Name: Arabidopsiste Lokal ve Sistemik Yara Sinyallerinin Geniş Alan, Gerçek Zamanlı Görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Keşfedin Arabidopsis thaliana'da kalsiyum ve glutamat dinamiklerinin gerçek zamanlı görüntülenmesiyle bitki savunma mekanizmalarını. Bu yöntem, yaralanma ve stres yanıtlarındaki sistemik sinyalleşmeyi anlamak için yüksek çözünürlüklü görüntüleme sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Japonya Bilimi Destekleme Derneği'nden (17H05007 ve 18H05491) MT'ye, Ulusal Bilim Vakfı'ndan (IOS1557899 ve MCB2016177) ve Ulusal Havacılık ve Uzay İdaresi'nden (NNX14AT25G ve 80NSSC19K0126) SG'ye hibelerle desteklendi.

1. Bitki malzemesi hazırlama
<ol><li>1,5 mL mikrotüpte yüzey, GCaMP3 veya CHIB-iGluSnFR'yi ifade eden Arabidopsis thaliana (Col-0 katılım) bitkisinin tohumlarını% 20 (v/v) NaClO ile 3 dakika çalkalayarak sterilize eder ve ardından steril damıtılmış su ile 5 kez yıkayın. NOT: Arabidopsis'in GCaMP3 veya CHIB-iGluSnFR'yi ifade eden transgenik çizgileri daha öncetanımlanmıştır 6.</li>
	<li>Steril bir kaputta, 30 mL steril (otoklavlı) Murashige ve Skoog (MS) ortamı [1x MS tuzları, %1 (w/v) sakkaroz, %0,01 (w/v) miyoinositol, %0,05 (w/v) MES ve %0,5 (w/v) gellan sakız; pH 5,7 1N KOH ile ayarlanmıştır]. Kapağı değiştirin ve cerrahi bantla sarın.</li>
	<li>2 gün boyunca 4 °C'de karanlıkta inkübasyondan sonra, plakaları kullanımdan yaklaşık 2 hafta önce sürekli ışık altında (90-100 μmol m-2 s-1)bir büyüme odasına yatay olarak yerleştirin. 2 hafta sonra, arabidopsis yapraklarının sayısını en yaşlıdan en genç44'e kadar sayın (Şekil 1). Yara yanıtları tercihen hasarlı yapraktan (n) 3 ± ve n ± 56numaralı yapraklara hareket eder. NOT: Bu protokolde Petri kabı, yara ve glutamat etkilerinin floresan mikroskop altında görüntülenmesi için açılacaktır. Bu nedenle, bu deneydeki sonraki adımlar sıcaklık ve nem kontrollü oda koşullarında yapılmalıdır. Bunun nedeni, Ca2+ sinyallerinin de bu çevre koşullarındaki değişikliklerle ortaya çıkar. Ayrıca, biyosensör proteininin floresanının çıkarılması için kayıt sırasında mikroskoptan yayılan mavi ışığın, sitozolitik Ca2 + konsantrasyonu 45'in artmasına neden olabileceği ve bu nedenle bitkinin deneye başlamadan önce birkaç dakika boyunca mavi ışık ışınlanmasına alışması gerektiği bilinmektedir.</li>
</ol>2. Kimyasal preparat
<ol><li>L-Glutamat'ı sıvı büyüme ortamında çözün [1/2x MS tuzları, %1 (w/v) sakkaroz ve %0,05 (w/v) MES; pH 5.1 1N KOH ile ayarlanarak 100 mM çalışma çözümü yapın. NOT: Ca2+ dinamikleri üzerinde katyonla ilgili olası etkileri önlemek için sodyum glutamat gibi glutamat tuzlarının kullanımından kaçının.</li>
</ol>3. Mikroskop ayarı ve gerçek zamanlı görüntülemenin yapılması
<ol><li>1x objektif lens (NA = 0.156) ve bir sCMOS kamera (Şekil 2) ile donatılmış motorlu floresan stereomikroskopunu açın ve cihaz ayarlarını 470/40 nm eksitasyon ışığı ile ışınlamak ve 535/50 nm filtreden geçen bir emisyon ışığı elde etmek için yapılandırın. NOT: GCaMP3 ve iGluSnFR sinyallerini gerçek zamanlı olarak tespit etmek için GFP'ye duyarlı herhangi bir floresan mikroskobu kullanılabilir, ancak tüm tesisten sinyal almak için düşük güçlü objektif lens ve geniş bir sCMOS çipine sahip son derece hassas bir kamera önerilir. Düşük güç hedefi, tüm arabidopsis tesisinin tepkisinin görüntülenmesini sağlar ve son derece hassas bir kameranın kullanılması, yara tetiklenen Ca2+ dalgasının hızlı zaman akışını yakalamak için gereken hızlı veri alımını sağlar. Bu çalışmada kullanılan floresan mikroskop için görüş alanının ve zamansal çözünürlüğün maksimum değerleri sırasıyla 3 cm x 3 cm ve saniyede 30 karedir (fps).</li>
	<li>Kapağı çıkarın ve kabı objektif merceğin altına yerleştirin.</li>
	<li>Bitkiden gelen floresan sinyalini kontrol edin ve bitkiler yeni çevre koşullarına adapte olana kadar karanlıkta yaklaşık 30 dakika bekleyin. Bu adaptasyon adımı gereklidir, çünkü nemdeki değişiklikler, yarayla ilgili olaylara müdahale edebilecek bitkilerde [Ca2+]sit yükselmesini sağlar.</li>
	<li>Tüm bitkiyi görüş alanında görmek için odağı ve büyütmeyi ayarlayın. Mevcut protokolde 0.63x büyütme kullanıldı.</li>
	<li>Gerçek zamanlı görüntülemeye başlamadan önce, mikroskop görüntüleme yazılımını kullanarak floresan sinyallerini algılamak için alma parametrelerini ayarlayın. Geçerli protokoldeki görüntüleme ayarları şunlardır: pozlama ve aralık süreleri sırasıyla 1,8 s ve 2 s (yani 0,5 fps) olarak ayarlanır. Kayıt süresini 11 dakika olarak ayarlayın.</li>
	<li>Bitkiyi mikroskoptan mavi ışık ışınlamasıyla uyumlulaştırma denemesine başlamadan önce 5 dakika boyunca görüntü, ardından Şimdi Çalıştır'a veya kullanılan mikroskop yazılımındaki eşdeğer komuta tıklayarak kayda başlayın. Ortalama taban çizgisi floresanını belirlemek için, yaralama veya glutamat uygulamasından önce en az 10 kare (yani, mevcut protokolde en az 20 s) kaydedin (bkz. Bölüm 4).<ol>
<li>Yara kaynaklı [Ca2+]cyt ve [Glu]apo değişikliklerinin gerçek zamanlı görüntülenmesi için, yaprak L1'in yaprak veya orta bölgesini makasla kesin (Şekil 3 ve Şekil 4).</li>
		<li>Glutamat tetiklenen [Ca2+] cyt değişikliklerinin gerçek zamanlıgörüntülenmesi için, ana damar boyunca yaprak 1'in kenarını (ucundan yaklaşık 1 mm) makasla kesin. En az 20 dakikalık iyileşme süresinden sonra, yaprağın kesme yüzeyine 10 μL 100 mM glutamat uygulayın (Şekil 5). NOT: Bu ön kesim, tepkileri tetiklemek için yaprak apoplastlarına glutamat erişimine izin vermek için gerekliydi. Ek olarak, yaprak L1'in kesilmiş yüzeyine bir damla damıtılmış su uygulanmasının, glutamat uygulamadan önce numunelerin geri kazanım sırasında kurumasını önlemek için kritik olduğu bulunmuştur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>11 dakikalık kaydı bitirdikten sonra verileri kaydedin.</li>
</ol>4. Veri analizi
<ol><li>Zaman içinde floresan yoğunluğu analizi için, floresan yoğunluğunun analiz edilmesi gereken yerde bir ilgi alanı (ROI) tanımlayın (Şekil 6 ve Şekil 7). Ca2+ dalgasının hız hesaplaması için analiz için 2 ROI (ROI1 ve ROI2) tanımlayın. Görüntüleme yazılımında, Zaman Ölçümü | | tanımla Daire çizin. Ek Açıklamalar ve Ölçüm | tıklayarak YATıRıM YTM'leri ile yatırım getirisi arasındaki mesafeyi ölçme Uzunluk | Basit Çizgi (Şekil 6).</li>
	<li>Ölçü 'ye tıklayarak zaman içinde her yatırım getirislerindeki ham floresan değerlerini (F) ölçün. Excel'e Her Şey'e | 'ye tıklayarak floresan sinyalini her zaman noktasında sayıya dönüştürmek için ham verileri bir elektronik tablo yazılımına dışa aktarma Dışa aktarma.</li>
	<li>Kaydedilen verilerdeki ilk10karenin (yani tedaviden önce) üzerindeki F ortalamasını hesaplayarak, F 0 olarak tanımlanan temel floresan değerini belirleyin.</li>
	<li>ΔF/ F = (F−F 0 ) / F 0 denklemini kullanarakFverilerini normalleştirin(ΔF/F ) ΔF floresandaki zamana bağlı değişikliktir.</li>
	<li>Ca2+ dalga hızı dalga analizi için, istatistiksel yazılım kullanılarak F0 verilerinden hesaplanan standart sapma(2x SD) × 2'ye yükselme kriterini kullanarak her yatırım getirisinde(t1 ve t2)ca 2+ artışının algılanmasını temsil eden önceden uyarılmış değerlerin üzerinde önemli bir sinyal yükselme noktası tanımlayın. F0 verilerinin %95'i ortalamadan 2x SD'ye düşüyor ve bu da sinyalde şans eseri bu seviyenin üzerinde bir yükselişin %≤5 olduğunu gösteriyor. Roi1 veROI2 arasındaki Ca 2+ artışının zaman farkını hesaplayın [t2- t1 zaman gecikmesi (Δt)] ve ROI1 ile ROI2 arasındaki mesafeyi ölçün, ardından herhangi bir Ca2+ dalgasının hızlarını belirleyin.</li>
</ol>

Yazarların herhangi bir çıkar çatışması yok.

Sistemik sinyalizasyon, bitkilerin lokalize dış çevresel uyaranlara yanıt vermesi ve daha sonra homeostazlarını tüm bitki seviyesinde tutması için önemlidir. Hayvanlar gibi gelişmiş bir sinir sistemi ile donatılamasalar da, mobil elektrik (ve muhtemelen hidrolik) sinyalleri ve ROS ve Ca2+ 46,47dalgalarının yayılması gibi faktörlere dayanarak hem organlar içinde hem de organlar arasında hızlı iletişim sağlarlar. Yukarıda açıklanan protokol, ca2+</s...

Bitkiler biyotik streslerden kaçamazlar, örneğin, onları besleyen böcekler, bu nedenle otçul1gibi zorlukları tespit etmek ve daha sonra kendilerini korumak için sofistike stres algılama ve sinyal dönüştürme sistemleri geliştirmişlerdir. Yaralanma veya otçul saldırısı üzerine, bitkiler sadece yaralı bölgede değil, aynı zamanda hasarsız distal organlarda fitohormone jasmonik asit (JA) birikimi de dahil olmak üzere hızlı savunma yanıtları başlatır2. Bu JA daha sonra hem doğrudan hasar görmüş dokularda savunma tepkilerini tetikler hem de bitkinin hasarsız kısımlarında savunmayı önceden tetikler. Arabidopsis'te, yaralanma ile indüklenen JA birikimi, tesisin başka bir yerindeki hasardan sadece birkaç dakika içinde distal, bozulmamış yapraklarda tespit edildi ve yaralı yaprak3'tenhızlı ve uzun mesafeli bir sinyal iletildiğini düşündürdü. Ca2+, reaktif oksijen türleri (ROS) ve elektrik sinyalleri gibi çeşitli adayların,4,5bitkilerinde bu uzun mesafeli yara sinyalleri olarak hizmet etmesi önerilmiştir.
Ca2+, ökaryotik organizmalardaki en çok yönlü ve her yerde bulunan ikinci haberci elementlerden biridir. Bitkilerde, tırtıl çiğneme ve mekanik yaralama, hem yaralı yaprakta hem de çözülmemiş uzak yapraklarda sitozolik Ca2 + konsantrasyonunda ([Ca2+]sitot)sert artışlara neden olur6,7. Bu sistemik Ca2+ sinyali, JA biyosentez 8,9dahil olmak üzere aşağı akış savunma sinyal yollarının aktivasyonuna yol açan hücre içi Ca2+algılama proteinleri tarafından alınır. Ca2+ sinyallerinin bitki yarası yanıtlarındaki önemini destekleyen çok sayıda rapora rağmen, yaranın neden olduğu Ca2+ sinyallerinin mekansal ve zamansal özellikleri hakkında bilgi sınırlıdır.
Genetik olarak kodlanmış Ca2+ göstergeleri kullanılarak gerçek zamanlı görüntüleme, Ca2+ sinyallerinin uzamsal ve zamansal dinamiklerini izlemek ve ölçmek için güçlü bir araçtır. Bugüne kadar, bu tür sensörlerin tek bir hücre düzeyinde Ca2 + sinyallerinin dokulara, organlara ve hatta tüm bitkilere görselleştirilmesini sağlayan versiyonları geliştirilmiştir10. Bitkilerde kullanılan Ca2+ için genetik olarak kodlanmış ilk biyosensör, Aequorea victoria11denizanasından elde edilen biyolüminesan protein aequorin idi. Bu chemiluminescentprotein bitkiler12, 13 ,14 , 15,16,17,18çeşitli streslere yanıt Ca 2 + değişiklikleri tespit etmek için kullanılmış olsa da, ürettiği son derece düşük lüminesan sinyal nedeniyle gerçek zamanlı görüntüleme için uygun değildir. Sarı kameripler gibi Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) tabanlı Ca2+ göstergeleri de19, 20 , 21, 22,23,24 tesislerinde bir dizi Ca2+sinyal olayının dinamiklerini araştırmak için başarıyla kullanılmıştır. Bu sensörler görüntüleme yaklaşımlarıyla uyumludur ve en yaygın olarak, tümü iki florofor proteini, genellikle bir Siyan Floresan Proteini (CFP) ve Sarı Floresan Protein varyantı (YFP)10arasında kaynaşmış bir miyosin ışık zinciri kinazından Ca2+ bağlayıcı protein calmodulin (CaM) ve bir CaM bağlayıcı peptitten (M13) oluşur. Ca2+ bağlama, CaM ve M13 arasındaki etkileşimi teşvik eder ve sensörün konformasyonsal olarak değiştirilmesine neden olabilir. Bu değişiklik CFP ve YFP arasında enerji transferini teşvik eder, bu da CFP'den floresan emisyonunu azaltırken YFP'nin floresan yoğunluğunu arttırır. CfP'den YFP floresansına bu geçişin izlenmesi, Ca2+ seviyesindeki artışın bir ölçüsünü sağlar. Bu FRET sensörlerine ek olarak, GCaMP ve R-GECO gibi tek floresan protein (FP) bazlı Ca2+ biyosensörleri de bitki görüntüleme yaklaşımlarıyla uyumludur ve yüksek hassasiyetleri ve kullanım kolaylığı nedeniyle [Ca2+]cyt değişikliklerini incelemek için yaygın olarak kullanılır25 , 26,27,28,29,30. GCAMP'ler, yine CaM ve M13 peptidi ile kaynaşmış tek bir dairesel permütasyonlu (cp) GFP içerir. CaM ve M13 arasındaki Ca2+bağımlı etkileşim, sensörde cpGFP'nin protonasyon durumunda bir kaymayı teşvik eden ve floresan sinyalini artıran konformasyonsal bir değişikliğe neden olur. Böylece, Ca2+ seviyeleri yükseldikçe, cpGFP sinyali artar.
Mekanik yaralama veya otçul beslemeye yanıt olarak üretilen Ca2+ sinyallerinin dinamiklerini araştırmak için, bir GCaMP varyantı olan GCaMP3 ve geniş alan floresan mikroskobu6'yıifade eden transgenik Arabidopsis thaliana bitkilerini kullandık. Bu yaklaşım, bir yapraktaki yara bölgesinden tüm bitkiye uzun mesafeli bir Ca2+ sinyalinin hızlı iletimini görselleştirmeyi başarmıştır. Böylece, yara bölgesinde hemen [Ca2+cyt'de bir artış tespit edildi, ancak bu Ca2+ sinyali daha sonra yaralandıktan birkaç dakika sonra damar yoluyla komşu yapraklara yayılmıştır. Ayrıca, bu hızlı sistemik yara sinyalinin iletiminin Arabidopsis tesislerinde glutamat reseptör benzeri iki gen, Glutamat Reseptör Gibi (GLR ), GLR3.3ve GLR3.6 6mutasyonları ile kaldırıldığını bulduk. GSR'ler, yara yanıtı 3 , polen tüpü büyümesi 31 , kök gelişimi32, soğuk tepki 33 ve doğuştan gelen bağışıklık34dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik süreçlerde yer alan amino asit kapılı Ca2+kanalları olarak işlev görür. BGLR'ların bu iyi anlaşılan, geniş fizyolojik işlevine rağmen, ligand özgüllükleri, iyon seçicilikleri ve hücre altı lokalizasyonları gibi işlevsel özellikleri hakkında bilgiler sınırlıdır35. Bununla birlikte, son çalışmalar sırasıyla phloem ve ksilenm'de GLR3.3 ve GLR3.6'nın lokalize olduğunu bildirmektedir. Bitki GSR'leri, memeli sinir sisteminde glutamat, glisin ve D-serine gibi amino asitler tarafından aktive edilenmemelilerde iyonotropik glutamat reseptörleri (iGluR) 36 ile benzerliklere sahiptir37. Gerçekten de, yara bölgesinde 100 mM glutamat uygulanmasının, ancak diğer amino asitlerin, Arabidopsis'tehızlı, uzun mesafeli bir Ca2 + sinyaline neden olduğunu gösterdik Hücre dışı glutamatın muhtemelen bitkilerde bir yara sinyali görevi aldığını gösteren6. Bu yanıt,glutamatın bu reseptör benzeri kanallardan biri veya her ikisinde de etki ediyor olabileceğini öne sürenglr3.3 / glr3.6 mutantında kaldırılmıştır ve gerçekten de, AtGLR3.6'nın yakın zamanda bu glutamat seviyeleri tarafından kapılı olduğu gösterilmiştir38.
Bitkilerde, yapısal bir amino asit olarak rolüne ek olarak, glutamat da önemli bir gelişim düzenleyici olarak önerilmiştir39; ancak mekansal ve zamansal dinamikleri yeneksin anlaşılamamıştır. Tıpkı Ca2+için olduğu gibi, bu amino asidin canlı hücrelerdeki dinamiklerini izlemek için glutamat için genetik olarak kodlanmış birkaç gösterge geliştirilmiştir40,41. iGluSnFR, cpGFP ve Escherichia coli 42,43'tenbir glutamat bağlayıcı proteinden (GltI) oluşan GFP tabanlı tek FP glutamat biyosensördür. GltI'ye glutamat bağlanmasıyla indüklenen iGluSnFR'nin konformasyonsal değişimi, gelişmiş bir GFP floresan emisyonu ile sonuçlanır. Hücre dışı glutamatın bitki yarası yanıtında bir sinyal molekülü olarak etki edip etmediğini araştırmak için, bu biyosensörü apoplastik alanda lokalize etmek için iGluSnFR dizisini temel kitine sinyal peptid salgılama dizisi (CHIB-iGluSnFR) ile bağladık6. Bu yaklaşım, bu sensörü ifade eden transgenik Arabidopsis bitkileri kullanılarak apoplastik glutamat konsantrasyonundaki ([Glu]apo)herhangi bir değişikliğin görüntülenmesini sağladı. Yara sahasında iGluSnFR sinyalinde hızlı artışlar tespit ettik. Bu veriler, glutamanın hasarlı hücrelerden/ dokulardan yaralanarak apoplast'a sızdırdığı ve GGLR'leri aktive eden ve bitkilerde uzun mesafeli Ca2+ sinyaline yol açan bir hasar sinyali görevi gördüğü fikrini destekler6.
Burada, uzun mesafeli Ca2+ ve hücre dışı glutamat sinyallerinin dinamiklerini izlemek ve analiz etmek için genetik olarak kodlanmış biyosensörler kullanarak bitki çapında gerçek zamanlı görüntüleme yöntemini açıklıyoruz6. Genetik olarak kodlanmış biyosensörleri ifade eden geniş alan floresan mikroskopisi ve transgenik bitkilerin mevcudiyeti, Ca2+ dalgaları gibi hızla iletilen uzun mesafe sinyallerini tespit etmek için güçlü, ancak kolayca uygulanan bir yaklaşım sağlar.

<table><tbody><tr><td>Arabidopsis expressing GCaMP3</td><td>Saitama University</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arabidopsis expressing CHIB-iGluSnFR</td><td>Saitama Üniversitesi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 7</td><td>GraphPad Yazılımı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamat</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>072-00501</td><td>Sıvı bir büyüme ortamında çözülür [1/2x MS tuzları,% 1 (a / h) sükroz ve% 0.05 (a / h) MES; pH 5.1, 1N KOH ile ayarlanır].</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige ve Skoog (MS) ortamı</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>392-00591</td><td>bileşimi: 1x MS tuzları, %1 (a/a) sükroz, %0,01 (a/h) miyoinositol, %0,05 (a/h) MES ve %0,5 (a/h) gellan zamkı; pH 5.7, 1N KOH ile ayarlanmıştır.</td></tr><tr><td>Nikon SMZ25 stereomikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements AR analizi</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x objektif lens (P2-SHR PLAN APO)</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sCMOS kamera (ORCA-Flash4.0 V2)</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-22CU</td><td></td></tr><tr><td>Kare plastik Petri kabı</td><td>Simport</td><td>D210-16</td><td></td></tr></tbody></table>

arabidopsis'te lokal ve sistemik yara sinyallerinin geniş alan, gerçek zamanlı görüntülenmesi

Wide-Field, Real-Time Imaging of Local and Systemic Wound Signals in Arabidopsis

Bitkiler, hem hasarlı hem de distal hasarsız kısımlarda savunma tepkileri vererek yaralama ve otçulluk gibi mekanik streslere yanıt verir. Bir yaprağın yaralanması üzerine, yara bölgesinde sitozolik kalsiyum iyon konsantrasyonunda (Ca2+ sinyali) bir artış meydana gelir. Bu sinyal, savunma yanıtlarının etkinleştirildiği hasarsız yapraklara hızla iletilir. Son araştırmalarımız, yaprağın yaralı hücrelerinden etrafdaki apoplast içine sızan glutamatın yara sinyali görevi aldığını ortaya koydu. Bu glutamat glutamat reseptörü benzeri Ca2+ geçirgen kanalları aktive eder ve bu da bitki genelinde uzun mesafeli Ca2+ sinyal yayılmasına yol açar. Bu olayların mekansal ve zamansal özellikleri, genetik olarak kodlanmış floresan biyosensörleri ifade eden canlı bitkilerin gerçek zamanlı görüntülenmesiyle yakalanabilir. Burada, hem Ca2+ sinyallerinin dinamiklerini hem de yara almaya yanıt olarak meydana gelen apoplastik glutamazdaki değişiklikleri izlemek için bitki çapında, gerçek zamanlı bir görüntüleme yöntemi sunuyoruz. Bu yaklaşım, Yeşil Floresan Protein (GFP) bazlı Ca2+ ve glutamat biyosensörlerini ifade eden geniş alan floresan mikroskobu ve transgenik Arabidopsis bitkilerini kullanır. Buna ek olarak, yara kaynaklı, glutamat tetiklenen hızlı ve uzun mesafeli Ca2+ sinyal yayılımını kolayca ortaya çıkarmak için metodoloji sunuyoruz. Bu protokol, tesis sistemik sinyalinin sinyal ve yanıt ağlarında nasıl yer aldığını araştırmaya yardımcı olmak için diğer bitki stresleri üzerindeki çalışmalara da uygulanabilir.

[Ca2+]cyt ve [Glu]apo'nun yaralamaya yanıt olarak sinyal yayılması Şekil 3, Şekil 4, Film S1ve Film S2'de sunulmuştur. GCaMP3'i ifade eden bitkilerde yaprak 1'in yaprak sapını kesmek (0 s'de), vaskültür (40 s'de)(Şekil 3 ve Film S1)yoluyla lokal olarak hızla indüklenen [Ca2+]sitosunda önemli bir ...

Hücre dışı glutamat tetiklenen sistemik kalsiyum sinyali, bitkilerde mekanik yaralama ve otobur saldırısına karşı bitki savunma yanıtlarının indüksiyonu için kritik öneme sahiptir. Bu makalede, kalsiyum ve glutamaca duyarlı floresan biyosensörleri ifade eden Arabidopsis thaliana bitkilerini kullanarak her iki faktörün de mekansal ve zamansal dinamiklerini görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Arabidopsis'te Lokal ve Sistemik Yara Sinyallerinin Geniş Alan, Gerçek Zamanlı Görüntülenmesi

Plants respond to mechanical stresses such as wounding and herbivory by inducing defense responses both in the damaged and in the distal undamaged parts. ...

Bu protokol, yara almaya yanıt olarak kalsiyum ve apoplastik glutamanın dinamiklerini izleyerek bitki sistemik sinyal sisteminin aktivitesinin bitki çapında gerçek zamanlı görüntülenmesini sağlar. Bu tesis çapında gerçek zamanlı görüntüleme yöntemi, bitkilerdeki hızlı ve uzun mesafe sinyallerinin dinamiklerini anlamak için sağlam bir araç sunarak yüksek uzamsal zamansal çözünürlüğü ve kullanım kolaylığını birleştirir. Bu protokol, diğer bitki türlerinde hem biyotik hem de abiyotik stres yanıtlarında sistem kalsiyum sinyalinin mekansal ve zamansal özellikleri hakkında yeni bir fikir verme potansiyeli sunmaktadır.Prosedürü gösteren takuya Uemura olacak, laboratuvarımdan doktora sonrası. 1X objektif lens ve sCMOS kamera ile donatılmış motorlu floresan stereo mikroskobu açarak başlayın. Cihaz ayarlarını, 450 ila 490 nanometre arasında ışık ileten bir filtre kullanılarak seçilen 470 nanometre merkezli uyarım ışığıyla ışınlamak için yapılandırın.510 ila 560 nanometre arasında iletim yapan bir filtre kullanarak emisyon ışığı alın. Kapağı bitkiyi içeren tabaktan çıkarın ve objektif merceğin altına yerleştirin. Bitkiden gelen floresan sinyalini kontrol edin.Daha sonra bitkiler yeni çevre koşullarına adapte olana kadar karanlıkta yaklaşık 30 dakika bekleyin. Tüm bitkiyi görüş alanında görmek için odağı ve büyütmeyi ayarlayın. Ardından, mikroskop görüntüleme yazılımını kullanarak floresan sinyallerini algılamak için alma parametrelerini ayarlayın.Kayıt süresini 11 dakika olarak ayarlayın. Bitkiyi mikroskoptan mavi ışık ışınlaması için alıştırmaya başlamadan önce beş dakika boyunca görüntü, sonra kayda başlayın. Ortalama taban çizgisi floresan kaydını, yara veya glutamat uygulamasından en az 10 kare önce belirlemek.Yara kaynaklı sitozolitik kalsiyum iyonunun ve apoplastik glutamat konsantrasyon değişikliklerinin gerçek zamanlı görüntülenmesi için, yaprak L1'in petiole veya orta bölgesini makasla kesin. Glutamatın gerçek zamanlı görüntülenmesi için sitozolitik kalsiyum değişikliklerini tetikledi, ana damar boyunca L1 yaprağının ucundan makasla yaklaşık bir milimetre kesin. En az 20 dakika sonra yaprağın kesilmiş yüzeyine 10 milimolar glutamat 10 mikrolitre uygulayın.Zaman içinde floresan yoğunluğu analizi için, floresan yoğunluğunun analiz edilmesi gereken yerde ilgi çekici bir bölge tanımlayın. Kalsiyum dalgasının hız hesaplaması için iki ROI tanımlayın. Görüntüleme yazılımında zaman ölçümüne tıklayın, tanımlayın ve daire içine edin.Ek açıklamalar ve ölçüm, uzunluk ve basit çizgiye tıklayarak iki bölge arasındaki mesafeyi ölçün. Ölçüye tıklayarak zaman içinde her yatırım getirislerindeki ham floresan değerlerini ölçün, ardından floresan sinyalini her zaman noktasında sayılara dönüştürmek için ham verileri elektronik tablo yazılımına dışa aktarın. Kaydedilen verilerdeki ilk 10 karenin ortalama F değerini hesaplayarak F sıfır olarak ilahi olan temel floresan değerini belirleyin, ardından metin el yazmasında açıklandığı gibi F verilerini normalleştirin.Kalsiyum hızı dalga analizi için, önceden uyarılmış değerlerin üzerinde önemli bir sinyal yükselme noktasını, her yatırım getirisinde bir kalsiyum artışının tespitini temsil eden olarak tanımlayın. Herhangi bir kalsiyum dalgasının hızlarını belirlemek için iki ROI arasındaki kalsiyum artışındaki zaman farkını ve aralarındaki mesafeyi hesaplayın. Sitozolitik kalsiyum iyon ve apoplastik glutamat konsantrasyonlarında yara ile tetiklenen bir değişikliğin yayılması burada gösterilmiştir.GCaMP-3'i ifade eden bitkilerde bir yaprağın yaprak sapını kesmek kalsiyumda önemli bir artışa yol açtı. Lokal olarak indüklendi ve daha sonra vaskülat boyunca yayıldı. Sinyal birkaç dakika içinde komşu yapraklara hızla yayılmış.Bir yaprak ve temel chitinase I tutkal koklayıcı ifade eden bitkiler kesildikten sonra, kesilen bölge çevresinde hızlı bir apoplastik glutamat artışı gözlendi. Birkaç dakika içinde, sinyal de vaskülatörden yayılır. Glutamat uygulaması ile tetiklenen kalsiyum sinyal yayılımının gerçek zamanlı görüntülenmesi için, CCaMP-3'ü ifade eden bitkilerdeki bir yaprağın kenarı kesildi.Bu, lokal sitosoleik kalsiyum iyon konsantrasyonu artışına neden oldu, ancak sinyal birkaç dakika içinde kayboldu. Yaklaşık 10 dakika sonra, kesilen yüzeye glutamat uygulandı ve sitosolik kalsiyum konsantrasyonunda hızlı bir lokal artışa ve daha sonra bu sinyalin distal yapraklara yayılmasına neden oldu. Sistemik yapraktaki yaranın neden olduğu katı kalsiyum konsantrasyonu içindeki değişiklikleri ölçmek için, GCaMP-3 sinyal yoğunluğunun zaman seyri değişimi iki ilgi çekici bölgede ölçüldü.Mekanik hasara yanıt olarak apoplastik glutamat konsantrasyon değişiklikleri de ölçüldü. Glutamat izi, yaralandıktan yaklaşık 100 saniye sonra tek bir tepe noktası sergiledi. Bu deney sıcaklık ve nem kontrollü koşullar altında yapılmalıdır, çünkü bu çevre koşullarındaki değişikliklerle yükselmektedir.Bu protokol, laboratuvar sinyal sisteminin arızalı ve putatif elemanlarının mutantlar kullanarak uzun mesafeli sinyalizasyonun altında kalan moleküler mekanizmalar hakkında içgörüler sağlama potansiyeli sunar.

wide-field-real-time-imaging-local-systemic-wound-signals

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz perfluorodecalin infiltratif montaj aracı olarak kullanımı açıklanmaktadır. Bu görüntüleme derinliğini artırmak için basit bir yöntem.

Görüntüleme için Basit Bir Yöntem Arabidopsis Infiltratif Görüntüleme Orta Perfluorodecalin kullanarak bırakır.

Bu makale RootChip içinde Arabidopsis fide ekimi için bir protokol, mikroskobik kök izleme ve hücre içi metabolit düzeylerinin FRET tabanlı ölçümü ile büyüme koşullarını otomatik kontrol birleştiren bir mikroakışkan görüntüleme platform sağlar.

RootChip kullanarak Kök Çevre Rapid manipülasyonu ile Arabidopsis Kök Büyüme Time-lapse Floresans Görüntüleme

Biz stoma farklılaşma belgeleyen, gelişme birkaç gün içinde epidermis konfokal görüntüleme için bitki kotiledon hareketsiz odası slaytlar ve medya kullanarak bir protokol açıklar. Fluorofor etiketli proteinlerin hücre bölünmesi ve hücre tipi farklılaşması esnasında olası rollerini anlamayı arttırıyor, ifade ve hücre içi lokalizasyonu dinamik izlenebilir.

Uzun süreli, yüksek çözünürlüklü Konfokal Time Lapse Görüntüleme<em&gt; Arabidopsis Kotiledon</emÇimlenme sırasında&gt; Epidermis

Çok geç evre Drosophila embriyoların embriyonik epidermis hızlı lastik yara cevap analizi için bir in vivo sistemi sağlar ve memeli modelleri tercüme için, yara iyileşmesi çalışmalar ilerlemek için genetik manipülasyon ya da mikro-enjeksiyon kimyasal tedaviler ile kombine edilebilir.

Mikroenjeksiyon Yara Deneyi ve<em&gt; In vivo</em&gt; Epidermal lokalizasyonu Tepki Gazeteciler Yara<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar.

Bu protokol, ticari olarak temin edilebilen düz yataklı tarayıcı kullanılarak bir yerçekimi uyarana yanıt Arabidopsis fide görüntülerin hızla toplanması için bir işlemi tarif etmektedir. Yöntem aşağı analiz algoritmaları için mükellef yüksek çözünürlüklü görüntüleri, ucuz, yüksek hacimli yakalamak için izin verir.

Arabidopsis Kök Gravitropic Müdahale Yüksek çözünürlüklü Zaman lapsed Resim Toplama Masaüstü Tarayıcılar kullanma

Ca 2 + sinyalizasyon tesislerinde çeşitli biyolojik süreçleri düzenler. Burada mekansal ve zamansal Ca kaynaklı abiyotik stres izlemek için yaklaşımlar sunmak Arabidopsis hücre ve genetik olarak kodlanmış Ca 2 + göstergeleri Aequorin veya Case12 kullanarak dokularda 2+ sinyaller.

Ölçme Mekansal ve zamansal Ca 2+ Sinyalleri

Bu protokolün amacı stoma kompleksinin hücre korteks içinde, GFP etiketli PATROL1, bir membran kaçakçılığı protein noktalar yanıp sönen gösteren değişken açılı Epifloresans mikroskobu ile bitki hücre yüzeylerinde floresan etiketli protein dinamikleri izlemek için nasıl göstermek için Arabidopsis thaliana.

Değişken açılı Epifloresans Mikroskopi ile Bitki Hücre Yüzey Dynamics Gerçek zamanlı Görüntüleme

Canlı konfokal görüntüleme gelişimini incelemek için güçlü bir araç biyologlara sağlar. Burada, Arabidopsis çiçek gelişmekte canlı konfokal görüntüleme için ayrıntılı bir protokol mevcut.

Arabidopsis Çiçek Gelişmekte Konfokal Görüntüleme Canlı

Bu iletişim kuralı hemipteran böcekler, yaprak bitleri gibi besleme tarafından üretilen bitkilerde kalsiyum sinyalleri analiz etmek için basit bir yöntem özetliyor. GFP kalsiyum Biyoalgılayıcı GCaMP3 ile dönüştürülmüş Arabidopsis thaliana kalsiyum dinamiği yüksek zamansal ve mekansal çözünürlüğü ile gerçek zamanlı vivo içinde görüntüleme için izin verir.

Floresan Biyoalgılayıcı kullanarak böcek besleme sırasında gerçek zamanlı Vivo kayıt Arabidopsis kalsiyum sinyallerin

Bir plazma membran reseptörü kinazının membran kaçakçılığı olaylarını incelemek için burada yaygın olarak kullanılan birkaç yöntem tanıtılmaktadır. Bu yazıda bitki materyali hazırlama, farmakolojik tedavi ve konfokal görüntüleme kurulumu dahil olmak üzere ayrıntılı protokoller açıklanmaktadır.

Stoma Soy Hücrelerinde Membran Kaçakçılığı Olaylarını İncelemek için Görüntü Tabanlı Yöntemler

Burada, Arabidopsis thaliana'da bakteri istilasına karşı stoma yanıtlarının doğrudan gözlemlenmesi ve otomatik ölçümü için basit bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, cihaz tarafından yakalanan yaprak görüntüleri için tasarlanmış bir görüntü analizi boru hattı ile birlikte taşınabilir bir stoma görüntüleme cihazından yararlanır.

Pseudomonas syringae pv'ye Stoma Yanıtlarının Doğrudan Gözlemi ve Otomatik Ölçümü. domates DC3000 içinde Arabidopsis thaliana

Keşfedin Arabidopsis thaliana'da kalsiyum ve glutamat dinamiklerinin gerçek zamanlı görüntülenmesiyle bitki savunma mekanizmalarını. Bu yöntem, yaralanma ve stres yanıtlarındaki sistemik sinyalleşmeyi anlamak için yüksek çözünürlüklü görüntüleme sunar.

Arabidopsis'te Lokal ve Sistemik Yara Sinyallerinin Geniş Alan, Gerçek Zamanlı Görüntülenmesi

Daha fazla video keşfet