Mantar Formu, Sirkülasyon ve Damak Tat Tomurcuklarının Bütün Montajlı Boyama, Görselleştirme ve Analizi
11 Şubat 2021
Bu makalede, sürekli olarak bütün ve bozulmamış tat tomurcukları (içlerini saran sinir lifleri dahil) veren ve tat tomurcukları ile çevresindeki papilla içindeki yapılar arasındaki ilişkileri koruyan tüm mantar formu, sirküvallat ve damak tadı tomurcuklarının doku hazırlama, boyama ve analizi için yöntemler açıklanmaktadır.
Bu tüm montaj diseksiyon ve analiz iş akışı, bireysel tat sinir çardaklarının tam morfolojisini, hücre tipi sayılarını ve hücreler arasındaki fiziksel ilişkileri analiz etmek için yeni bir yaklaşım sağlar. Tüm lingual epitelin toplanması, tüm tat tokası içindeki mutlak hücre sayısını ve innervasyon hacmini ölçmemize izin verir. Bu yaklaşım, teknik değişkenliği azaltan bölümlerden örneklemeye dayalı hücre yapısı tahminlerinden daha doğrudur.
Bu aynı zamanda tat alma tomurcuk hücrelerinin innervasyonlarına göre ayrıntılı analizini sağlayan ilk yöntemdir. Bu yöntem, tat alma tomurcuklarındaki potansiyel devrelerin yanı sıra normal tat fonksiyonunu bozan hastalık süreçleri ve kemoterapilerle ilgili incelemeleri artırabilir. Bu vakaların çoğunda, hangi yapının veya ilişkinin bozulduğu belirsizdir, bu nedenle tüm bu faktörlerin bozulmadan sürdürülmesi, tüm analizlerin tek bir hazırlık içinde tutulmasına izin verir.
En yaygın hata, epitenin alt tarafına yeterince yakın bir şekilde parçalanmayarak epitelin zarar görmesinden kaçınmaya çalışmaktır. Doku kalıbındaki dokuyu dondurmadan önce mümkün olduğunca alttaki dokuyu çıkarmak zorunludur. Epitelin doku kalıbının dibinde düz bir şekilde uzanmasını sağlamak da önemlidir.
Dili 0,1 molar fosfat tamponunda eritip durulayarak başlayın. Daha sonra mantar biçimi papillasını içeren ön dilin 1/2'sini bir diseksiyon mikroskobu altında cam bir kaydırağa yerleştirin. Lingual epitel kavisli olduğu için kası çıkarmak ve dokuyu açık tutmak için künt uçlu epps ve diseksiyon makası kullanın, kaba diseksiyon makasının bıçaklarını epitele paralel tutarak dokunun düz bir yönünü sağlayın.
Tat alma tomurcukları içermediği için dilin ventral olmayan keratinize epitelini atın. Daha sonra keratinize epitelin alt kısmına daha yakın diseksiyon için ince diseksiyon makası kullanın. Bir epitel parçasını bir doku kalıbına koymak ve düz bir şekilde uzandığından emin olmak için künt uçlu tokalar kullanın.
Daha sonra dokuya bir damla optimum kesme sıcaklığı bileşiği veya OCT ekleyin. Doku kalıbını diseksiyon kapsamı altında daha önce soğutulmuş bir metal tabana yerleştirin, ardından OCT donana kadar dokuya hafifçe dokunmaya devam edin ve dokunun mümkün olduğunca düz donmasını sağlayın. OCT donduktan sonra, hızlı bir şekilde ek OCT ekleyin ve kalıbı donana kadar soğutulmuş 2 metilbütan bir kabın içine yerleştirin.
OCT kalıbını kriyostat üzerine monte edin ve 20 mikron bölüme kesin. Her bölümü toplayın ve epitel tabanına yakınlığını değerlendirmek için ışık mikroskobu altında görüntüleyin. Doku epitelin alt tarafından tıraş edildikten sonra, epitelleri çözün ve bir çalkalayıcı üzerinde 0,1 molar PB'de iki kez durulayın.
Sert damak ön ön kısmını yumuşak ve sert damak birleştiği yere kesin, ardından yumuşak damağı alttaki dokudan ayırın, kalan kemik parçalarının kesildiğinden emin olun ve ek kas ve bağ dokusunu çıkarın. Damak tadını künt uçlu forsepslerle tutun ve kalan bezleri çıkarın ve jiletle hafifçe kazıyarak bağ dokusunu kaybedin. Phox2b-Cre TdTomato farelerindeki tüm tat tomurcukları ve tüm tat tomurcuk innervasyonu, dil epitelinin DsRed ve keratin sekiz antikorları ile boyanarak etiketlendi.
Tat alma tomurcuk hacmi ölçüldü ve mantar formu veya sirkülasyon ölçüm bölgelerindeki tat alma tomurcuk hacimleri ile innervasyon hacimleri arasında hiçbir korelasyon olmadığını ortaya koydu. TrkB CreER TdTomato farelerinde düşük dozda tamoksifen verilmesi gen rekombinasyonuna ve az sayıda nöronun etiketlenmesine neden olur. Burada, tat dönüştürücü hücre belirteçleri karbonik anhidraz dört ve fosfolipaz C beta iki ile boyanmış tam bir tat tokası gösterilmiştir.
Bu tat alma tomurcukları, lifleri yeniden yapılandırdıktan sonra çıkarılan tat alma tomurcukları ile gösterilen iki etiketli terminal çardaklara sahiptir. Sinir lifleri ve tat dönüştürücü hücreler arasındaki en yakın yakınlığı belirlemek için hücre pikseli tabanlı görüntüleme yazılımının kullanılması, 19 tat dönüştürücü hücreden mavi terminal çardakının açık mavi karbonik anhidroz dört artı hücrenin 200 nanometresi içinde olduğunu ortaya koydu. Yeşil izleme ile ilişkili terminal çardak macenta olarak gösterilir ve hem açık hem de koyu mavi karbonik anhidraz dört artı hücrenin 200 nanometresi içindedir.
Bütün mount keratin sekiz ve 5-etirenil-2'deoksiformridin veya EdU mantar biçimi tat tomurcuklarının lekelenmeleri, EdU etiketli hücrelerin tat tomurcuklarının içinde ve dışında mevcut olduğunu ortaya koydu. Macenta ve mor çekirdekler, tat tomurcukunun keratin sekiz artı sınırının dışında gözlenir. Sarı, deniz mavisi ve mavi hücreler tat alma tomurcuklarının içindeydi.
Bu protokolü denerken, doku diseksiyonu ve donma adımları çok önemlidir. Bu doku diseksiyon yöntemleri, hem tat tozu içindeki hem de tat alma tomurcuklarının dışındaki, ancak papilla içindeki ilişkileri analiz etmek için çeşitli hücre ve yapılar için boyama ile takip edilebilir. Bu, tat tokası içindeki tüm tat çardaklarının ilk analizi ve tat dönüştürücü hücrelerle olan ilişkileridir.
Bu elementlerin birkaçını tek bir hazırlıkta korumak ve boyamak hem analiz olanaklarını genişletir hem de mümkün olan ölçümleri iyileştirir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, özellikle fungiform, sirkumvallat ve damak tat tomurcuklarının yapılarını ve innervasyonlarını koruyarak tüm yuva (whole-mount) diseksiyonu ve analizi için yeni bir yöntem sunmaktadır. Bu teknik, hücre sayılarının ve innervasyon hacimlerinin hassas bir şekilde ölçülmesine olanak tanıyarak, tat tomurcuğu devreleri ve hastalıkların tat fonksiyonu üzerindeki etkilerine dair anlayışımızı geliştirmektedir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Sistem Biyolojisi
Arkaplan
- Tüm tat tomurcuğu analizi, bunların morfolojisi ve fonksiyonel devreleri hakkında bilgiler sağlar.
- Mevcut metodolojiler, örneklemeden kaynaklanan yüksek değişkenlikten sıklıkla etkilenmektedir.
- Tat fonksiyonunun anlaşılması, tat bozukluklarıyla ilgili araştırmalarda kritik öneme sahiptir.
- Bu çalışma, tat tomurcuklarının eksiksiz yapısını innervasyonları ile ilişkili olarak tanımlamayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Bütün haldeki tat tomurcuklarının diseksiyonu ve analizi için güvenilir bir yöntem geliştirmek.
- Tat tomurcuğu hücreleri ile bunları innerve eden sinir lifleri arasındaki ilişkileri incelemek.
- Bu araştırmanın, tat duyusunda rol oynayan devrelerin anlaşılması üzerindeki etkilerini vurgulamak.
Kullanılan Yöntemler
- Bu çalışma, dilden tat tomurcukları için bütün monte diseksiyon tekniği kullanmaktadır.
- Biyolojik model, Phox2b-Cre TdTomato ve TrkB CreER TdTomato farelerinden alınan tat tomurcuklarını içermektedir.
- Bu çalışmada herhangi bir multiomik iş akışı kullanılmamıştır.
- Kritik adımlar arasında dikkatli diseksiyon ve dokunun uygun şekilde dondurulması yer almaktadır.
- Örnekler daha sonra farklı hücre tiplerini görselleştirmek için boyama teknikleri kullanılarak analiz edilmiştir.
Ana Sonuçlar
- Teknik, tat tomurcuklarını bütün halde korumayı ve boyamayı başarmış, böylece hücrelerin mimari yapısını ortaya çıkarmıştır.
- Ölçümler, tat tomurcuğu hacimleri ile innervasyon hacimleri arasında herhangi bir korelasyon olmadığını göstermiştir.
- Hücre piksel tabanlı görüntüleme, sinir lifleri ile tat iletim hücreleri arasındaki yakınlığı kanıtlamıştır.
- EdU etiketlemesi, tat tomurcuğu sınırları içinde ve dışında hücre proliferasyonu olduğunu göstermiştir.
Sonuçlar
- Çalışma, gelecekteki araştırmalara yardımcı olabilecek, tat tomurcuklarının analizi için yenilikçi bir protokol sunmaktadır.
- Çok omik analizler dahil edilmemiş olsa da, bulgular tat tomurcuğu fonksiyonuna dair anlayışımızı geliştirmektedir.
- Bu yöntem, tat bozukluklarının araştırılması için değerli olan hücresel ilişkilerin ayrıntılı bir şekilde incelenmesine olanak tanır.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Uygunluğu
Tat tomurcuklarının bütün mount (whole-mount) analizi, kesit tabanlı yaklaşımlarda görülen teknik değişkenliği azaltarak hücresel ve innervasyon parametrelerinin kesin şekilde nicelendirilmesine olanak tanır. Bu yöntem, transduksiyon hücreleri ile sinir lifleri arasındaki mekansal ilişkileri koruyarak, nörobilim ve duyusal biyolojideki mekanistik risklerin azaltılmasını destekler. Hastalık modellerinde ve terapötik müdahale çalışmalarında kemoduyusal fonksiyonun değerlendirilmesi için tekrarlanabilir bir platform sağlar.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Mutlak hücre sayımı ve sinir uçlarının mekansal haritalaması aracılığıyla tat iletim yollarının sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Tekrarlanabilir analizler için tat tomurcuğu mimarisini bozulmadan koruyarak yanlılığı ve değişkenliği azaltır.
- Öngörücü Değer: Moleküler belirteçleri in situ fonksiyonel innervasyon paternleriyle ilişkilendirerek hedef güvenini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Analiz standardizasyonu için tat tomurcuğu hacmi, innervasyon hacmi ve transdüksiyon hücresi sayıları gibi kantitatif çıktılar üretir.
- Operasyonel Değer: Multipleks boyama ve otomatik görüntü analizi ile uyumlu, yüksek sadakatli görüntüleme iş akışlarını kolaylaştırır.
- Analiz Hazırlığı: Tat tomurcuğu bütünlüğünü veya nöral bağlantısallığı etkileyen bileşiklerin taranması için ölçeklenebilir bir sistem sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Genetik olarak işaretlenmiş modeller kullanarak, tat tomurcuğu-sinir ilişkilerinde hastalık veya terapi kaynaklı bozulmaların analiz edilmesini sağlar.
- Operasyonel Değer: Aynı dokudan alınan bütün mount örneklerinin tekrarlı boyanmasına ve görüntülenmesine olanak tanıyarak boylamsal çalışmaları destekler.
- Translasyonel Süreklilik: Doğal doku mimarisini koruyarak, keşif bulguları ile preklinik doğrulama arasında köprü kurar.
İş Akışı ve Boru Hattı Entegrasyonu
Bu yöntem, tat alma mekanizmaları ve nöral bağlantısallık üzerine hipotez testlerine olanak sağlayarak keşif biyolojisi iş akışlarına entegre olur.
- Keşif Biyolojisi: Uzamsal ko-lokalizasyon analizi aracılığıyla tat ileten hücre tiplerinin yolak açıklığa kavuşturulmasını ve fonksiyonel validasyonunu destekler.
- Tarama: Kemosensoriyel araştırmalarda bileşik taraması için temel teşkil eden tekrarlanabilir, kantitatif okumalar sağlar.
- Analitikler: Sinir lifleri ile tat reseptörleri arasındaki subcellular mesafeleri ölçmek için hücre piksel tabanlı görüntüleme kullanarak veri odaklı karşılaştırmalara olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Kemoterapi, yaşlanma veya genetik bozukluk modellerinde tat disfonksiyonunu incelemek için yapısal bütünlüğü korur.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla tat bölgesi ve fare modeli genelinde uygulanabilir, standardize edilmiş bir doku hazırlama protokolü oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Örnekleme artefaktlarını ortadan kaldırarak ve hücre-sinir etkileşimlerinin doğrudan gözlemlenmesine olanak tanıyarak öngörü güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış diseksiyon, dondurma ve boyama prosedürleri aracılığıyla tekrarlanabilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: Hedef etkileşimine ilişkin mekanistik içgörü sağlayarak duyusal ilaç geliştirmedeki devam/durdur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Tat tomurcuğu yapısı ve innervasyon üzerindeki etkilere dayanarak bileşiklerin riskten arındırılmış önceliklendirmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Epitel bütünlüğünü korumak için mikrocerrahi diseksiyon ve doku işleme konusunda uzmanlık gerektirir.
- Uygun doku oryantasyonu ve dondurma için kriyostat kesit alma ve OCT gömme altyapısına bağlıdır.
- Tutarlı doku montajı ve boyama protokolleri için ekipler arasında standartlaşma gereklidir.
- Fungiform, sirkumvallat ve damak bölgelerindeki tat tomurcuğu yoğunluğu ve boyutundaki değişkenlikler dikkate alınmalıdır.
- Sinir ağaçlarını yeniden oluşturmak ve hücresel altı yakınlığı nicelleştirmek için özelleşmiş görüntüleme ve analiz araçlarına duyulan ihtiyaçla sınırlıdır.
