Solunum Virüsü Enfeksiyonu Sırasında Doğuştan İmmün Hücre Aktivasyonunun İncelenmesi için Temassız Ko-Kültür Modeli
28 Şubat 2021
Bu protokol, viral olarak enfekte olmuş nazal epitel hücreleri ile doğuştan gelen hücre aktivasyonu arasındaki erken etkileşimlerin araştırılmasını detaylandırır. Bağışıklık hücrelerinin bireysel alt kümeleri, viral enfeksiyonlara yanıt olarak aktivasyonlarına göre ayırt edilebilir. Daha sonra erken antiviral yanıtlar üzerindeki etkilerini belirlemek için daha fazla araştırılabilirler.
Bu protokol, epitel hücrelerinin ve birinci basamak doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin, özellikle de doğuştan gelen T hücrelerinin çapraz konuşmasını araştırmak için tasarlanmıştır. İnsan kaynaklarından birincil hücreler bu teknikte kullanılır ve insanlarda olanlarla ilgili fizyolojik çapraz konuşmanın bireysel olarak araştırılmasına izin verir. Doğuştan gelen T hücreleri, influenza ile enfekte hastaların sağkalımını iyileştirmede rol oynamıştır.
Nasıl aktive olduklarını bilmek, anti-influenza ve antiviral tedavinin geliştirilmesinde yardımcı olabilir. Bu yöntem, doğuştan gelen T hücrelerini aktive edebilen faktörleri tanımlamak için tasarlanmıştır ve bu da solunum virüsü enfeksiyonuna karşı önleyici tedbirlerin geliştirilmesine yardımcı olabilir. Sıfır gününde, insan burun epitel hücrelerini veya HNEC'leri enfekte edin.
İlk olarak, membran ekinin apikal odasına 150 mikrolitre 1x tripsin EDTA ve temsilci kuyucuğun bazal odasına 350 mikrolitre 1x tripsin EDTA ekleyerek hücreleri sayın. Hücreleri 10 dakika boyunca veya hücreler zardan ayrılana kadar 37 santigrat derecede inkübe edin. Membran üzerindeki hücreleri yukarı ve aşağı pipetleyerek yıkayın ve süspansiyonu 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpünde toplayın.
Tripsin aktivitesini söndürmek için 200 mikrolitre DMEM ekleyin. Ardından, tripan mavisi boyama yoluyla hücreleri sayın. Kuyucuk başına düşen hücre sayısına bağlı olarak virüsün gerekli enfeksiyon çokluğunu veya MOI'sini hesaplayın.
Virüs stoğunu buz üzerinde tam RPMI ile buna göre seyreltin. Enfeksiyon deneyi için kalan kuyucuklar için, membran eklerinin apikal odalarına bir adet 1x DPBS ekleyin. 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin ve 1x DPBS'yi çıkarın.
Membran uçlarındaki bazal ortamı, uçları kuyucuklara tam RPMI eklenmiş yeni bir plakaya aktararak RPMI ortamını tamamlamak için değiştirin. Hazırlanan virüs inokulunumu, membran ekinin apikal odasına ekleyin. Bir saat boyunca% 5'lik bir karbondioksit atmosferinde 35 santigrat derecede inkübe edin ve viral inokulumu apikal odadan çıkarın.
Membran ekinin bazal ortamını taze RPMI ortamına değiştirin ve 24 ila 72 saat boyunca% 5'lik bir karbondioksit atmosferinde 35 santigrat derecede inkübe edin. PBMC süspansiyonunu doğrudan enfekte olmuş HNEC'lerin her bir kuyucuğunun bazal odasına sıfır gününden itibaren ekleyerek gerekli sayıda periferik kan mononükleer hücresini veya PBMC'yi tam RPMI ortamında tohumlayın. 24 ila 48 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Apikal süpernatanı toplamak için, her apikal odaya 1x DBPS ekleyin ve 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ardından, DPBS'yi 1,5 mililitrelik tüplerde toplayın. Plak tahlili için süpernatant Aliquot yeni bir 1.5 mililitrelik tüp içinde ve hemen hem stoğu hem de alikotları eksi 80 santigrat derecede dondurun.
RNA formundaki HNEC'leri toplamak için, membran ekini temiz bir kuyucuğa aktarın. Apikal odaya RNA lizis tamponu ekleyin ve beş dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Süpernatantı 1.5 mililitrelik bir santrifüj tüpünde toplayın ve moleküler analiz için RNA ekstraksiyonuna kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.
Son olarak, kuyu yüzeyine yapışmış olabilecek aktif PBMC'leri yerinden çıkarmak için kuyunun yüzeyini steril bir pipet ucunun geniş tabanıyla nazikçe kazıyarak PBMC'leri hasat edin. PBMC'leri içeren bazal ortamı iki mililitrelik bir santrifüj tüpünde toplayın. Kuyucukları 300 mikrolitre 1x DPBS ile iki kez yıkayın ve yıkamayı aynı iki mililitrelik tüpte toplayın.
İki mililitrelik tüpü santrifüj edin ve süpernatantı hücre peletini rahatsız etmeden taze iki mililitrelik bir tüpte toplayın. Aspire edilen süpernatantı sitokin ve kemokin analizi için eksi 80 santigrat derecede saklayın. Kalan hücre peletini 200 mikrolitre 1x DPBS içinde yeniden askıya alın.
Bu protokol, aynı donörden epitel ve bağışıklık hücrelerine ihtiyaç duymadan influenza enfeksiyonunu takiben doğuştan gelen T hücrelerini incelemek için kullanılabilir. HNESPC'lerin 3T3 besleyici tabakasında büyüdükçe beklenen ilerlemesinin bir örneği burada gösterilmiştir. Bunlar, işlevsel, siliyer ve kadeh hücrelerine sahip çok katmanlı HNEC'ler elde etmek için hava / sıvı arayüz kültüründe farklılaşma için kullanıldı.
HNEC'ler kullanılarak, doğuştan gelen T hücresi aktivasyonu, akış sitometrisi kullanılarak araştırılabilir. Bu sonuçlar, mukozal ilişkili değişmez T veya MAIT hücrelerinin, V delta bir, gama delta T hücrelerinin ve doğal katil T veya NKT hücrelerinin tespitini göstermektedir. Bu hücreler, influenza virüsü ile enfekte olmuş HNEC'leri içeren ko-kültürde anlamlı olarak artmıştır.
Bu kurulum daha sonra enfekte epitel hücreleri ile ko-kültür koşulları altında ilgili aktivasyonlarını gözlemlemek için diğer influenza virüsü suşlarına veya doğuştan gelen bağışıklık hücresi popülasyonlarına uygulanabilir. Doğru enfeksiyon çokluğunun kullanıldığından emin olmak için insan burun epitel hücrelerinin sayısının doğru hesaplanması, optimal aktivasyon seviyeleri ve zamanlaması için önemlidir. Epitel hücreleri ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri arasındaki çapraz konuşma giderek daha fazla dikkat çekmektedir ve bu, akut veya kronik solunum immünolojisini içeren diğer yöntemlere daha fazla uygulanabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, viral enfeksiyona uğramış nazal epitel hücreleri ile doğuştan gelen bağışıklık hücreleri arasındaki çapraz etkileşimi araştırmakta olup doğuştan gelen T hücrelerine odaklanmaktadır. Aktivasyonlarını anlamak antiviral tedavilerde ilerlemelere yol açabilir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- İmmünoloji
- Viroloji
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Doğuştan gelen T hücreleri viral enfeksiyonlara karşı bağışıklık tepkisinde kritik bir rol oynar.
- İnsan nazal epitel hücreleri (HNEC) solunum yolu virüslerinin çalışmasında önemlidir.
- Doğuştan gelen T hücrelerinin aktivasyonu grip enfeksiyonlarında hayatta kalmayı iyileştirebilir.
- Aktivaasyon mekanizmalarını anlamak terapötik stratejiler hakkında bilgi sağlayabilir.
Çalışmanın Amacı
- Epitel hücreleri ile doğuştan gelen bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri araştırmak.
- Doğuştan gelen T hücrelerini aktive eden faktörleri belirlemek.
- Solunum yolu virüs enfeksiyonlarına karşı önleyici önlemler geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- İnsan nazal epitel hücrelerinin bir virüsle enfeksiyonu.
- İnsan kaynaklarından birincil bağışıklık hücrelerinin izolasyonu.
- Viral enfeksiyona karşılık bağışıklık hücresi aktivasyonunun değerlendirilmesi.
- Epitel ve bağışıklık hücreleri arasındaki çapraz etkileşimin analizi.
Ana Sonuçlar
- Doğuştan gelen T hücrelerini aktive eden ana faktörlerin belirlenmesi.
- Çalışılan etkileşimlerin fizyolojik alakasının gösterilmesi.
- Antiviral tepkiler içinde doğuştan gelen T hücrelerinin rolü hakkında içgörüler.
- Antiviral tedaviler geliştirmekte potansiyel yansımalar.
Sonuçlar
- Çalışma, viral enfeksiyonlara karşı bağışıklık tepkilerine olan anlamayı geliştirir.
- Bulgular, yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesine katkıda bulunabilir.
- Bu etkileşimlerin yansımalarını keşfetmek için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Dissecting early crosstalk between respiratory epithelial cells and innate immune populations is critical for de-risking antiviral target selection and understanding mechanisms of host defense. This contact-free co-culture model enables precise interrogation of soluble factor-mediated activation, supporting predictive confidence in innate immune modulation strategies. The approach informs portfolio decisions by clarifying early immune activation events relevant to respiratory virus progression and intervention points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic de-risking of innate immune activation pathways in response to viral infection.
- Supports functional target validation by quantifying activation of specific innate T cell subsets.
- Facilitates identification of soluble mediators as candidate therapeutic targets.
- Provides a human-relevant system for hypothesis testing of early immune signaling.
Screening & Assay Development
- Establishes a reproducible co-culture platform for evaluating immune cell activation by epithelial-derived factors.
- Delivers quantitative flow cytometry readouts for immune subset activation.
- Enables standardization of gating strategies for cross-study comparability.
- Prepares validated biological systems for downstream screening of modulators or inhibitors.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant respiratory models for translational biomarker discovery.
- Supports continuity from in vitro discovery to preclinical validation of immune-modulating interventions.
- Provides mechanistic insights to inform risk-adjusted advancement of antiviral candidates.
Pipeline & Workflow Integration
This model bridges early discovery and preclinical research by enabling functional analysis of innate immune activation in a physiologically relevant context.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of epithelial-immune crosstalk and soluble factor effects.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible immune activation data for compound evaluation.
- Analytics: Provides flow cytometry-based measurements and gating strategies for subset differentiation.
- Translational Research: Connects in vitro findings to disease-relevant respiratory infection models.
- Enterprise Reuse: Offers a modular platform adaptable to various viral strains and immune cell populations.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in innate immune target selection and mechanistic understanding.
- Operational Value: Standardizes immune activation assays for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for antiviral and immunomodulatory programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of early immune intervention strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture and flow cytometry analysis.
- Demands access to human nasal epithelial cells and PBMCs for physiological relevance.
- Necessitates standardized gating and analytical protocols for cross-study consistency.
- Adaptable to different viral strains and innate immune cell populations as supported by the protocol.
- Dependent on accurate cell quantification and infection parameters for optimal activation readouts.
