Name: EcoHIV Beyin Enfeksiyonunun Bir Sıçan Modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Öğrenin, EcoHIV kullanarak sıçanlarda aktif HIV enfeksiyonu modeli geliştirme yöntemini. Bu protokol, HIV-1 ile ilişkili nörolojik bozuklukları ve ilaç bağımlılığı komorbiditelerini incelemek için mikroglial hedefleme ve sinaptik değişiklikleri sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH tarafından HD043680, MH106392, DA013137 ve NS100624 hibeleri tarafından finanse edildi.

Tüm hayvan protokolleri Güney Carolina Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından gözden geçirildi ve onaylandı (federal güvence numarası: D16-00028). Altı yetişkin erkek F344/N sıçanı, 12/12 ışık altında kontrollü bir ortamda barındırıldı: yiyecek ve suya ad libitum erişimi olan karanlık döngü. Tüm hayvanlara, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi'nde Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından oluşturulan yönergeler kullanılarak bakıldı.
1. 293 FT hücrelerde virüs paketleme
<ol><li>Kültür 293 FT hücreleri (5×105/mL) jelatin kaplı 75 cm2 şişeler ile DMEM artı% 10 FBS11. 37 °C'de hücreleri transfeksiyonda %50 birikecek şekilde büyütün.</li>
	<li>22,5 μL transfeksiyon reaktifini (örneğin Lipofectamine 3000) 750 μL orta (örneğin, Opti-MEM) 1,5 mL mikro santrifüj tüpünde ve girdapta 3 sn seyreltin.</li>
	<li>20 μg EcoHIV plazmid DNA'yı 1,5 mL mikro santrifüj tüpünde 750 μL orta derecede seyreltin ve iyice karıştırın.</li>
	<li>Seyreltilmiş transfeksiyon reaktifinin tüpüne seyreltilmiş DNA ekleyin ve hafifçe karıştırın. Oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatır.</li>
	<li>Karışımı 75 cm2 şişede 10 mL önceden ısıtilmiş DMEM ortamına ekleyin. Hücreleri 37 °C'de 2 gün kuluçkaya yatır.</li>
	<li>Paketlenmiş lentivirüs içeren iki şişeden 24 mL koşullu ortamı hasat edin ve birleştirin.</li>
	<li>24 mL'lik koşullu ortamın tamamını 500 x g'da 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Netleştirilmiş süpernatantı steril 50 mL tüpe aktarın.</li>
	<li>8 mL Lenti-x konsantratörü 24 mL netleştirilmiş süpernatant (1:3 oran) ile birleştirin. Nazik bir ters çevirme ile karıştırın. Karışımı iki gün boyunca 4 °C'de kuluçkaya yatır.</li>
	<li>4 °C'de 45 dakika boyunca 1.500 x g'da santrifüj karışımı. Üst saltanayı dikkatlice çıkarın.</li>
	<li>Peleti 100 μL 100 mM PBS ile hafifçe yeniden askıya alın.</li>
	<li>P24 ELISA kiti ile titer virüs konsantrasyonu.</li>
</ol>2. EcoHIV-EGFP virüs stereotaksik ameliyatları
<ol><li>% 3 sevoflurane kullanarak sıçanları uyuşturmak. Sıçanlar zararlı uyaranlara yanıt vermediğinde ve refleksler olmadığında 2.2 adımına geçin.</li>
	<li>Beyin bölgesindeki kılları tıraş edin ve cildi% 70 etanol ve klorheksidin bazlı bir ovma ile iki kez sterilize edin. Sıçanı stereotaksik aparatta eğilimli bir pozisyonda sabitleyin.</li>
	<li>Kafa derisi orta çizgisi boyunca ciltten bir kesi (5-6 cm) yapın.</li>
	<li>0,8 mm yanal, 1,2 mm rostral ve bregma olmak üzere iki delme pozisyonunu işaretleyin. Her kafatası pozisyonunda bir delik (çap 0,4 mm) delin.</li>
	<li>Titrek EcoHIV lentivirüs çözeltisini (1,04 ×10 6 TU/mL) 10 μL enjeksiyon şırındında doldurun. Şırınnayı stereotaksik aparatlara sabitleyin.</li>
	<li>İğneyi delme deliğinin yüzeyine yakın bir yere taşıyın. 2,5 mm derinlikte ölçün ve hareket ettinin.</li>
	<li>1 μL virüs çözeltisinin 0,2 μL/dak hızında demleyin. İğneyi enjeksiyon bölgesinin içinde 5 dakika tutun. İğneyi fare kafatasının dışına gelene kadar yavaşça yukarı hareket ettirin.</li>
	<li>Cildi 4-0 ipek iplikle dikin.</li>
	<li>Kesiği bir kez% 70 etanol ile sterilize edin. Deri altı enjekte butorfenol (Dorolex, 0.1 mg/kg vücut ağırlığı).</li>
	<li>Sıçanı uyanana kadar bir ısıtma yastığı ile bir kurtarma odasına aktarın.</li>
</ol>3. Beyin bölümlerinin görselleştirilmesi
NOT: EcoHIV viral infüzyondan sonra bir ila sekiz hafta bekleyin.
<ol><li>Sıçanı% 5 sevoflurane ile uyuşturun. Sıçanlar zararlı uyaranlara duyarlı olmadığında ve refleksler olmadığında 3.2 adımına devam edin.</li>
	<li>Sıçanı duman kaputunun içinde bir supine pozisyonunda sabitle.</li>
	<li>Cildi torasik orta hat boyunca inzivaya çeker. Diyaframı kesin ve torasik boşluğu açın.</li>
	<li>Sol ventrikül içine 20 G × 25 mm iğne yerleştirin.</li>
	<li>Hemen sağ atriyumu makasla açın.</li>
	<li>5 mL/dk hızında 50 mL ön yokuşlu 100 mM PBS'ye nüfuz edin.</li>
	<li>5 mL/ dk hızında 100 mL soğuk% 4 paraformaldehit perfuse.</li>
	<li>Farenin kafasını kopar, kafa derisini aç ve beyni çıkar.</li>
	<li>%4 paraformaldehit ile bir gecede postfix.</li>
	<li>Beyin dibe (yaklaşık 3 gün) inene kadar beyni 50 mL tüpte 100 mM PBS'de% 30 sakkarozun 40 mL'sine aktarın.</li>
	<li>Snap, beyni metilbutanolde 2 dakika - 80 ° C'de dondurun.</li>
	<li>Beyin dokusunu -20 °C kriyostat içindeki metal bir platformda sabitleyin.</li>
	<li>Kriyostat kullanarak 50 μm kalınlığında koronal bölümleri kesin.</li>
	<li>Beyin dilimlerini ince bir fırça ile cam slaytlara aktarın.</li>
	<li>Bölümleri 0,3 mL antifad orta ve kapak 22 mm 50 mm kapaklı monte edin.</li>
	<li>Cam kaydıraları kuruyana kadar oda sıcaklığında karanlıkta tutun.</li>
	<li>Hedeflenen nöronları, beyin bölgesi sınırlarına ve nöronların morfolojik özelliklerine göre Z yığını kullanarak konfokal mikroskopla görüntüleyin. NOT: Kullanılan konfokal mikroskop ayarları: 60 X (A/1.4, yağ) büyütme ve 488 nm dalga boyu kullanılarak 0.15 μm Z düzlemi aralığı (iğne deliği boyutu 30 μm; geri yansıtılmış iğne deliği yarıçapı 167 nm).</li>
</ol>

<ol><li>Illenberger, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+Infection+and+Neurocognitive+Disorders+in+the+Context+of+Chronic+Drug+Abuse%3A+Evidence+for+Divergent+Findings+Dependent+upon+Prior+Drug+History%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">HIV Infection and Neurocognitive Disorders in the Context of Chronic Drug Abuse: Evidence for Divergent Findings Dependent upon Prior Drug History.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (4), 715-728 (2020).</li>
<li>Joseph, S. B., Swanstrom, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+HIV-1+entry+phenotypes+as+a+guide+to+changing+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">The evolution of HIV-1 entry phenotypes as a guide to changing target cells.</a> Journal of Leukocyte Biology. 103 (3), 421-431 (2018).</li>
<li>Potash, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+study+of+systemic+HIV-1+infection%2C+antiviral+immune+responses%2C+and+neuroinvasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A mouse model for study of systemic HIV-1 infection, antiviral immune responses, and neuroinvasiveness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (10), 3760-3765 (2005).</li>
<li>Albritton, L. M., Tseng, L., Scadden, D., Cunningham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+putative+murine+ecotropic+retrovirus+receptor+gene+encodes+a+multiple+membrane-spanning+protein+and+confers+susceptibility+to+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A putative murine ecotropic retrovirus receptor gene encodes a multiple membrane-spanning protein and confers susceptibility to virus infection.</a> Cell. 57, 659-666 (1989).</li>
<li>Geraghty, P., Hadas, E., Kim, B. H., Dabo, A. J., Volsky, D. J., Foronjy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+infection+model+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">HIV infection model of chronic obstructive pulmonary disease in mice.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (4), 500-509 (2017).</li>
<li>Gu, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EcoHIV+infection+of+mice+establishes+latent+viral+reservoirs+in+T+cells+and+active+viral+reservoirs+in+macrophages+that+are+sufficient+for+induction+of+neurocognitive+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">EcoHIV infection of mice establishes latent viral reservoirs in T cells and active viral reservoirs in macrophages that are sufficient for induction of neurocognitive impairment.</a> PLoS Pathogens. 14 (6), 1007061(2018).</li>
<li>Ellenbroek, B., Youn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+in+neuroscience+research%3A+is+it+a+rat+race%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models%2C+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Rodent models in neuroscience research: is it a rat race.</a> Disease Models, Mechanisms. 9 (10), 1079-1087 (2016).</li>
<li>Feduccia, A. A., Duvauchelle, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+apparatus+and+method+for+drug+reinforcement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Novel apparatus and method for drug reinforcement.</a> Journal of Visualized Experiments. (42), e1998(2010).</li>
<li>Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+proteins+dysregulate+motivational+processes+and+dopamine+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7869(2018).</li>
<li>McGaughy, J., Sarter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+vigilance+in+rats%3A+task+validation+and+effects+of+age%2C+amphetamine%2C+and+benzodiazepine+receptor+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Psychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Behavioral vigilance in rats: task validation and effects of age, amphetamine, and benzodiazepine receptor ligands.</a> Psychopharmacology. 117 (3), Berl. 340-357 (1995).</li>
<li>Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+filamentous+actin+%28F-actin%29+puncta+in+rat+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Quantification of filamentous actin (F-actin) puncta in rat cortical neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), (2016).</li>
<li>McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Timing%3A+NeuroHIV+Progression+in+the+Post-cART+Era%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era.</a> Scientific Reports. 9 (1), 827(2019).</li>
<li>McLaurin, K. A., Moran, L. M., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Power+of+Interstimulus+Interval+for+the+Assessment+of+Temporal+Processing+in+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), e58659(2019).</li>
<li>Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ballistic+Labeling+of+Pyramidal+Neurons+in+Brain+Slices+and+in+Primary+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (158), (2020).</li>
<li>Ko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+but+not+Astrocytes+Harbor+HIV+DNA+in+the+Brains+of+HIV-1-Infected+Aviremic+Individuals+on+Suppressive+Antiretroviral+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmune+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Macrophages but not Astrocytes Harbor HIV DNA in the Brains of HIV-1-Infected Aviremic Individuals on Suppressive Antiretroviral Therapy.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 110-119 (2019).</li>
<li>Sopper, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+simian+immunodeficiency+virus+infection+in+vitro+and+in+vivo+on+the+cytokine+production+of+isolated+microglia+and+peripheral+macrophages+from+rhesus+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">The effect of simian immunodeficiency virus infection in vitro and in vivo on the cytokine production of isolated microglia and peripheral macrophages from rhesus monkey.</a> Virology. 220 (2), 320-329 (1996).</li>
<li>Llewellyn, G. N., Alvarez-Carbonell, D., Chateau, M., Karn, J., Cannon, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+infection+of+microglial+cells+in+a+reconstituted+humanized+mouse+model+and+identification+of+compounds+that+selectively+reverse+HIV+latency%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+NeuroVirology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 infection of microglial cells in a reconstituted humanized mouse model and identification of compounds that selectively reverse HIV latency.</a> Journal of NeuroVirology. 24 (2), 192-203 (2018).</li>
</ol>

Yazarların hiçbirinin beyan edecekleri çıkar çatışmaları yoktur.

Bu protokolde sıçanlarda EcoHIV kaynaklı HIV enfeksiyon modeli oluşturduk. Özellikle, enjeksiyondan 7 gün sonra sıçan beyninde aktif HIV enfeksiyonunu başarıyla indükleyen kortekse bilateral stereotaksik ecohiv enjeksiyonu tanımladık. Ayrıca, sıçanlarda EcoHIV enfeksiyonunun HAND'in temel yönlerini incelemek için iyi bir biyolojik sistem olabileceğini gösteriyoruz. Sekiz hafta sonra- EcoHIV enfeksiyonu, sıçanlar NAc MSN'lerinde zamansal işleme ve sinaptik disfonksiyondaki değişiklikleri içeren önemli nöroknaknitif bozukl...

Biyolojik sistemler HIV-1 ilişkili nöroklasitif bozukluklar (EL) ve bunların altında kalan sinirsel mekanizmalar hakkındaki anlayışımızı geliştirmiştir2. Herhangi bir çalışma için hangi biyolojik sistemin en uygun olduğunu belirlemek genellikle ilgi sorusuna bağlıdır2. Konak hayvan modellerinin çeşitliliğinin sınırlandırılması HIV-1 hastalığı gelişimi çalışmalarına meydan okuyor. HIV-1 viral replikasyonu ve patogenezini araştırmak için Potash ve ark.3, HIV yüzey zarfı glikoprotein kodlama bölgesi gp120'yi farelerde başarılı viral replikasyona yol açan ekotropik MLV gp80 ile değiştirerek aktifHIV-1enfeksiyonunun bir fare modelini oluşturdu 4 . Kimerik HIV (EcoHIV) farelerinde kuyruk damarı enjeksiyonlarından sonra, HIV-1 seropositive bireylerinkine benzeyen birçok özellik gözlenmiştir (örneğin, antiviral immün yanıtlar için hedeflenen enfekte lenfositler ve makrofajlar ve iltihap3,5,6).
Fareler ve sıçanlar Muridae'nin her ikisi de üyesi olmasına rağmen, temel tür farklılıkları belirli deneysel sorulara uygunluklarını etkileyebilir7. Bu nedenle, EcoHIV enfeksiyon modelinin sıçanlara uzatılması (yaygın olarak ilaç kötüye kullanımı ve nöroknatif bozukluk çalışmalarında kullanılır) nöroHIV çalışmasında avantajlı olacaktır. Örneğin, daha büyük boyutları, ilaç kendi kendine uygulama prosedürleri için juguler kateter implantasyonunu daha pratik hale getirir8. HIV-19'da motivasyonun değerlendirilmesi için sıçanlarda ilaçkendi kendine uygulama teknikleri kullanılmıştır. Ayrıca, birçok nöroknatif / davranışsal görev başlangıçta sıçanlar için tasarlanmıştır10. Burada, EcoHIV enfeksiyon modelini genişletmek ve neuroHIV ve HAND ile ilgili yeni soruları ele almak için önemli bir fırsat sağlamak için sıçanlarda EcoHIV'in stereotaksik enjeksiyonlarının kullanımını rapor ediyoruz.

<table><tbody><tr><td>293FT hücreleri</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik-Antimikotik çözelti</td><td>Cellgro</td><td>30004CI</td><td>100X</td></tr><tr><td>Corning BioCoatJelatin 75cm&sup2; Havalandırmalı Kapaklı Dikdörtgen Eğimli Boyun Hücre Kültürü Şişesi</td><td>Life Technologies</td><td>354488</td><td></td></tr><tr><td>Corning DMEM, L-Glutamin, 4.5 g/L Glikoz ve Sodyum Piruvat</td><td>ile Yaşam Teknolojileri</td><td>10013CV</td><td></td></tr><tr><td>Kapak camı</td><td>VWR</td><td>637-137</td><td></td></tr><tr><td>matkap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forseps</td><td>Dünyası Hassas Aletler</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 Forseps Dünyası</td><td>Hassas Aletler</td><td>14097</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Snap-Cap Mikrosantrifüj Biopur Güvenli Kilit Tüpleri</td><td>Life Technologies</td><td>22600028</td><td></td></tr><tr><td>Ethicon Vicryl Plus Antibakteriyel, 4-0 Polyglactin 910 Sütür, 27in. FS-2</td><td>Med Vet International</td><td>VCP422H</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton şırınga</td><td>Hamilton</td><td>1701</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Lipofektamin 3000 Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>İris Forseps</td><td>Dünyası Hassas Aletler</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>İris Makas</td><td>Dünyası Hassas Aletler</td><td>500216</td><td></td></tr><tr><td>Lentivirus ile İlişkili p24 ELISA Kiti</td><td>Cell Biolabs, inc.</td><td>VPK-107-5</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X Konsantratör</td><td>Takara</td><td>PT4421-2</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Azaltılmış Serum Orta Ömürlü</td><td>Teknolojiler</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurane</td><td>Merritt Veteriner Malzemeleri</td><td>347075</td><td></td></tr><tr><td>stereotaksik cihaz</td><td>Kopf Instruments</td><td>Model 900</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Slaytlar</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-154%</td><td></td></tr> <tr><td>Vannas Makas</td><td>Dünyası Hassas Aletler</td><td>500086</td><td></td></tr></tbody></table>

ecohiv beyin enfeksiyonunun bir sıçan modeli

A Rat Model of EcoHIV Brain Infection

EcoHIV enfekte fare modelinin HIV ile ilişkili nörolojik komplikasyonların araştırılmasında önemli bir yararı olduğu iyi incelenmiştir. İlaç kötüye kullanımı ve nöroknasitif bozukluklar çalışmaları için EcoHIV enfekte sıçan modelinin kurulması, nöroHIV ve HIV-1 ilişkili nörokinetif bozuklukların (EL) çalışmasında faydalı olacaktır. Bu çalışmada, kimerik HIV (EcoHIV) kullanılarak aktif HIV enfeksiyonunun sıçan modelinin başarılı bir şekilde oluşturulduğunu göstermektedir. İlk olarak, EcoHIV'in lentiviral yapısı 48 saat boyunca kültürlü 293 FT hücrelerde paketlendi. Daha sonra, koşullu ortam yoğunlaştı ve titretildi. Daha sonra, EcoHIV-EGFP'nin F344/N sıçan beyin dokusuna bilateral stereotaksik enjeksiyonlarını gerçekleştirdik. Enfeksiyondan bir hafta sonra, enfekte beyin dokusunda EGFP floresan sinyalleri tespit edildi ve bu da EcoHIV'in sıçanlarda aktif bir HIV enfeksiyonunu başarıyla teşvik ettiğini gösterdi. Ayrıca Iba1 mikroglial hücre belirteci için immünostaining yapıldı. Sonuçlar, mikroglianın EcoHIV'i barındıran baskın hücre tipi olduğunu gösterdi. Ayrıca, EcoHIV sıçanları, HAND'in potansiyel bir nörobehavioral mekanizması olan zamansal işlemde ve enfeksiyondan sekiz hafta sonra sinaptik disfonksiyonda değişiklikler gösterdi. Toplu olarak, bu çalışma HIV-1 enfeksiyonunun EcoHIV modelini, beyindeki HIV-1 viral rezervuarlarını ve EL'i ve uyuşturucu kullanımı gibi ilişkili komorbiditeleri incelemek için değerli bir biyolojik sistem sunan sıçana genişletmektedir.

Şartlandırılmış ortam, EcoHIV-EGFP enfekte 293FT hücrelerinin lentivirüslerinden toplanmıştır. Daha sonra konsantre edildi ve titretildi, daha sonra stereotaksik olarak F344/N sıçanlarının beynine (kortikal bölge) enjekte edildi. Enjeksiyondan yedi gün sonra sıçanlar kurban edildi ve bregma 5.64 mm'den bregma -4.68 mm'ye kadar değişen koronal beyin dilimlerinden görüntüler alındı. Şekil 1A'da, beyinde, özellikle korteks ve hipokampal dentat girusunda önemli EcoHIV-EGFP sinyalleri vardır. Ayr...

Burada, beyindeki HIV-1 viral rezervuarlarını anlamamızı geliştirmek ve HIV ile ilişkili nöroknaktif bozuklukları ve ilişkili komorbiditeleri (yani uyuşturucu bağımlılığı) incelemek için bir sistem sunmak için kritik öneme sahip olan kimerik HIV (EcoHIV) kullanarak aktif HIV enfeksiyonunun yeni bir sıçan modelini oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.

EcoHIV Beyin Enfeksiyonunun Bir Sıçan Modeli

It has been well studied that the EcoHIV infected mouse model is of significant utility in investigating HIV associated neurological complications. ...

Sıçanlar kullanılarak, bu protokol kimerik HIV kullanarak aktif HIV enfeksiyonunun yeni bir modelini oluşturmak için kullanılabilir. sıçanlar ile, ilaç kullanımı ve nörobilişsel bozukluklar çalışmaları için EcoHIV enfeksiyon modelinin kurulması nöro HIV ve HIV-1 ilişkili nörobilişsel bozuklukların incelenmesine faydalı olabilir. Prosedürü gösteren Hailong Li olacak, laboratuvarımdan bir araştırma görevlisi.Virüsün 293 T hücresine paketlenmesi için, DMEM mililitresi başına beş çarpı 10 ila beşinci 293 T hücresi, iki jelatin kaplı 75 santimetrekare şişenin her birine% 10 FBS ile desteklenmiştir ve kültürler% 50 izne ulaşana kadar hücreleri 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırmaktadır. Transfeksiyon gününde, 22,5 mikrolitre transfeksiyon reaktifini 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde şişe başına 750 mikrolitre orta derecede seyreltin ve çözeltiyi üç saniye boyunca girdaplayın. Chimeric EcoHIV plazmid DNA'sının 20 mikrogramını 750 mikrolitre orta derecede, şişe başına ikinci bir 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüpünde iyice karıştırarak seyreltin.Seyreltilmiş DNA'yı seyreltilmiş transfeksiyon reaktifi ile nazik karıştırma ile birleştirin ve elde edilen çözeltiyi oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya bırakın. Kuluçkanın sonunda, her virüs süspansiyonunu 10 mililitrelik savaş öncesi DMEM ortamına ekleyin ve her virüs takviyeli çözeltiyi 293 T hücresinden oluşan bir şişeye ekleyin. İki günlük hücre kültüründen sonra, şişelerden gelen süpernatantı santrifüjleme için tek bir 50 mililitre konik tüpte bir araya getirmek ve netleştirilmiş süpernatantı yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarın.Netleştirilmiş süpernatanta sekiz mililitre Lenti-X Konsantratör ekleyin ve yumuşak inversiyonla karıştırın. Dört santigrat derecede iki günlük bir inkübasyondan sonra, karışımı santrifüjleyin ve süpernatantı dikkatlice çıkarın, ardından peleti 100 milimoler PBS'nin 100 mikrolitresi ile hafifçe yeniden kullanın ve virüs konsantrasyonunu titretmek için bir P24 ELISA kiti kullanın. EcoHIV-EGFP enjeksiyonu için, pedal refleksine yanıt eksikliğini onayladıktan sonra, saçları beyin bölgesinden tıraş edin ve maruz kalan cildi% 70 etanol ve klorheksidin bazlı bir ovalama ile iki kez sterilize edin.Sıçanı stereotaksik bir aparatta eğilimli bir pozisyonda sabitleyin ve kafa derisi orta çizgisi boyunca deriden beş ila altı santimetrelik bir kesi yapın. Bregma'ya 0,8 milimetre yanal ve bir 1,2 milimetre rostralde bir delme pozisyonu işaretleyin ve her kafatası pozisyonunda 0,4 milimetre çapında bir delik açın. Titrek EcoHIV Lentivirus çözeltisinin mililitre başına altıncı transdüksiyon ünitelerine 1.04 kez 10 kez 10 mikrolitre enjeksiyon şırıngasına yükleyin ve şırıngayı stereotaksik aparatlara sabitleyin.İğneyi bir delme deliğinin yüzeyine yaklaştırın ve iğneyi deliğe 2,5 mililitre yerleştirin. Dakikada 0,2 mikrolitre virüs oranında bir mikrolitre virüs çözeltisi demleyin. Tüm virüs enjekte edildiğinde, iğneyi fare kafatasının dışına çıkıncaya kadar yavaşça geri çekmeden önce iğneyi enjeksiyon bölgesinin içinde beş dakika bekletin.Cilt kesisini 4-0 ipek iplik dikişi ile kapatın ve çözeltiyi% 70 etanol ile sterilize edin, ardından sıçanı görev süresine kadar izlemeli bir ısıtma yastığı ile bir geri kazanım odasına yerleştirin. Viral infüzyondan bir ila sekiz hafta sonra, pedal refleksine yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra, sıçanı bir duman kaputunun içinde bir supine pozisyonunda sabitlayın ve cildi torasik orta hat boyunca inzivaya getirin. Torasik boşluğu açmak için diyaframı kesin ve sol ventrikül içine 25 milimetrelik bir iğne ile 20 ölçer yerleştirin.Hemen sağ kulakçığı makasla açın ve dakikada beş mililitre debide 50 mililitre önceden soğutulmuş 100 milimoler PBS'yi perfüzyona maruz bırakın. Tüm PBS teslim edildiğinde, 100 mililitre soğuk% 4 paraformaldehit ile perfüzyon. Tüm fiksatif teslim edildiğinde, beyni kafatasından çıkarın ve dokuyu bir gecede taze% 4 paraformaldehitte sabitleyin.Ertesi sabah, örneği 100 milimolar PBS'de% 30 sakkarozun 40 mililitresine, beyin metil butanoldeki beyin dokusunu eksi 80 santigrat derecede iki dakika dondurmadan önce yaklaşık üç gün boyunca 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Donduktan sonra, 50 mikron kalınlığında koronal bölüm elde etmek için eksi 20 santigrat bir kriyostat ve ince bir boya fırçası kullanın. Tüm bölümler elde edildiğinde, numuneleri 300 mikrolitre anti-solmaya karşı orta ile örtün ve 22 adet 50 mililitrelik kapakla monte edin.Ortam kuruduğunda, bölümleri konfokal mikroskopi ile görüntüleyin. Lentivirüs enjeksiyonundan yedi gün sonra, sıçan koroner beyin dilimi görüntüleri, beyin dokusu boyunca, özellikle korteks ve hipokampal dentat girus içinde Önemli miktarda EcoHIV-EGFP sinyali varlığını ortaya koymaktadır. Iba1 ve EcoHIV-EGFP probları ile çift etiketleme, mikroglianın beyinde EcoHIV ekspresyonını barındıran baskın hücre tipi olduğuna dair güçlü kanıtlar sağlar.Enfeksiyondan sekiz hafta sonra, EcoHIV enjekte edilen hayvanlar, tuzlu su kontrollerine kıyasla nispeten daha düz bir aralık fonksiyonu ile kanıtlandıkça, uyaranlar arası aralığın manipülasyonuna görece bir duyarsızlık gösterir. Ek olarak, EcoHIV enjekte edilen sıçanlar, kontrol hayvanlarına göre artan baş ve boyun çaplarına sahip daha kısa dendritik dikenlerin artan göreceli sıklığı ile kanıtlandıkça, dendritik omurga morfolojilerinde derin değişiklikler gösterir. Stereotaksik enjeksiyondan önce durum ortamının konsantrasyonu ve titratingi, deneyler arasında tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçların sağlanması için kritik öneme sahiptir.EcoHIV'in bu spesifik bölgesel stereotaksik enjeksiyonu beyinde etkili bir HIV enfeksiyonu sağlar ve sıçanlarda zamansal işlem açıkları üretir. EcoHIV enfeksiyon modelini genişletmek için sıçanlarda stereotaksik HIV enjeksiyonlarının kullanılması, eldeki nöro HIV ile ilgili yeni soruları ele almak için önemli bir fırsat sürmektedir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Hipoksik-iskemik beyin hasarı için postnatal sıçan modelinde, insan yenidoğan hipoksik iskemik ensefalopati (HIE) köklü bir model. Bu makalede, doğum sonrası sıçan Yavrularda HIE modeli açıklanmaktadır.

Perinatal İskemi Hipoksik İskemik Ensefalopati Modeli

Bu video, deneysel modelde aktif bir HIV enfeksiyonu oluşturmak için virüs RNA'sının konakçı genomuna entegre olduğu, çoğaldığı ve yayıldığı bir farenin beyninin korteksine kimerik HIV virüslerinin enjekte edilmesi prosedürünü göstermektedir.

Bir Sıçan Modelinde Aktif HIV Enfeksiyonu Oluşturulması

Prematüre ensefalopatisi, erken doğumdan kaynaklanan yaralanma ile ilişkili merkezi sinir sistemi anormalliklerini kapsar. Bu rapor, koryoamniyoniti taklit eden in utero geçici sistemik hipoksi-iskemi ve intra-amniyotik lipopolisakkarit uygulamasının (LPS) klinik olarak anlamlı bir sıçan modelini ve enfeksiyöz uyaranların ve plasental underperfüzyonun CNS gelişimi üzerindeki ilişkili etkisini açıklamaktadır.

Prematüre Modelleme Ensefalopati Sıçanlarda İçi amniyotik Lipopolisakkarid ile Prenatal Hipoksi-iskemi kullanma

Burada sunulan protokol, yetişkin erkek Dark Agouti sıçanlarında her iki kortikal yarımkürenin yaygın bir gri madde demyelinasyonunun çoğaltılmasına izin verir. Yöntem, bir kateterin intraserebral implantasyonu, miyelin oligodendrosit glikoproteine karşı subklinik bağışıklama ve implante kateterden pro-enflamatuar sitokin karışımının intraserebral enjeksiyonundan oluşur.

Pro-enflamatuar Sitokinlerin İntraserebral Enjeksiyonu ile İndüklenen Yaygın Serebral Kortikal Demiyelinasyonun Sıçan Modeli

Burada, nöropati gelişimini görüntülemek için bir immünopetik ıCR (Kanser Araştırma Enstitüsü) merkezi sinir sistemi enfeksiyonu murine modeli oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Akut viral ensefalitik bozuklukların aynı hastalık puanları ile izlenmesi, Dang virüse bağlı nöropati içinde vivo göstermek için gerçekleştirilebilir.

Dang humması virüs kaynaklı akut viral Ensefalitis-benzeri hastalık bir Murine modeli

Bu çalışmanın amacı, 1-90 sonrası orta serebral arter oklüzyonu/reperfüzyonu (MCAO/R) sonrası beyin enfarktüsü ve sensorimotor fonksiyonunu test ederek beyin iskemisinin iyileşme ve sekel evrelerinde araştırma için bir hayvan modeli oluşturmak ve doğrulamaktır. farelerde gün.

Sıçanlarda Akut İnme Sonrası Beyin İyileşmesini Değerlendiren Bir Preklinik Model

Burada, hedef moleküllerin sağlam beyin yapılarının bir parçası olarak görüntülenmesini sağlayan hidrofobik bir doku temizleme yöntemi sunuyoruz. Bu teknik artık F344/N kontrolü ve her iki cinsiyetten HIV-1 transgenik sıçanlar için onaylanmıştır.

Sıçan Beyin Dokusu için Hidrofobik Doku Temizleme Yöntemi

Posthemorajik prematüre hidrosefali (PHHP), koryoamniyonit ve intraventriküler kanama kombine edilerek neonatal sıçanlarda modellenebilir. Bu doğum öncesi ve doğum sonrası olayların kombinasyonu, yaşam boyu makrosefali, ventrikülomegali ve yüksek kafa içi basınç dahil olmak üzere PHHP'nin klinik özelliklerini doğru bir şekilde özetler.

Sıçanlarda Prematüre Posthemorajik Hidrosefalisinin Modellenmesi

Bu protokol, EcoHIV enfeksiyonunun Tmem119-EGFP fareleri ile kombinasyonunun, HIV ile ilişkili nörobilişsel bozuklukların kemirgen modellerinde mikroglial değişiklikleri ve viral rezervuarları araştırmak için nasıl değerli bir biyolojik sistem sunduğunu açıklar.

Mikroglia ile Manipüle Edilmiş Transgenik Farelerde EcoHIV ile Enfekte Hücrelerin Tanımlanması

Bu makale, hem mani benzeri hem de depresif benzeri davranışları yakalayan benzersiz bir sıçan bipolar bozukluk modelinin indüksiyonu için bir protokol sunmaktadır.

Bipolar Bozukluk için Bir Sıçan Modeli Geliştirme

Öğrenin, EcoHIV kullanarak sıçanlarda aktif HIV enfeksiyonu modeli geliştirme yöntemini. Bu protokol, HIV-1 ile ilişkili nörolojik bozuklukları ve ilaç bağımlılığı komorbiditelerini incelemek için mikroglial hedefleme ve sinaptik değişiklikleri sağlar.

EcoHIV Beyin Enfeksiyonunun Bir Sıçan Modeli

Daha fazla video keşfet