Akut Beyin Dilimlerinde Endojen Monoamin Salınımının Ölçümü için Plaka Bazlı Bir Tahlil

Bu teknik, monoamin salınımını incelemek için yaygın olarak kullanılan yöntemlerin bir uyarlamasıdır ve aynı anda birden fazla farmakolojik koşulda önceden yüklenmiş radyolabelli monoaminler yerine endojen salınımın ölçülmesine izin verir. Bu tekniğin temel avantajları oldukça uygun maliyetli olması, birden fazla farmakolojik koşulun aynı anda incelenebilmesi ve veziküler ve taşıyıcı aracılı salınımı ayırt etme yeteneği ile endojen monoamin salınımını inceleyebilmemizdir. Hasattan sonra yetişkin 250 ila 350 gram erkek sıçanlardan beyin dilimleri hazırlamak için, hemen beyin ve buz soğuk oksijenli diseksiyon tamponu yerleştirdi ve her ilgi çekici bölgeden 300 mikron koronal beyin bölümü elde etti.

Beyin dilimlerinin daha fazla diseksiyonu için, dokuları dikkatlice cam slaytlara taşıyın ve koyu çizgili yapısına dayanarak dorsal striatutu tanımlamak ve kortekse yakınlığına ve benzersiz spiral yapısına dayanarak hipokampusu tanımlamak için bir sıçan beyin atlası kullanın. Sağ ve sol yarımküreleri kontrol ve deneysel dilimler olarak kullanımları için ayırın. Sırt striatum iki milimetrelik yumruklara daha fazla kesilebilir.

Daha sonra, numuneleri oksijen köpürmesi ile oksijenli buz soğuk diseksiyon tamponuna batırılmış küçük kaplara aktarmak için modifiye uçlu plastik bir transfer pipet kullanın. Monoamin salınımını teşvik etmek için, doku örneklerini, sürekli nazik kabarcıklanma ile kuyu başına 0,5 ila bir mililitre efflux tampon içeren özel yapılmış 48 kuyu efflux odasının her kuyusuna aktarın ve örneklerin 37 santigrat derecede 30 ila 50 dakika boyunca iyileşmesine izin verin. Denge döneminin sonunda, beyin dokusuna sahip doku tutucuyu farmakolojik ajanlı veya farmakolojik ajansız 500 mikrolitre oksijenli efflux tampon içeren kuyulara taşıyın, 37 santigrat derecede 20 dakikalık bir inkübasyon için kuyular arasında tamponun minimum transferini önlemek için kuyunun kenarındaki tutucuya dokunun.

Kuluçkanın sonunda, tutucuyu ilgi ilacı olsun veya geçmesin 500 mikrolitre efflux tampon içeren yeni bir kuyu setine taşıyın ve plakayı 20 dakika daha hücre kültürü inkübatörüne iade edin. İkinci inkübasyon sırasında, çözeltiyi kuyulardan ilk inkübasyondan, buz üzerinde normal bir perklorik veya fosforik asitten 50 mikrolitre içeren mikrosantrifüj tüplere aktarın, ve tüpleri bir numaralı etiketle"İkinci inkübasyonun sonunda, doku tutucuyu buz üzerindeki plaka ile boş kuyulara taşıyın ve süpernatantları ikinci inkübasyondan normal bir perklorik veya fosforik 50 mikrolitre içeren yeni mikrosantrifüj tüplere aktarın. buzdaki asit. Bu tüpleri iki numaralı etiketleyin "Tüm süpernatantlar transfer edildiğinde, her doku kuyusuna bir mililitre buz soğuk diseksiyon tamponu ekleyin ve her doku örneğini yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için küçük cımbız kullanın.

Tamponu numune tüplerinden çıkarın ve dokuları eksi 80 santigrat derecede saklayın, ardından toplanan kuluçka çözeltilerini santrifüjleme için mikrosantrifüj filtre tüplerine aktarın ve HPLC analizine kadar filtratı buza yerleştirin. ECD'nin potansiyelini ve akış hızını, monoaminleri tespit etmek için üreticinin önerisine ayarlayın. Otomatik enjeksiyon ve algılama için HPLC'ye nöro-verici standartları da dahil olmak üzere her numunenin yük ve uygun aliquot'u yükleyin ve cihazın analizi tamamlamasını bekleyin.

Ardından, üreticinin yönergelerine göre eğrinin altındaki alanı elde etmek için her monoaminin oluşturduğu standart bir eğri kullanarak kromatograf verilerini elde etmek ve analiz etmek için HPLC analiz yazılımını kullanın. Altı saatlik fonksiyonel analizden sonra doku örnekleri uygulanabilirliğini yitirirken, %1 Triton X-100 ile inkübe edilen örnekler MTT dönüşümünde önemli bir azalma olduğunu göstermektedir. Hipokampal ve prefrontal korteks beyin bölümlerinin amfetamin ile akut 20 dakikalık tedavisi, her monoamin hücre dışı seviyesinde önemli bir artışa neden olur.

Örnekler, seçici bir serotonin geri alım inhibitörü olan fluoksetin ile ön işlemden geçirildiğinde, hipokampus ve prefrontal korteks içindeki hücre dışı serotoninlerde amfetamin kaynaklı artış gerçekleşmezken, hücre dışı dopamin ve norepinefrin üretimindeki artış etkilenmez. Ek olarak, amfetamin ile dorsal striatum yumruklarının akut 20 dakikalık tedavisi hücre dışı dopamin seviyesi ekspresyonunda 35 kat artışa neden olurken, monoamin taşıyıcı bloker olan kokain ile dorsal striatum punch tedavisi amfetamin kaynaklı hücre dışı dopamin inhibisyonunun önemli ölçüde inhibisyonunu ile sonuçlanır. Membran depolarizasyonunu çağrıştırmak için hücre dışı potasyum klorür konsantrasyonunun artırılması, tedavi edilmemiş kontrol koşullarına kıyasla monoaminlerin ekzosytotik salınımını teşvik etmek için yeterlidir ve ne fluoksetin ne de kokain tedavisi bu derin polarizasyon kaynaklı artışı engellemez.

Temiz kesim bölümlerine sahip olmak, yumrukların hassas bir lokalizasyonu ve deney boyunca tutarlı oksijenasyonu korumak zorunludur. Beyin bölümleri, batı şişkinliği ve histolojisi gibi daha fazla biyokimyasal işleme ve analiz için deney sonrası kullanılabilir.