CRISPR/CasRx kullanarak Drosophila Melanogaster'da Her Yerde ve Dokuya Özgü RNA Hedeflemesi

Bu makalede, sineklerde RNA hedefleme cas13d enzimini (RfxCas13D) kullanmak için ayrıntılı bir protokol özetlenmiştir.

Protokolümüzün gösterdiği gibi CRISPR CasRx teknolojileri, meyve sineklerinde her yerde bulunan ve dokuya özgü gen transkriptinde azalmalar elde etmek için kullanılabilir. Tekniğimiz, daha fazla özelleştirme ve optimizasyon ile uyumlu olurken meyve sineklerinde CRISPR tabanlı gen transkript azaltma kullanmak isteyen herkes için bir başlangıç paketi sunar. İki bileşenli casrx sistemi kullanarak her yerde bulunan bir in vivo RNA hedeflemesi kurmak için, homozigot gRNA ilgi hattından 10 bakire yetişkin dişi sinek ve dengeli heterozygous Ubiq CasRx CurlyO'dan beş yetişkin erkek sinek toplayın.

Ebeveyn sineklerini 100 mikrogram kuru maya tozu ile desteklenmiş bir şişeye yerleştirin ve şişeleri 26 santigrat derecede 48 saat boyunca arkalayın. F1 kuşağının kasıklarından yeni bir yetişkin soyunun çıkıp çıkmadığını görmek için her gün şişeleri gözlemleyin ve yetişkinlerden herhangi birini 10 saniye boyunca karbondioksitle uyuşturun. Sinekler hareketsiz hale geldikten sonra şişeyi sürekli karbondioksit ile karbondioksit tankına bağlı bir sinek pedi üzerine boşaltın ve sineklerin fenotiplerini puanlamak ve görüntülemek için floresan stereo mikroskopa bağlı bir renkli kamera kullanın.

Daha sonra floresan sinyal ifadesine göre farklı fenotiplere sahip soy sayılarını sayın. Mendelian genetiğine dayanarak, soyların% 50'sinin hedeflenen RNA'yı ifade etmesi beklenmektedir. Ubiq CasRx sisteminin toksisitesinin hedeflenen RNA ekspresyon soy oranını % 50'nin altına düşürebileceğini unutmayın Üç bileşenli casrx sistemi kullanarak her yerde bulunan bir in vivo eksojen RNA hedeflemesi kurmak, çift luciferaz ifade hattından sekiz ila 10 Bakire yetişkin dişi sinek ve dengeli heterozipöz Ubiq CasRx Curly artı TM6'dan dört ila beş yetişkin erkek sinek toplayın, Aynı anda beyaz gözler, kıvırcık kanatlar ve ds kırmızı floresan sergileyen STB hattı.

Ebeveyn adımını 100 mikrogram kuru maya tozu ile desteklenmiş bir şişeye bir çapraz yerleştirin ve bu haçı 26 santigrat derecede 48 saat boyunca arkalayın. Kuluçkanın sonunda, her şişedeki tüm ebeveyn sineklerini çıkarın ve şişeleri en az 14 gün boyunca 26 santigrat derece inkübatöre geri verin. 14 gün boyunca, daha önce de belirtildiği gibi, gRNA hattını üç kez hedef alan homozigot ateş böceği luciferazından sekiz ila 10 dişi bakire toplayın.

Pupalardan yeni yetişkin soylarının çıkıp çıkmadığını görmek için her gün bir çapraz şişe adımını gözlemleyin, karbondioksitle uyuşturarak hem Ubiq CasRx'i hem de çift Luciferase muhabirini ifade eden dört ila beş erkek sinek toplanmasına izin verin. Sinekleri gRNA hattını hedefleyen meyve sineği luciferazından 10 Virgin dişisiyle yeni bir şişeye yerleştirin ve bu adım iki haçı 48 saat boyunca 26 santigrat derecede yerleştirin. Bir günlük beş erkek daha toplayın hem Ubiq CasRx hem de çift luciferaz muhabirini birinci adım çapraz şişelerden ifade edin ve sinekleri eksi 80 santigrat derece depolama için 1,5 mililitre santrifüje aktarmadan önce 26 santigrat derecede tek başına iki ila dört gün kuluçkaya bırakın.

Kuluçkanın sonunda, iki adım çapraz şişenin her birinden tüm ebeveyn şişelerini çıkarın. Ve şişeleri en az 20 gün boyunca 26 santigrat derece inkübatöre geri verin. Kasıktan yeni bir yetişkin soyunun çıkıp çıkmadığını görmek için her gün iki çapraz şişe adımını gözlemleyin, sinekleri kullanılabilir hale geldikçe karbondioksitle uyuşturun ve fenotiplerini gösterildiği gibi puanlayıp görüntülemeyin.

Mendelian genetiği, tüm sinekler yaşayabilirse, soyların% 25'inin hedeflenen RNA'yı ifade etmesi gerektiğini göstermektedir. Bir luciferaz tahlil yapmak için, üçlü trans heterozegöz sinekleri ve kontrol, gösterildiği gibi uçar. Erkek sinekleri doğumda toplamak ve üç günlük olana kadar yaşlanmak.

Üç günlük sinekleri 1,5 mililitre santrifüj tüplerine aktarın ve ticari olarak mevcut bir luciferaz test kitinden luciferaz liziz tamponunda bir tampon kullanarak onları yalım. Daha sonra standart luciferaz test protokollerine göre, hem meyve sineklerini hem de luciferaz aktivitesini ölçmek için her örnek ve armatürden beş mikrolitre lised doku kullanın. F1, trans heterozygous CasRx, trans heterozygous dCasRx sineklerine kıyasla önemli ölçüde daha düşük sağkalım oranlarına sahiptir.

Üç hedef genin Ubiq CasRx sisteminin toksisitesini doğrulayan U6 gRNA Y heterozipöz sinekler dayanılmazdır ve ikinci başlangıç larva aşamasının ötesinde büyümez. Hayatta kalan Ubq CasRx ve U6 gRNA W heterozygous sinekleri, belirgin bir tamamen penetrant geniş gözlü fenotip göstermektedir. Ayrıca üç hedef gen için hedef gen transkriptlerinde de önemli bir azalma gözlenmektedir.

CasRx tarafından indüklenen hedef dışı aktivitenin kanıtı, CasRx'ten sinekleri ifade eden örnekler ile dCasRx ifade eden sineklerden alınan örnekler arasındaki diferansiyel eksprese transkriptler karşılaştırıldığında da gözlenir. İki adımlı çaprazda, sadece üç trans genin kombinasyonu% 100 ölümcüllükle sonuçlanır. Üç bileşenli CasRx sistem tasarımı kullanılarak dokuya özgü RNA hedeflemesi kullanılırken, genel CasRx ifadesi UAST promotörü kullanılarak Ubiq promotörüne kıyasla düşürüldüğünde toksisite seviyesi azalır.

Doğru cinsiyet sinekleri ve doğru fenotipler kullanılarak genetik sürecin doğru şekilde kurulması önemlidir.