Escherichia coli'de Genetik Kod Genişlemesi Kullanılarak Nükleozom Rekonses için Histonların Siteye Özgü Lizin Asetilasyonu

Modifiye mononükleozom elde etmek, epigenetik deneylerin tasarlanması için çok önemlidir. Protokolümüz, biyokimyasal ve bağlanma tahlillerinde, yapı belirlemede ve daha fazlasında kullanılabilen asetillenmiş sulandırılmış mononükleozomlar sağlar. Tekniğimizin birincil avantajı çok yönlülüğüdür.

Bu sistem, birçok modifikasyon türünü mononükleozomlara dahil etmek için kolayca değiştirilebilir. Bir kültür şişesinde bir litre otoklavlanmış 2YT ortamı hazırlayarak başlayın. Uygun antibiyotik içeren ortamın 20 mililitresini plazmid ve pEVOL-AckRS içeren etikete sahip ko-transforme hücre stoğu ile aşılayın ve 0.6'lık bir OD elde etmek için bunları 37 santigrat derecede büyütün.

Bir litre otoklavlanmış 2YT besiyerine uygun antibiyotikler ekleyin ve 20 mililitre başlangıç kültürü ile aşılayın. 0.6, 2.8'lik bir OD elde etmek için kültürü iki ila üç saat boyunca 37 santigrat derecede büyütün. Bir milimolar IPTG,% 0.2 arabinoz ve beş milimolar AcK'lık bir son konsantrasyon için indükleyici ajanlar ve AcK ekleyin.

Kültürü altı ila sekiz saat boyunca 37 santigrat derecede büyütün. Daha sonra hücreleri 15 dakika boyunca 2.700 x g'da pelet haline getirin ve gece boyunca eksi 80 santigrat derecede saklayın. Peletleri, bir litre kültür başına 50 mililitre histon lizis tamponunda çözün ve hücreleri, bir saniye açık ve bir saniye kapalı aralıklarla üç dakika boyunca% 60 genlikte sonikleştirin.

45 dakika boyunca 41.600 x g'da pelet inklüzyon cisimleri. Süpernatanı atın ve ardından inklüzyon cisimciklerini 30 mililitre histon lizis tamponunda yeniden süspanse edin, ardından 30 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin. İnklüzyon cisimciklerini 30 mililitre pelet yıkama tamponunda tekrar askıya alın ve santrifüjlemeyi tekrarlayın.

Daha sonra, inklüzyon cisimciklerini 25 mililitre altı molar guanidin hidroklorür tamponu içinde çözün. Bir saat boyunca 37 derecede çalkalama ile inkübe edin, daha sonra 45 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı, altı molar guanidinyum hidroklorür tamponu ile dengelenmiş bir mililitre nikel-NTA reçinesi ile iki saat inkübe edin ve denatüre koşullar altında nikel-NTA saflaştırmasına devam edin.

Sütunu üç sütun hacmi yıkama tamponu ile yıkayın, ardından asetillenmiş histon proteinini 10 mililitre elüsyon tamponu ile elüte edin. Asetillenmiş histon proteinini% 5 asetik asit tamponuna karşı diyalize edin, tuzları dört santigrat derecede üç saat boyunca çıkarmak için tamponu en az altı kez değiştirin. Aliquot ve lipoliz proteini ve eksi 80 derecede süresiz olarak saklanır.

Histon protein peletleri H2A, H2B, H3 ve H4'ün alikotlarını çözün, böylece toplam 100 mikrolitre hacim için guanidinyum hidroklorür tamponunda her histon proteininden ayrı bir stok olur. Emicileri 280 nanometrede ölçerek her histon proteininin konsantrasyonunu hesaplayın. Absorbans herhangi bir protein için birden büyükse, daha doğru bir konsantrasyon elde etmek için guanidinyum hidroklorür tamponu ile seyreltin.

H2A'yı H2B ve H3'ü H4 proteinleri ile bire bir molar oranda birleştirin ve mikrolitre başına toplam dört mikrogram protein konsantrasyonuna seyreltin. Gece boyunca iki molar TE tamponuna, iki saat boyunca bir molar TE tamponuna ve beş saat boyunca 0.5 molar TE tamponuna karşı dört santigrat derecede sırayla diyalize edin. Bittiğinde, çökeltiyi çıkarmak için dört santigrat derecede 16.800 x g'de santrifüjleyin.

280 nanometrede absorbansı ölçerek histon dimerlerinin ve tetramerlerin konsantrasyonunu hesaplayın. Dimerleri ve tetramerleri bire bir molar oranda karıştırın ve sodyum klorür konsantrasyonunu 2M'ye ayarlayın. 601X TE tamponu ve katı sodyum klorür kullanarak 100 DNA'yı iki molar TE tamponuna ayarlayın.

Çözeltiyi histon oktamerine 0.85, 2.9 ila bir molar oranda ekleyin. DNA histon karışımını bir diyaliz torbasına aktarın ve dört santigrat derecede çok hafif karıştırarak yaklaşık 200 mililitre iki molar TE tamponuna yerleştirin. Peristaltik pompayı tuzsuz TE tamponuna yavaşça damlatacak şekilde ayarlayın.

Hacim kabaca iki katına çıktığında, hacmin yarısını boşaltın. Bunu en az dört kez yapın, bu da başlangıç hacmine bağlı olarak dört ila sekiz saat sürebilir. Tuz konsantrasyonu 150 milimolar'a düşürüldükten sonra, gece boyunca 20 milimolar TE tamponuna karşı diyalize girin.

Çökeltileri santrifüjleme ile çıkarın ve nükleozomların konsantrasyonunu bir plaka okuyucu ile ölçün. His-TEV proteazını ekleyin ve tüm histidin etiketlerini çıkarmak için gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ardından, nikel-NTA reçinesi aşağı çekerek nükleozom çözeltisinden histidin etiketi safsızlıklarını çıkarın.

Nükleozomu konumlandırmak ve numuneyi homojenize etmek için 60 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Nükleozomları kısa süreli olarak dört santigrat derecede saklayın. Uzun süreli depolama için, nükleozomları depolama tamponuna karşı diyalize edin ve eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Asetillenmiş tetramerlerin bazıları, %12'lik bir SDS-PAGE jeli çalıştırılarak değerlendirildiği gibi diğerlerinden daha düşük bir verime sahipti. Çekirdek bölgeye ne kadar yakın olursa, gözlemlenen verim o kadar düşük olur. Bu, büyük olasılıkla, oktamer düzeneğine müdahale eden asetilasyondan kaynaklanıyordu.

Oktamerleri 601 DNA dizisi ile birleştirdikten sonra, nükleozom %5 1X TBE'ye özgü PAGE jeli kullanılarak değerlendirilebilir ve ardından etidyum bromür ile boyanabilir. Termal konumlandırmadan önce, gözlemlenen nükleozom bantları çok geniştir ve çizgili olabilir. Bu protokolü uygularken, proteinleri her zaman buz üzerinde tutun.

Birleştirilmiş dimerleri, tetramerleri ve nükleozomu korumak çok önemlidir. Bu prosedür, araştırmacıların asetil lizin bölgelerini, özellikle mononükleozomlara yerleştirmelerine izin vererek, bir kromatin bağlamında translasyon sonrası modifikasyonları incelemek için kapıyı açtı. Herhangi bir sayıda kanonik olmayan amino asidi yerleştirmek için kolayca uyarlanabilir.