, 100 mM NaCl, %0.5 Triton-X100 (h/h), 1 mM PMSF pH 8.0</td></tr><tr><td>Ni-NTA Reçine</td><td></td><td></td><td>6 M üre, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazol, pH 7.8</td></tr><tr><td>PCR Temizleme Kiti</td><td>Epoch Life Sicences</td><td>2360050</td><td></td></tr><tr><td>Pelet Yıkama Tamponu</td><td>NA</td><td>NA</td><td>60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0</td></tr><tr><td>petDUET-His-SUMO-TEV-H4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petDUET-His-TEV-H2A</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petDUET-His-TEV-H2B</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petDUET-His-TEV-H3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pEVOL-AckRS</td><td>Addgene</td><td>137976</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-3Z/601</td><td>Addgene</td><td>26656</td><td></td></tr><tr><td>Depolama Tamponu</td><td>NA</td><td>NA</td><td>20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, %20 gliserol, pH 7.8</td></tr><tr><td>Termodöngüleyici</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

escherichia coli'de genetik kod genişlemesi kullanılarak nükleozom rekonses için histonların siteye Özgü lizin asetilasyonu

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Asetillenmiş histone proteinleri, bir mutant kodlayan Escherichia coli'de kolayca ifade edilebilir, Nε-asetil-lizin (AcK)-spesifik Methanosarcina mazi pirrolysine tRNA-synthetase (MmAcKRS1) ve onun konyak tRNA (tRNAPyl)siteye özgü asetillenmiş histonları ile yeniden inşa mononükleozomları birleştirmek için. MmAcKRS1 ve tRNAPyl, Escherichia coli'deçeviri sırasında tercih ettiği mRNA'daki bir kehribar mutasyon bölgesinde AcK sağlar. Bu teknik, H3 lizin sahalarında ACK'yı dahil etmek için yaygın olarak kullanılmıştır. Pyrrolysyl-tRNA sentezi (PylRS) ayrıca bölgeye özgü protein modifikasyonu veya fonksiyonelleştirme için diğer nonkanonik amino asitleri (ncAA'lar) içerecek şekilde kolayca geliştirilebilir. Burada MmAcKRS1 sistemini kullanarak AcK'yı histone H3'e dahil etmek ve asetillenmiş H3 proteinlerini yeniden inşa edilmiş mononükleozomlara entegre etmek için bir yöntem detaylandırıyoruz. Asetillenmiş yeniden inşa edilmiş mononükleozomlar biyokimyasal ve bağlayıcı tahlillerde, yapı belirlemede ve daha fazlasında kullanılabilir. Modifiye mononükleozomların elde edilmesi, yeni etkileşimler keşfetmek ve epigenetiği anlamakla ilgili deneyler tasarlamak için çok önemlidir.

Dimerler, tetramerler ve oktavlar% 12 SDS PAGE jeli (Şekil 1 ve Şekil 2)çalıştırılarak değerlendirilebilir. Burada, bazı asetilasyonlu tetramerlerin diğerlerinden daha düşük verime sahip olduğunu görebilirsiniz (Şekil 1). Aslında, çekirdek bölgeye ne kadar yakınsa, verim o kadar düşük gözlenir. Bu büyük olasılıkla, tetramer montajına müdahale eden asetilasyondan kaynaklanmaktadır. Octamers monte edil...

Burada, genetik kod genişlemesini kullanarak asetillenmiş histone proteinlerini ifade etmek ve yeniden inşa edilmiş nükleozomları in vitro olarak birleştirmek için bir yöntem sunuyoruz.

Escherichia coli'de Genetik Kod Genişlemesi Kullanılarak Nükleozom Rekonses için Histonların Siteye Özgü Lizin Asetilasyonu

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...

Modifiye mononükleozom elde etmek, epigenetik deneylerin tasarlanması için çok önemlidir. Protokolümüz, biyokimyasal ve bağlanma tahlillerinde, yapı belirlemede ve daha fazlasında kullanılabilen asetillenmiş sulandırılmış mononükleozomlar sağlar. Tekniğimizin birincil avantajı çok yönlülüğüdür.Bu sistem, birçok modifikasyon türünü mononükleozomlara dahil etmek için kolayca değiştirilebilir. Bir kültür şişesinde bir litre otoklavlanmış 2YT ortamı hazırlayarak başlayın. Uygun antibiyotik içeren ortamın 20 mililitresini plazmid ve pEVOL-AckRS içeren etikete sahip ko-transforme hücre stoğu ile aşılayın ve 0.6'lık bir OD elde etmek için bunları 37 santigrat derecede büyütün.Bir litre otoklavlanmış 2YT besiyerine uygun antibiyotikler ekleyin ve 20 mililitre başlangıç kültürü ile aşılayın. 0.6, 2.8'lik bir OD elde etmek için kültürü iki ila üç saat boyunca 37 santigrat derecede büyütün. Bir milimolar IPTG,% 0.2 arabinoz ve beş milimolar AcK'lık bir son konsantrasyon için indükleyici ajanlar ve AcK ekleyin.Kültürü altı ila sekiz saat boyunca 37 santigrat derecede büyütün. Daha sonra hücreleri 15 dakika boyunca 2.700 x g'da pelet haline getirin ve gece boyunca eksi 80 santigrat derecede saklayın. Peletleri, bir litre kültür başına 50 mililitre histon lizis tamponunda çözün ve hücreleri, bir saniye açık ve bir saniye kapalı aralıklarla üç dakika boyunca% 60 genlikte sonikleştirin.45 dakika boyunca 41.600 x g'da pelet inklüzyon cisimleri. Süpernatanı atın ve ardından inklüzyon cisimciklerini 30 mililitre histon lizis tamponunda yeniden süspanse edin, ardından 30 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin. İnklüzyon cisimciklerini 30 mililitre pelet yıkama tamponunda tekrar askıya alın ve santrifüjlemeyi tekrarlayın.Daha sonra, inklüzyon cisimciklerini 25 mililitre altı molar guanidin hidroklorür tamponu içinde çözün. Bir saat boyunca 37 derecede çalkalama ile inkübe edin, daha sonra 45 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı, altı molar guanidinyum hidroklorür tamponu ile dengelenmiş bir mililitre nikel-NTA reçinesi ile iki saat inkübe edin ve denatüre koşullar altında nikel-NTA saflaştırmasına devam edin.Sütunu üç sütun hacmi yıkama tamponu ile yıkayın, ardından asetillenmiş histon proteinini 10 mililitre elüsyon tamponu ile elüte edin. Asetillenmiş histon proteinini% 5 asetik asit tamponuna karşı diyalize edin, tuzları dört santigrat derecede üç saat boyunca çıkarmak için tamponu en az altı kez değiştirin. Aliquot ve lipoliz proteini ve eksi 80 derecede süresiz olarak saklanır.Histon protein peletleri H2A, H2B, H3 ve H4'ün alikotlarını çözün, böylece toplam 100 mikrolitre hacim için guanidinyum hidroklorür tamponunda her histon proteininden ayrı bir stok olur. Emicileri 280 nanometrede ölçerek her histon proteininin konsantrasyonunu hesaplayın. Absorbans herhangi bir protein için birden büyükse, daha doğru bir konsantrasyon elde etmek için guanidinyum hidroklorür tamponu ile seyreltin.H2A'yı H2B ve H3'ü H4 proteinleri ile bire bir molar oranda birleştirin ve mikrolitre başına toplam dört mikrogram protein konsantrasyonuna seyreltin. Gece boyunca iki molar TE tamponuna, iki saat boyunca bir molar TE tamponuna ve beş saat boyunca 0.5 molar TE tamponuna karşı dört santigrat derecede sırayla diyalize edin. Bittiğinde, çökeltiyi çıkarmak için dört santigrat derecede 16.800 x g'de santrifüjleyin.280 nanometrede absorbansı ölçerek histon dimerlerinin ve tetramerlerin konsantrasyonunu hesaplayın. Dimerleri ve tetramerleri bire bir molar oranda karıştırın ve sodyum klorür konsantrasyonunu 2M'ye ayarlayın. 601X TE tamponu ve katı sodyum klorür kullanarak 100 DNA'yı iki molar TE tamponuna ayarlayın.Çözeltiyi histon oktamerine 0.85, 2.9 ila bir molar oranda ekleyin. DNA histon karışımını bir diyaliz torbasına aktarın ve dört santigrat derecede çok hafif karıştırarak yaklaşık 200 mililitre iki molar TE tamponuna yerleştirin. Peristaltik pompayı tuzsuz TE tamponuna yavaşça damlatacak şekilde ayarlayın.Hacim kabaca iki katına çıktığında, hacmin yarısını boşaltın. Bunu en az dört kez yapın, bu da başlangıç hacmine bağlı olarak dört ila sekiz saat sürebilir. Tuz konsantrasyonu 150 milimolar'a düşürüldükten sonra, gece boyunca 20 milimolar TE tamponuna karşı diyalize girin.Çökeltileri santrifüjleme ile çıkarın ve nükleozomların konsantrasyonunu bir plaka okuyucu ile ölçün. His-TEV proteazını ekleyin ve tüm histidin etiketlerini çıkarmak için gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ardından, nikel-NTA reçinesi aşağı çekerek nükleozom çözeltisinden histidin etiketi safsızlıklarını çıkarın.Nükleozomu konumlandırmak ve numuneyi homojenize etmek için 60 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Nükleozomları kısa süreli olarak dört santigrat derecede saklayın. Uzun süreli depolama için, nükleozomları depolama tamponuna karşı diyalize edin ve eksi 80 santigrat derecede saklayın.Asetillenmiş tetramerlerin bazıları, %12'lik bir SDS-PAGE jeli çalıştırılarak değerlendirildiği gibi diğerlerinden daha düşük bir verime sahipti. Çekirdek bölgeye ne kadar yakın olursa, gözlemlenen verim o kadar düşük olur. Bu, büyük olasılıkla, oktamer düzeneğine müdahale eden asetilasyondan kaynaklanıyordu.Oktamerleri 601 DNA dizisi ile birleştirdikten sonra, nükleozom %5 1X TBE'ye özgü PAGE jeli kullanılarak değerlendirilebilir ve ardından etidyum bromür ile boyanabilir. Termal konumlandırmadan önce, gözlemlenen nükleozom bantları çok geniştir ve çizgili olabilir. Bu protokolü uygularken, proteinleri her zaman buz üzerinde tutun.Birleştirilmiş dimerleri, tetramerleri ve nükleozomu korumak çok önemlidir. Bu prosedür, araştırmacıların asetil lizin bölgelerini, özellikle mononükleozomlara yerleştirmelerine izin vererek, bir kromatin bağlamında translasyon sonrası modifikasyonları incelemek için kapıyı açtı. Herhangi bir sayıda kanonik olmayan amino asidi yerleştirmek için kolayca uyarlanabilir.

site-specific-lysine-acetylation-histones-for-nucleosome

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Biz lisin metilasyon değişiklikleri ölçmek için MALDI kütle spektrometresi ve indirgeyici metilasyon kimya kullanmak için bir yöntem sunuyoruz.

Lizin demetilaz Faaliyet Kantitatif Ölçümler MassSQUIRM Uygulaması

Tıbbi, farmasötik, yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için Kanonik olmayan amino asit analoglarının proteinlere kalıntıya özgü dahil edilmesi için kullanımı kolay, hücresiz bir ekspresyon protokolü sunulmuştur.

Bir Kullanarak Modeli Proteinler içine Kuralsız Amino Asit kalıntı özgü Ortaklığın<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Hücre içermeyen Transkripsiyon-çeviri Sistemi

Bu protokol farklı şekilde izotop işaretli kardeş histon içeren nükleozom sulandırılması açıklar. Aynı zamanda, asimetrik translasyon sonrası modifiye edilmiş nükleozom bir premodified histon kopya kullandıktan sonra oluşturulabilir. Bu preparatlar kolaylıkla yüksek çözünürlüklü NMR spektroskopisi kullanarak, her iki kız kardeş histonlar üzerinde eş zamanlı olarak, değişiklik çapraz-karışma mekanizmaları incelemek için kullanılabilir.

Farklı Olarak izotopla işaretli Kardeş histonlarla nükleozomlann Sulandırma

Bu el yazısı, histonları ve bunların translasyon sonrası modifikasyonlarını tanıyan antikorların spesifiklik profiline peptid mikroarray teknolojisinin uygulanması için yöntemleri açıklamaktadır.

Histon Antikor Özgüllüğünün Peptit Mikroarraylerle Analizi

Biz yalıtmak ve nöral progenitör hücreler embriyonik ve postnatal beyin dokusundan Kromatin immunoprecipitation (ChIP) Histon 3 lizin 79 dimethylation (H3K79me2) - içinde yer alan bir Histon işareti için kültür için etkili ve tekrarlanabilir bir yöntem mevcut Histon 3 küresel etki alanı.

Yalıtım ve sinirsel ataları Kromatin-Immunoprecipitation Histon 3 lizin 79 Dimethylation Mark tarafından takip tarımı

Genetik kod genişleme biyolojik süreçler, protein asetilasyon dahil olmak üzere geniş bir çalışma için güçlü bir araç olarak hizmet vermektedir. Burada biz homojen oluşturmak için bu teknik yararlanma facile bir protokol proteinler, Escherichia coli hücreleri belirli sitelerdeki acetylated göstermek.

Escherichia Coli proteinler Site-Specifically oluşturmak için Facile iletişim kuralı Acetylated

Burada, siteye özgü protein asetilasyon ve/veya succinylation İskan izni (stoichiometry) sonra sunulan değişiklikler için endojen değişiklikler ratiometric analizi ile tüm bir Proteom, tarafsız miktar mevcut nicel kimyasal asilasyonu kararlı izotop etiketli anhidritler kullanarak. Hassas verileri bağımsız edinme kütle spektrometresi ile birlikte, doğru site doluluk ölçümler elde edilir.

Siteye özel Protein lizin asetilasyon ve Succinylation veri bağımsız edinme kütle spektrometresi kullanılarak Stoichiometry miktar

Kromatin çevre düzenlenmesi uygun gen ekspresyonu için gerekli temel bir işlemdir. Burada, biz gen ekspresyonu kromatin değiştirme alımı yoluyla kontrol etmek için bir yöntem tarif gene özgü ve geri dönüşümlü bir şekilde makine.

Kimyasal epigenetik değiştiriciler ile hücresel makine yeniden yönlendirerek Gen transkripsiyonu bastırmak

Bu makale, tek moleküllü korelasyon kuvveti ve floresan mikroskobu için nükleozom içeren DNA bağlarının yeniden yapılandırılması için ayrıntılı bir deneysel prosedür sunmaktadır. Ayrıca, kromatin ile etkileşime giren proteinlerin bağlanma davranışını görselleştirmek ve nükleozomların fiziksel özelliklerindeki değişiklikleri analiz etmek için yapılabilecek birkaç aşağı akış deneyini açıklar.

Tek moleküllü korelasyon kuvveti ve floresan mikroskobu için yerinde nükleozom düzeneği

Bu çalışma, Escherichia coli ve memeli hücrelerinde insan enolaza-1'in (hENO1) belirli bölgelerinde laktil-lizin (Klac) ve süper klasör GFP'nin (sfGFP) belirli bölgelerinde genetik kod genişlemesini kullanan bir yöntem geliştirdi.

E. coli ve memeli hücrelerinde genetik kod genişletmesiyle siteye özgü lizin laktilasyonu

Keşfedin, histon H3'e siteye özgü asetil-lizin yerleştirme ve rekonstrüe mononükleozom üretme yöntemini. Escherichia coli'de genetik kod genişlemesi kullanarak epigenetik mekanizmaları araştırın.

Escherichia coli'de Genetik Kod Genişlemesi Kullanılarak Nükleozom Rekonses için Histonların Siteye Özgü Lizin Asetilasyonu

Daha fazla video keşfet