Name: Murine Dextran Sodyum Sülfat Kaynaklı Kolit Modelinde Bağırsak İltihabı İçin Sistematik Puanlama Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Keşfedin DSS ile indüklenen fare kolitinde mukozal hasarın sistematik, niceliksel değerlendirmesi için dijital görüntü analizi protokolü. Bu yöntem, tüm kolon boyunca objektif ve tekrarlanabilir histolojik skorlama sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar NIH'nin DK055679, DK089763, DK079392, DK061739, DK072564 ve Michigan Üniversitesi Patoloji Slayt Tarama Hizmetleri'nden destek almak istemeleridir.

Açıklanan tüm hayvan deneyleri Michigan Üniversitesi Hayvanların Kullanımı ve Bakımı Komitesi tarafından onaylandı.
1. Doku hasadı
<ol><li>Onaylanan protokollere uygun olarak fareleri izofluran anestezisi ve ardından servikal çıkık kullanarak insanca ötenazi. Tüm hayvan deneyleri için, sertifikalı bir inceleme kurulu tarafından hayvan elleçleme için Ulusal ve Kurumsal yönergelere uygun olarak onay alındı.</li>
	<li>Fareyi bir diseksiyon pedi üzerine supine pozisyonunda yerleştirin. 20 G x 1 1/2 inç G iğneler kullanarak fare ekstremitelerini hareketsiz hale getir.</li>
	<li>Perten ve makas kullanarak, karın derisinde küçük bir kesi yapın ve peritonun ortaya çıkması için yana doğru çekin.</li>
	<li>Kasık kemiğinden karın kenarlarına kadar peritonda orta çizgi kesi ile karın boşluğunu açın.</li>
	<li>Kalın bağırsak görselleşene kadar dokuları ve organları dikkatlice çıkarın. Organı tamamen görselleştirmek için kolonun her iki tarafındaki pelvik kemiği kesin, anüsten cecum'a doğru uzanın.</li>
	<li>Kolona bağlı yağ, küçük damarlar ve arterleri yavaşça çıkarın, organı dikkatlice parçalara ayırın, anüse sadece proksimal kesin ve sadece obtal. NOT: Parçalanmış kolon, İsviçre rulo prosedürünü tamamlarken oda sıcaklığında kalmalıdır.</li>
	<li>Dışkı içeriğini çıkarmak için anüsten yerleştirilmiş esnek bir plastik gavage iğnesi kullanarak kolonu 1x PBS ile dikkatlice yıkayın.</li>
	<li>Kolonu düz bir çizgiye yerleştirin ve mezenterik arter boyunca uzunlamasına açın. Kolonu distalden proksimal uca boyuna ikiye ayırın (Şekil 1A). Dokunun bir yarısı histolojik analiz için kullanılabilirken, diğeri batı lekesi, PCR için işlenebilir veya taze dondurulmuş immünofolüoresans mikroskopisi için ikinci bir İsviçre rulosuna yuvarlanabilir12.</li>
</ol>2. İsviçre rulolarının hazırlanması
<ol><li>Tüm kolonun uzunluğu boyunca yaklaşık aynı genişlik elde edilene kadar bir jilet kullanarak proksimal kolondan ekstra doku kırpın.</li>
	<li>Lümeni yukarı bakacak şekilde hizalayın ve esnek bir gavage iğnesi kullanarak dokuyu tamamen düzleştirin. İşlem boyunca dokuyu nemli tutmak için gerekirse daha fazla PBS ekleyin.</li>
	<li>Kağıt mendil kullanarak PBS'nin fazlalığını çıkarın. Bir şırınga ve gavage iğnesi ile, dokuyu düzeltmek ve düzlemek için 2-3 dakika boyunca doku üzerine% 10 nötr tamponlu formalin çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>Distal kolonun ucunun ucunun kavraçlarını almak ve kolonu distalden proksimal uca eşmerkezli daireler halinde bükmek için düz tokmaklar kullanın (Şekil 1B). NOT: Dokunun rulonun içinde olduğundan emin olmak için delme kullanarak yuvarlanırken İsviçre rulosunun içini geri itmek mümkündür.</li>
	<li>İsviçre rulo şeklini tutmak için kolonu ortaya sabitlemek için 27 G'lik bir iğne yerleştirin (Şekil 1C).</li>
	<li>İğne ile İsviçre rulosunu histolojik bir numune kabının içine gömme bir kasete yerleştirin. NOT: Doku, sabitlemeden önce kasete paralel olarak yönlendirilmelidir (Şekil 1D).</li>
	<li>Dokuyu 4 °C 13'te bir gecede %10nötr tamponlu formalin çözeltisinde sabitle.</li>
	<li>Gece sabitlemeden sonra, dokuyu PBS ile 3x yıkayın.</li>
	<li>Parafin gömme işlemi öncesinde dokuya p etanol ekleyin. Devam etmeden önce iğneyi İsviçre rulosundan çıkarın. Doku, parafin gömme13'ekadar oda sıcaklığında etanolde saklanabilir.</li>
	<li>Örnekleri doku işlemcisine yerleştirin, parafin içine gömün ve pozitif yüklü mikroskopi slaytlarına monte edilmiş 4 μm bölüm hazırlayın (Şekil 1E). Bu isteğe bağlı bir durma noktası olabilir. NOT: Görüntü analizine uygun bölümlere ulaşmak için uygun doku yönlendirmesi kritik öneme sahiptir. Parafin kasetine paralel İsviçre rulosu gömmesi, görüntü analizi için uygun tam bölümlere neden olacaktır (Şekil 1F-1H). Eksik bölümleri önlemek için eğik bölümlerden kaçınılmalıdır (Şekil 1I-1K). Daha fazla ayrıntı için Tartışma bölümüne bakın.</li>
	<li>Hematoksilin ve eozin (H&amp;E)13ile leke bölümleri.</li>
</ol>3. Dijital tarama ve analiz
NOT: Mukozal değişikliklerin doğru değerlendirilmesi için, yalnızca toplam kolon uzunluğunun en az% 90'ını içeren bölümleri seçin.
<ol><li>Lekeli bölümleri slayt tarayıcısı veya görüntüleyicı kullanarak tarayın (bkz. Malzeme Tablosu). Üretilen görüntüler, 40x amaç ve 40x büyütme ile piksel başına 0,25 mikron çözünürlüğe ihtiyaç duyar.</li>
	<li>Taranan slaytların dijital analizi için uygun bir yazılım yükleyin ve indirin (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	<li>Taranan görüntüleri görüntü işleme yazılımında açın (Şekil 2A). İki nokta üst üste işaretinin tamamının görünür olduğunu ve örneğin eksik alanlarının olmadığını doğrulayın.</li>
	<li>Etiket görüntüleyicısı(Şekil 2A)öğesini tıklatarak taranan slaytları doğru şekilde tanımlamak için etiket görüntüleyicİsini ve ölçek çubuğu araçlarını etkinleştirin.</li>
	<li>Ek Açıklamalar aracını Ek Açıklamalar 'ı(Şekil 2A) tıklatarak açın ve İsviçre rulosuna, iltihaplanmaya/yaralanmaya ve erozyona/ülserasyona ilişkin toplam uzunluğu ölçmek için Yeni katmana ( Şekil2B) tıklayarak 3 farklı katman oluşturun. Katman rengi (Şekil 2B) öğesini tıklatarak her katman için farklı bir renk seçin.</li>
	<li>Referans olarak muscularis mukozasını kullanarak Kalem aracını (Şekil 2A) tıklatarak her katmanın/kategorinin uzunluğunu ölçün:<ol>
<li>Muscularis mukozasının yeterli görselleştirilmesini kolaylaştırmak için görüntüyü 400 μm yakınlaştırmada (veya daha fazla) görüntüleyin. NOT: Büyütme, fare kaydırma tekerleği kullanılarak kolayca kontrol edilir ve tüm çizgileri çizmek için bölüm boyunca hareket ederken gerektiği gibi ayarlanması gerekir.</li>
		<li>Muscularis mukozasını takiben bir çizgi çizmek için Kalem aracına tıklayın (Şekil 2A). Çözümleme için bitişik alanı görselleştirmek için işaretçiyi gerektiği gibi hareket ettirın. NOT: Kalem her durdurulduğunda, küçük bir yeni katman bölgesi oluşturulur. Katman bölgeleri sekmesiyle görselleştirilebilir ve düzenlenebilir (istediğiniz segmenti seçin ve hata veya düzeltme durumunda Katmanı Sil'i tıklatın, Şekil 2B).</li>
	</ol></li>
	<li>Tüm katmanlar (Şekil 2C) tanımlandıktan sonra, katman bölgeleri seçeneklerinin içindeki Izgarayı Metin Dosyasına Aktar düğmesini kullanarak verileri dışa aktarın (Şekil 2B). NOT: Verilerin düzgün depolandığından emin olmak için katmanları oluştururken dosyaları sık sık kaydedin.</li>
	<li>Metin dosyalarını açın ve verileri bir elektronik tablo yazılımıyla kopyalayın. Her bölgedeki tüm segmentleri toplayın ve toplam uzunluğa göre yaralanma ve ülserasyon yüzdesini hesaplayın.</li>
	<li>Histolojik Kolit Skorunu (HCS) hesaplamak ve hastalığın şiddetini değerlendirmek için, üç ana özelliği aşağıda ayrıntılı olarak düşünün.<ol>
<li>Kripto-luminal eksende organize epitel hücreleri, az sayıda bağışıklık hücresine sahip lamina propria ve mukoza ve submucosa'yı arayüzleyen subjacent muscularis mukozası ile karakterize edilen sağlıklı bağırsak mukozasını kontrol edin (Şekil 3A).</li>
		<li>Zayıflatılmış veya kısmen eksik epitel hücreleri ve kriptolara nötrofil infiltrasyonlu mukozal inflamasyon ile karakterize olan iltihap/yaralanma olup olmadığını kontrol edin (Şekil 3B).</li>
		<li>Yüzey epitelden yoksun alanlar veya ilişkili lökositli veya ilişkili lökositsiz epitel mahzenlerinden tamamen yoksun alanlarla karakterize edilen erozyon / ülserasyon varlığını kontrol edin (Şekil 3C).</li>
	</ol></li>
	<li>Aşağıdaki formülde toplam uzunluğun yüzdesi olarak ifade edilen yaralı ve ülserli bölgelerin HCS'sini hesaplayın: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62135/62135eq01v2.jpg"> NOT: HCS, epitelin tamamen kaybedilmesinin maksimum bariyer bütünlüğü kaybına ve dolayısıyla daha kötü hastalığa neden olduğu makul bir varsayıma dayanarak, iltihaplanma / yaralanma ve erozyon / ülserasyon yüzdesini ikincisine iki faktör ekleyerek birleştirir. HCS, DSS indüklenmiş deneysel kolitin neden olduğu morfolojik değişiklikleri sürekli olarak temsil eder. İlginçtir ki, DSS kolitinde kolonik lenfoid agrega veya folikül sayısı ile klinik hastalık şiddeti arasında net bir korelasyon görmedik ve bu nedenle bu analize niceliği dahil etmedik.</li>
	<li>Temsili görüntülerin anlık görüntüsünü alın (Anlık Görüntü, Şekil 2A'yı tıklatın) ve kaydedin. Ölçek Çubuğunu Göster/Gizle 'ye tıklayarak gerekirse ölçek çubuklarını dahil edin (Şekil 2A).</li>
</ol>

<ol><li>Kagnoff, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+epithelium+is+an+integral+component+of+a+communications+network%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The intestinal epithelium is an integral component of a communications network.</a> Journal of Clinical Investigation. 124 (7), 2841-2843 (2014).</li>
<li>Laukoetter, M. G., Nava, P., Nusrat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+intestinal+barrier+in+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Role of the intestinal barrier in inflammatory bowel disease.</a> World Journal of Gastroenterology. 14 (3), 401-407 (2008).</li>
<li>Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Crohn's disease.</a> Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).</li>
<li>Ordas, I., Eckmann, L., Talamini, M., Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ulcerative+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Ulcerative colitis.</a> Lancet. 380 (9853), 1606-1619 (2012).</li>
<li>Vowinkel, T., Kalogeris, T. J., Mori, M., Krieglstein, C. F., Granger, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+dextran+sulfate+sodium+load+on+the+severity+of+inflammation+in+experimental+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases+and+Sciences%22%5BJournal%5D)">Impact of dextran sulfate sodium load on the severity of inflammation in experimental colitis.</a> Digestive Diseases and Sciences. 49 (4), 556-564 (2004).</li>
<li>Kitajima, S., Takuma, S., Morimoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+analysis+of+murine+colitis+induced+by+dextran+sulfate+sodium+of+different+molecular+weights%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Animals%22%5BJournal%5D)">Histological analysis of murine colitis induced by dextran sulfate sodium of different molecular weights.</a> Experimental Animals. 49 (1), 9-15 (2000).</li>
<li>Mahler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+susceptibility+of+inbred+mouse+strains+to+dextran+sulfate+sodium-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis.</a> American Journal of Physiology. 274 (3), 544-551 (1998).</li>
<li>Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+induced+mouse+models+of+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chemically induced mouse models of intestinal inflammation.</a> Nature Protocols. 2 (3), 541-546 (2007).</li>
<li>Kozlowski, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+entirely+automated+method+to+score+DSS-induced+colitis+in+mice+by+digital+image+analysis+of+pathology+slides%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">An entirely automated method to score DSS-induced colitis in mice by digital image analysis of pathology slides.</a> Disease Models & Mechanisms. 6 (3), 855-865 (2013).</li>
<li>Perse, M., Cerar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dextran+sodium+sulphate+colitis+mouse+model%3A+traps+and+tricks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 718617(2012).</li>
<li>Mizoguchi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Molecular+Biology+and+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">Animal models of inflammatory bowel disease.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 105, 263-320 (2012).</li>
<li>Flemming, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desmocollin-2+promotes+intestinal+mucosal+repair+by+controlling+integrin-dependent+cell+adhesion+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Desmocollin-2 promotes intestinal mucosal repair by controlling integrin-dependent cell adhesion and migration.</a> Molecular Biology of the Cell. 31 (6), 407-418 (2020).</li>
<li>Luna, L. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLuna%2C+LG+%22Armed+Forces+Institute+of+Pathology+%28U.S%29+%26+Armed+Forces+Institute+of+Pathology+%28U.S.%29.+Manual+of+Histologic+Staining+Methods+of+the+Armed+Forces+Institute+of+Pathology.+3d+edn%22">Armed Forces Institute of Pathology (U.S) & Armed Forces Institute of Pathology (U.S.). Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. 3d edn</a>. , Blakiston Division. (1968).</li>
<li>Kelm, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+epithelium-expressed+sialyl+Lewis+glycans+improves+colonic+mucosal+wound+healing+and+protects+against+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation+Insight%22%5BJournal%5D)">Targeting epithelium-expressed sialyl Lewis glycans improves colonic mucosal wound healing and protects against colitis.</a> The Journal of Clinical Investigation Insight. 5 (12), (2020).</li>
<li>Reed, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+CD47+is+critical+for+mucosal+repair+in+the+murine+intestine+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Epithelial CD47 is critical for mucosal repair in the murine intestine in vivo.</a> Nature Communications. 10 (1), 5004(2019).</li>
<li>Laukoetter, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAM-A+regulates+permeability+and+inflammation+in+the+intestine+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (13), 3067-3076 (2007).</li>
<li>Khounlotham, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compromised+intestinal+epithelial+barrier+induces+adaptive+immune+compensation+that+protects+from+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Compromised intestinal epithelial barrier induces adaptive immune compensation that protects from colitis.</a> Immunity. 37 (3), 563-573 (2012).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Histolojik Kolit Skor sistemimiz doku iltihabını ve bağırsaktaki hasarı ölçmek için güvenilir bir araçtır. Bu yaklaşım, küçük alanlar veya eksik bölümler seçme önyargısı olmadan tüm organın histopatolojik durumunun daha iyi anlaşılmasını sağlar. Bu protokolü başarıyla yürütmek için kritik adımlar arasında, kolon uzunluğunun en az% 90'ının analizine izin veren İsviçre rulolarının uygun şekilde hazırlanması vardır; epitel mahzenlerinin boyuna görünümlerine sahip düz ve düzgün doku bölümlerini sağlamak için parafin gömme ve...

Gastrointestinal epitel bariyeri, luminal antijenlerin ve patojenlerin alttaki doku bölmelerinden ayrılmasında önemli bir rol oynar1. İnflamatuvar bağırsak hastalığı (IBD), iskemi veya cerrahi yaralanma gibi patolojik durumlarda görülen epitel yaralanması ve mukozal yaralar ishal, kilo kaybı, dışkıda kan ve karın ağrısı gibi klinik semptomlarla ilişkilidir. Yaralanmaya yanıt olarak, epitel hücreleri mukozal bariyer kusurlarını yeniden epitelleştirmek ve onarmak için göç eder ve çoğalır. enflamasyonun çözülmesi ve mukozal bütünlüğün iadesi, bağırsak mukozal homeostazının ve fonksiyon 2 ,3,4'ün yeniden kurulması için çok önemlidir.
Bağırsak epitel bariyerinin hasarı ile ilişkili alttaki moleküler mekanizmaları incelemek için çeşitli hayvan modelleri gütlenmiştir. Kimyasal olarak indüklenen kolitin iyi kurulmuş ve kolayca uygulanabilir modelleri, özellikle IBD gibi enflamatuar yaralanma ile ilgili çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Yaygın, tekrarlanabilir ve güvenilir bir murine kolit modeli, dektran sodyum sülfat (DSS) aracılı kolon yaralanması ve iltihabını kullanmaktadır. Hastalığın şiddeti fare suşuna, DSS dozu, DSS uygulama uzunluğu ve DSS5, 6,7moleküler ağırlığına bağlı olarak değişir.
DSS kolit sırasında bağırsak mukozal hasarı genellikle kilo kaybı, dışkı kan içeriği ve dışkı kıvamına göre belirlenen bileşik bir puan olan Hastalık Aktivite Endeksi (DAI) kullanılarak değerlendirilir. Dışkı kan içeriği mikroskobik (dışkı guaiac asit testi kullanılarak tespit edilebilir) veya makroskopik olabilir; dışkı kıvamı sert, yumuşak veya sıvı (yani ishal) olarak sınıflandırılır5,8. Bu klinik parametrelerin puanlaması öznel olabilir ve kullanıcının deneyimine ve önyargısına bağlı olarak değişebilir, ancak genel olarak veriler güvenilir bilgi sağlar ve bu nedenle IBD araştırmacıları tarafından yaygın olarak kullanılır. Buna karşılık, mukozal hasarın histolojik olarak değerlendirilmesi için genel olarak kabul edilen bir yöntem yoktur. En yaygın olarak, kolonun seçilen alanları eğitimli bir patolog tarafından incelenir ve genellikle kript yaralanması ve lökosit infiltrasyonunu9, 10,11içeren çeşitli parametrelere göre puanlanır. Bununla birlikte, araştırılan parametrelerin sayısı ve analiz edilen doku miktarı bireysel raporlar arasında önemli ölçüde değiştiğinden, yayınlanan birçok çalışmanın karşılaştırılabilme kabiliyeti sınırlıdır. Gözlemci önyargısını azaltmak ve çalışmalar arası uyumluluğu artırmak için ideal bir histolojik puanlama protokolü: 1) bağırsak mukoza iltihabı en sık değişken olduğu ve atlama lezyonları yaygın olduğu için kolonun tüm uzunluğunu içermelidir, 2) öznellik azaltmak için analizi belirli anahtar ve kolayca yorumlanabilir parametrelerle sınırlayın, 3) çok sayıda örneğin hızlı, tutarlı bir şekilde işlenmesini kolaylaştırmak ve 4) veri toplama, analiz ve sunum için yaygın ve uygun fiyatlı araçlar kullanmak.
Burada, ince bağırsağın tüm kolon veya uzun segmentlerini bir "İsviçre rulosu" konfigürasyonunda işlemek için bir teknik ve DSS kaynaklı kolit nedeniyle bağırsak mukozal iltihabını ve hasarını analiz etmek için ücretsiz bir bilgisayar destekli puanlama sisteminin kullanımını açıklıyoruz.

<table><tbody><tr><td>Aperio AT2 &ndash; Yüksek Hacimli, Dijital Tüm Slayt Tarama</td><td>Leica Biosystems</td><td>Aperio AT2</td><td></td></tr><tr><td>Su geçirmez nem bariyerli Emici Alt Pedler</td><td>VWR International</td><td>56616-032</td><td></td></tr><tr><td>American Line 66-0089 Tek Kenar Bıçak, paket başına 100</td><td>GT Midwest</td><td>TL5837</td><td></td></tr><tr><td>BD Luer-Lok İğnesiz Tek Kullanımlık Şırıngalar</td><td>Fisher scientific</td><td>14-823-2A</td><td></td></tr><tr><td>Bonn Şaşılık Makası - ToughCut</td><td>İnce Bilim aletleri</td><td>11103-09</td><td></td></tr><tr><td>Bonn Şaşılık Makası - ToughCut</td><td>Güzel Bilim aletleri</td><td>14084-09</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forseps</td><td>Güzel Bilim araçları</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Formalin çözeltisi, nötr tamponlu, %10</td> <td>Sigma</td><td>HT501640-19L</td><td></td></tr><tr><td>HistoPrep %70 Ea</td><td>Fisherbran</td><td>%70 denatüre etil alkol</td><td></td></tr><tr><td>ImageScope</td><td>Aperio</td><td>Sürüm 12.3.3.5039</td><td>http://www.leicabiosystems.com/pathology-imaging/aperio-epathology/integrate/imagescope/</td></tr> <tr><td>LeakBuster Numune Kapları: Steril</td><td>Starplex Scientific</td><td>B120210</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin, kalsiyum ve magnezyum içermez</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Plastik Besleme tüpleri, 20 GA x 30 mm</td><td>Instech</td><td>FTP2030</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide İğnesi, Boyut: 20 G x 1 1/2 inç</td><td>BD (Becton, Dickinson and Company)</td><td>305176</td><td></td></tr><tr><td>PrecisionGlide İğnesi, Boyut: 27 G x 1/2 inç</td><td>BD (Becton, Dickinson and Company)</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga, 10 ml</td><td>BD (Becton, Dickinson and Company)</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>Unisette Doku Kasetleri</td><td>Simport</td><td>M505-2</td><td></td></tr></tbody></table>

murine dextran sodyum sülfat kaynaklı kolit modelinde bağırsak İltihabı İçin sistematik puanlama analizi

Systematic Scoring Analysis for Intestinal Inflammation in a Murine Dextran Sodium Sulfate-Induced Colitis Model

Murine kolit modelleri, enflamatuar bağırsak bozukluklarının patobiyolojisini anlamaya odaklanan çalışmalarda yoğun olarak kullanılan araçlardır. Bununla birlikte, hastalık şiddetinin objektif ve tekrarlanabilir nicelemesi için sağlam standartlar tanımlanmaya devam etmektedir. Kolit analiz yöntemlerinin çoğu, küçük bağırsak segmentlerinin sınırlı histolojik puanlamasına dayanır ve kısmi veya taraflı analizlere yol açar. Burada, dektran sodyum sülfat (DSS) kaynaklı murine kolit modelinde bağırsak yaralanması ve ülserasyonunu ölçmek için tüm kolonun yüksek çözünürlüklü görüntü alımını ve boyuna analizini birleştiriyoruz. Bu protokol, kapsamlı kullanıcı eğitimi olmadan objektif ve tekrarlanabilir sonuçların üretilmesine izin verir. Burada, DSS kaynaklı kolitten elde edilen verilerin örneklerini kullanarak numune hazırlama ve görüntü analizi hakkında kapsamlı ayrıntılar sunuyoruz. Bu yöntem, mukozal yaralanma ile ilişkili önemli inflamasyona sahip diğer murine kolit modellerine kolayca uyarlanabilir. Kolonun tam uzunluğuna göre iltihaplı/yaralı ve aşınmış/ülserli mukoza fraksiyonunun DSS kaynaklı hastalık ilerlemesi sırasında kilo kaybı gibi klinik bulgularla yakından paralellik gösterdiğini gösteriyoruz. Bu histolojik protokol, DSS kolit deneylerinde hastalık aktivitesinin analizlerini tarafsız bir şekilde standartlaştırmak için güvenilir bir zaman ve uygun maliyetli yardım sağlar.

Bu Histolojik Kolit Skor Analizinin güvenilirliğini DSS meydan okuması ve daha sonra kolitten iyileşmeden sonra mukozal hasar bağlamında göstermek için, 5 gün boyunca sekiz 10 haftalık erkek C57BL6 vahşi tip farelerin içme suyunda% 2.5 DSS uyguladık ve ardından 5 gün boyunca düzenli su ile bir geri kazanım süresi uyguladık. DSS'nin akut yönetimi sırasında vücut ağırlığında 0'dan 5'e kadar bir değişiklik olmadı (Şekil 4A). Vücut ağırlığı, farelerin düzenli mus...

Ücretsiz bilgisayar destekli bir sistem kullanılarak bağırsak iltihabının sistematik olarak puanlanması, ülser ve enflamatuar değişikliklerin varlığı ile karakterize kolit modellerindeki histopatolojik değişiklikleri nicel olarak karşılaştırmak için güçlü bir araçtır. Histolojik kolit skoru değerlendirmesi klinik gözlemleri güçlendirir ve veri yorumlamayı kolaylaştırır.

Murine Dextran Sodyum Sülfat Kaynaklı Kolit Modelinde Bağırsak İltihabı İçin Sistematik Puanlama Analizi

Murine colitis models are tools that are extensively employed in studies focused on understanding the pathobiology of inflammatory intestinal disorders. ...

Sistematik puanlama analizi, mukozal hasarı değerlendirmek, eğitimli araştırmacılar tarafından yapılabilen histolojik yorumlamayı kolaylaştırmak için kullanılan bir tekniktir. Bu yöntemin ana avantajları ücretsiz ve kullanımı kolay olmasıdır. Kolitli farelerin bağırsaklarından elde edilen histolojik verilerin nicel analizine izin verir.Bu protokol, farklı genetik geçmişlere sahip hayvanlardan gelen hastalıkları karşılaştırmak için gerekli olan tüm kolonun hastalık şiddetini yorumlamak için hızlı ve tekrarlanabilir bir yol sağlar. Doku hazırlığı için tüm reaktifleri ve malzemeleri düzenlemek önemlidir. Ötenazili bir fareyi bir diseksiyon pedi üzerine supine pozisyonunda yerleştirerek başlayın ve 20 ölçer 1,5 inç iğneler kullanarak fare ekstremitelerini hareketsiz hale getirin.Önseçim ve makas kullanarak karın derisinde küçük bir kesi yapın ve peritona maruz bırakmak için yana çekin, ardından kasık kemiğinden karın kenarlarına kadar peritonda orta çizgi kesi ile karın boşluğunu açın. Kalın bağırsak görselleşene kadar dokuları ve organları dikkatlice çıkarın. Organı tamamen görselleştirmek için kolonun her iki tarafındaki pelvik kemiği kesin, anüsten cecum'a doğru uzanın.Organı dikkatlice parçalarken kolona bağlı yağları, küçük damarları ve arterleri yavaşça çıkarın, anüse sadece proksimal ve obtal olarak kesin. Anüsten yerleştirilmiş esnek bir plastik gavage iğnesi kullanarak dışkı içeriğini çıkarmak için kolonu PBS ile dikkatlice yıkayın. Kolonu düz bir çizgiye yerleştirin ve mezenterik arter boyunca uzunlamasına açın.Kolonu distalden proksimal uca kadar uzunlamasına ikiye ayırın. Dokunun yarısını histolojik analiz için, diğer yarısını batı lekesi, PCR için kullanın veya taze dondurulmuş immünofluoresans mikroskopisi için ikinci bir İsviçre rulosuna yuvarlanın. Tüm kolonun uzunluğu boyunca yaklaşık aynı genişlik elde edilene kadar proksimal kolondan ekstra dokuyu jiletle kesin.Lümeni açığa çıkarmak için kolonu hizalayın ve esnek bir gavage iğnesi kullanarak dokuyu tamamen düzleştirin. İşlem boyunca dokuyu nemli tutmak için gerekirse daha fazla PBS ekleyin. Kağıt mendili kullanarak fazla PBS'yi çıkarın.Bir şırınga ve gavage iğnesi ile, dokuyu sabitlemek ve düzleştirmek için iki ila üç dakika boyunca% 10 nötr tamponlu formalin çözeltisi ekleyin, ardından distal kolonun ucunun ucunun tutun ve kolonu distalden proksimal uca eşmerkezli dairelere bükmek için düz forseps kullanın. Kolonu ortaya sabitlemek ve İsviçre rulo şeklini tutmak için 27 kalibrelik bir iğne yerleştirin, ardından İsviçre rulosunu kasete paralel olarak dokuyu yönlendiren histolojik bir örnek kabın içine gömme bir kasete yerleştirin. Dokuyu dört santigrat derecede bir gecede %10 nötr tamponlanmış formalin çözeltisinde sabitle.Gece sabitlemeden sonra, dokuyu PBS ile üç kez yıkayın. Parafin gömme işleminden önce% 70 etanol ekleyin ve devam etmeden önce iğneyi İsviçre rulosundan çıkarın. Doku, parafin katıştırana kadar oda sıcaklığında etanolde saklanabilir.Taranan görüntüleri görüntü işleme yazılımında açtıktan sonra, iki nokta üst üste işaretinin tamamının görünür olduğunu ve numunenin eksik alanlarının olmadığını doğrulayın. Etiket görüntüleyiiciyi tıklatarak taranan slaytları düzgün bir şekilde tanımlamak için etiket görüntüleyicİsini ve ölçek çubuğu araçlarını etkinleştirin. Ek açıklamalar aracını ek açıklamaları tıklatarak açın ve İsviçre rulosunun toplam uzunluğunu, iltihaplanmayı veya yaralanmayı ve erozyon veya ülserasyonu ölçmek için yeni katmanı tıklatarak üç farklı katman oluşturun.Katman rengini tıklatarak her katman için farklı bir renk seçin. Kas mukozasını izleyen bir çizgi çizmek için kalem aracını tıklatarak, analiz için bitişik alanı görselleştirmek için işaretçiyi gerektiği gibi hareket ettirerek her katmanın veya kategorinin uzunluğunu ölçün. Muscularis mukozasının yeterli görselleştirilmesini kolaylaştırmak için görüntüyü 400 mikrometre yakınlaştırmada görüntüleyin.Kalem her durdurulduğunda, küçük bir yeni katman bölgesi oluşturulur. Katman bölgeleri sekmesiyle görselleştirilebilir ve düzenlenebilir. Referans olarak kas mukozası kullanılarak ölçülen toplam uzunluğu, iltihabı veya yaralanmayı ve erozyon veya ülserasyonu gözden geçirin.Tüm katmanlar tanımlandıktan sonra, katman bölgeleri seçeneklerinin içindeki metin dosyasına dışa aktarma kılavuzını kullanarak verileri dışa aktarın. Metin dosyalarını açın ve verileri bir elektronik tablo yazılımına kopyalayın. Her bölgedeki tüm segmentleri toplayın ve toplam uzunluğa göre yaralanma ve ülserasyon yüzdesini hesaplayın.Histolojik kolit skorunu hesaplamak ve hastalığın şiddetini değerlendirmek için üç ana özelliği göz önünde bulundurun. Kripto luminal eksendeki organize epitel hücreleri, az sayıda bağışıklık hücresine sahip lamina propria ve subjacent muscularis mukozası ile karakterize sağlıklı bağırsak mukozasını kontrol edin. Daha sonra, zayıflatılmış veya kısmen eksik epitel hücreleri ve kriptolara nötrofil infiltrasyonlu mukozal inflamasyon ile karakterize edilen iltihap veya yaralanma olup olmadığını kontrol edin.Son olarak, yüzey epitelden yoksun alanlar veya ilişkili lökositler ile veya ilişkili lökositler olmadan epitel mahzenlerinden tamamen yoksun alanlarla karakterize edilen erozyon veya ülserasyon varlığını kontrol edin. Bu histolojik kolit skor analizinin mukozal hasar bağlamında güvenilirliğini göstermek için, sekiz C57BL6 yabani tip farenin içme suyunda beş gün boyunca% 2.5 DSS uygulandı ve ardından beş gün boyunca düzenli su ile bir geri kazanım süresi uygulandı. DSS'nin akut yönetimi sırasında vücut ağırlığı sabit kaldı, ancak fareler düzenli musluk suyu içmeye başladığında önemli ölçüde azaldı.Kan ve yumuşak dışkı üç günlük DSS yönetiminden sonra ortaya çıktı ve deneyin sekizinci gününe kadar devam etti. Bu gözlemler, DSS'ye maruz kalmanın en zararlı etkilerinin beş ila sekiz gün arasındaki iyileşme döneminde gözlendiğini ileri sürmektedir. 10. günde kolon uzunluğunun ölçümü, deneyin sonunda önemli bir kısalma olduğunu doğruladı.Kolonlar sıfır, iki, beş, yedi, sekiz ve 10 günde parafin İsviçre ruloları yapmak için hasat edildi. Doku H&E ile boyandı ve histolojik kolit skoru ile yaralanma ve ülserasyon yüzdesini hesaplamak için yüksek çözünürlüklü taramalar analiz edildi. Tedavi edilmeyen farelerde normal mahzen mimarisi gözlendi.İki günlük DSS yönetiminden sonra bağışıklık hücresi alımı gözlendi. Beşinci günde, epitel hücreleri hasarlı görünür ve epitel yaralanması ile ilişkili epitel boyunca nötrofillerin sızması vardı. Beşinci günden sekize kadar iltihaplanma ve ülserasyon ile epitel kaybı bölgeleri gözlendi.10. günde, epitel hücreleri ülserli bölgeleri yenilemeye ve yeniden doldurmaya başladı ve kolonik mukozayı yavaşça geri yükledi. Bu protokolü denerken, düzgün yönlendirilmiş ve iyi korunmuş bir İsviçre rulosu oluşturmak ve mukozal inflamasyonu veya yaralanmayı ve ülserasyon veya erozyonu doğru bir şekilde tanımlamak önemlidir. Bu yöntem, TMS veya T hücre transfer modeli gibi diğer kolit modellerinde kolonik mukozanın tüm uzunluğu boyunca yaralanmayı nicel olarak değerlendirmek için kullanılabilir.

systematic-scoring-analysis-for-intestinal-inflammation-murine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Içme suyu uygulanan dekstran sülfat sodyum (DSS), akut kolit kurulmuş bir fare inflamatuar yaralanma modeli. Bu protokol, DSS tedavi ve dokuların hazırlanması için yöntemi özetlemektedir.

Dekstran Sülfat Sodyum (DSS) kullanarak murin Kolit Modelleme

Deneysel modeller inflamatuvar barsak hastalığı patogenezi ile ilişkili karmaşık doğal ve adaptif immün yanıtları incelemek için izin verdiler. Histolojik skorlama, pro-inflamatuar sitokinler ve miyeloperoksidaz aktivitesi ölçümü kullanarak, inflamatuvar barsak hastalığı görülen bu yanıtlar değerlendirmeye başlayabilirsiniz.

İBH DSS-kaynaklı Modeli Bağırsak Enflamasyon incelenmesi

Bu video, inflamatuar bir bağırsak hastalığı olan kimyasal kaynaklı bir kolit murin modeli oluşturmak için bir teknik göstermektedir. Farenin yeterli bir süre boyunca bir dekstran sodyum sülfat (DSS) çözeltisi tüketmesine izin verilir. Tüketildikten sonra, DSS kolondaki mukus ve epitel tabakası bariyerine zarar vererek, bağırsak mikroplarının alttaki dokuya girmesine izin verir - burada yerleşik bağışıklık hücreleri tarafından abartılı bir bağışıklık tepkisine aracılık etmek için algılanırlar...

Dekstran Sülfat Sodyum Kaynaklı Kolitin Murin Modelini Oluşturmak İçin Bir Teknik

Bu video, inflamatuar bir bağırsak hastalığı olan DSS'nin neden olduğu kolitin bir fare modelinde kolon hasarını değerlendirmek için hematoksilen ve eozin (H&amp;E) boyama yöntemini göstermektedir. Kolonu DSS ile tedavi edilen bir fareden izole ettikten ve dokunun bölümlerini elde ettikten sonra, bölümlerin H&amp;E boyaması, inflamasyonun aracılı doku hasarını tanımlamaya yardımcı olur.

DSS'nin Neden Olduğu Kolitte Kolon Hasarını Değerlendirmek için Hematoksilen ve Eozin Boyama

Bu video, fare kolon dokusunun immünohistokimyasal boyanması yoluyla kimyasal kaynaklı kolitin değerlendirmesini göstermektedir. Lekeli bir doku bölümünde, hasarlı dokuda çok sayıda bağışıklığa duyarlı hücrenin varlığı, kolit sırasında bağışıklık hücrelerinin infiltrasyonunu temsil eder.

Kolon Dokusu Kesitlerinin İmmünohistokimyasal Analizi ile Kimyasal Kaynaklı Kolitin Değerlendirilmesi

Son birkaç yılda, yeni nesil endoskoplar kemirgen kolit ve kolorektal tümörlerin değerlendirilmesinde önemli bir tanı araştırma yardımcıları olarak ortaya çıkmıştır. Bu farelerde enflamasyonun ve kolorektal tümörleri endoskopik değerlendirme, hem de kolit ve kolorektal tümörleri endoskopik şiddetini belge ondalık tanımlayıcıları kullanan yeni bir skorlama sistemi için bu tarifnamede detaylı bir protokol mevcut.

Bir Geçerliliği Endoskopik Puanlama Sisteminin Kullanılması Kolit ve Kolorektal Tümörlerin Şiddetini Değerlendirmek için Farelerde esnek Kolonoskopi

enflamatuvar bağırsak hastalığı (IBD) Mevcut tedaviler, hastalığın semptomlarını hafifletmek amaçlamaktadır, ancak ciddi yan etkilere neden olabilir. Böylece, alternatif stratejiler hayvan kolit modellerinde araştırılmaktadır. Burada, klinik IBD işaretleri diyet takviyeleri yararlı etkileri böyle bir kolit modelinde analiz edilmektedir açıklar.

Deneysel Kolit sırasında Bağırsak epitel Bariyer Fonksiyonları Üzerine Ek Beslenme Faydalı Etkileri Analizi

Hedef özgü probları protein ifade çeşitli hastalık (Örneğin, iltihap, enfeksiyon ve tumorigenesis) gibi moleküler mekanizmaları analiz etmek için yenilikçi bir araç temsil eder. Bu çalışmada, bağırsak makrofaj infiltrasyonu F4/80 özel tomografi Floresans aracılı kullanarak kolit, fare modeli üç boyutlu bir nicel tomografik değerlendirilmesi açıklar.

Floresan-aracılı tomografi algılama ve fare bağırsak iltihabı makrofaj ile ilgili miktar

Belirli fare doku işleme için fare histopatolojik analiz insan numuneler ile karşılaştırıldığında kalitesini azaltır. Burada, robot sistemleri işleme ve insan örnekleri katıştırma için rutin olarak kullanılan fizibilite göstermek için fare iltihaplı ve uninflamed kolon dokularında histopatolojik incelenmesi gerçekleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut.

Robot sistemleri kullanarak işlemek ve histolojik analizler için kolon fare örnekleri katıştır

Bu yazıda, aorta bağışıklık kompozisyonu araştırmak için flow sitometri tabanlı bir yöntem sunmaktadır. Kağıt aynı zamanda çevresindeki adventisya ve damar duvarında ayrı ayrı inceleyerek sağlayan ek bir teknik göstermektedir. Bu yöntem, aort lökositlerin fenotipik analizler gerçekleştirmek ve ateroskleroz çalışmalar için çeşitli immünolojik testleri uygulamak için imkanlar açılır.

Bağışıklık Hücreleri murin aorta içinde Sitometrisi Analizi

Keşfedin DSS ile indüklenen fare kolitinde mukozal hasarın sistematik, niceliksel değerlendirmesi için dijital görüntü analizi protokolü. Bu yöntem, tüm kolon boyunca objektif ve tekrarlanabilir histolojik skorlama sağlar.

Murine Dextran Sodyum Sülfat Kaynaklı Kolit Modelinde Bağırsak İltihabı İçin Sistematik Puanlama Analizi

Daha fazla video keşfet