Canlı Görüntüleme Kullanarak Oksidatif Hasarın Drosophila Yumurta Odaları Üzerindeki Etkilerini Görselleştirme
April 10th, 2021
Bu protokolün amacı, Drosophila yumurtalıklarındaki hücre altı yapıların lokalizasyonu ve dinamikleri üzerindeki oksidatif hasarın etkilerini görselleştirmek için canlı görüntüleme kullanmaktır.
Laboratuvarımız, gelişim ve fizyolojik homeostaz sırasında mitokondriyal işlevi düzenleyen genleri ve yolları tanımlamak ve karakterize etmek için Drosophila melanogaster kullanır. Burada sunulan protokolde, oksidatif hasarın erişkin Drosophila yumurtalığındaki hücre altı yapıların lokalizasyonu ve dinamikleri üzerindeki etkilerini görselleştirmek için hidrojen peroksit ilavesi ile canlı görüntüleme sunulmuştur. Mutasyonların kadın mikrop hücrelerinde normal mitokondriyal lokalizasyonu ve hareketi nasıl değiştirdiğini incelemek için sık sık görüntüleme protokollerini kullanırız.
Çalışmalarımız boyunca diseksiyon veya diğer hücre stresörleri tarafından ortaya konan stresin mitokondriyal lokalizasyon üzerinde derin bir etkisi olduğunu gördük. Deneysel tedavinin aksine, genel stresin, hücre altı yapıların lokalizasyonu veya davranışındaki herhangi bir değişikliğin nedeni olup olmadığını belirlemek için bir kontrol olarak. Hidrojen peroksit kullanarak kontrol stresünü tanıtmak için bu protokolü geliştirdik.
Bu videoda hidrojen peroksitin neden olduğu oksidatif hasarın mitokondri ve ribonükleoprotein Clu'nun dağılımını nasıl değiştirdiğini göstereceğiz. Bu canlı görüntüleme tekniği için en uygun medya, Schneider'ın Drosophila medyasını içeriyordu ve bundan sonra Schneider'ın medyası olarak adlandırılan mikroliter sığır insülini başına% 15 ısı inaktive fetal sığır serumu, 0.6 X Pen-Strep ve 200 mikrogram içeriyordu. Ortam hazırlamanın steril koşullarda yapılması kirlenmemesini sağlayacaktır.
İçeriği iyice karıştırın ve dört derecede gece boyunca saklayın. İnsülin Schneider'ın tam medyasında tamamen çözülmez ve tüpün altına bir çökeltinin yerleştiğini fark edeceksiniz. Görüntülemeyi engelleyeceğinden bu çökeltmeyi bıraktığından emin olarak aliquot yapın.
Bu çözelti, dört derecede aliquotlarda saklanırsa bir ay boyunca kullanılabilir. Optimal dişi mikrop hücresi görüntüleme için, önce fıstık ezmesi kıvamı olan bir dab ıslak maya macunu içeren bir şişe hazırlayın. Bu, kadınların iyi beslenmesini sağlar ve görüntüleme için tüm folikül gelişim aşamalarını üretecektir.
En sağlıklı sinekler için, sıfır ila bir günlük dişileri toplayın ve erkeklerle birlikte ıslak maya macunu içeren bir sinek gıda şişesine aktarın. Uyuyan sineklerin maya ezmesine yapışabilecekleri için temas etmediklerine emin olun. Sinekleri üç ila yedi gün besleyin, maya ezmesini günlük olarak değiştirin.
Maya ezmesinin sinek yiyeceğini temas ettirdiğinden emin olun, böylece kurumaz. Oksidatif hasara neden olmak için% 30 hidrojen peroksit stok çözeltisi kullanacağız ve mitokondrileri görselleştirmek için 100 milimolar TMRE stok çözeltisi kullanacağız. Ortam çözümlerini taze hazırlamak önemlidir, çünkü hidrojen peroksit oksidasyona karşı hassastır ve TMRE zamanla bozulur.
Diseksiyondan hemen önce, Schneider'in medyasında, iki mikromoler hidrojen peroksit, 46 nanomoler TMRE'lik taze bir aliquot ve 46 nanomoler TMRE'lik taze bir aliquot artı iki mikromoler hidrojen peroksit hazırlayın. Yumurtalık diseksiyonu için iki çift ince forsepse ve bir çift elektrolitik olarak keskinleştirilmiş tungsten iğneye ihtiyacınız olacak. Yumurtalıkları parçalamak için bir saat camını oda sıcaklığına ısıtılmış schneider'in tam ortamıyla doldurun, ardından tokmak kullanarak medyaya tek bir sinek yerleştirin.
Bir çift ince yabanarı kullanarak sineği toraksla hafifçe kavrayın. Diğer kümeslerle, arkayı kavrayın ve yumurtalıkları çıkarmak için hafifçe çekin. Herhangi bir yabancı manikül veya dokuyu çıkarın, ardından yumurtalığı taze ortam içeren yeni bir kuyuya aktarın.
Yumurtalıklar hala çevredeki kas kılımından hareket ediyor olmalıdır. Keskinleştirilmiş tungsten iğnelerini kullanarak, çevredeki kas kılımını çıkarmaya özen ederek yumurtalıkları hafifçe parçalayın. Kas kılıma çıkarılmazsa, burada gösterildiği gibi, yumurtalık seğirir ve görüntü alımında sorunlara neden olur.
Yumurtalıklar temiz bir şekilde parçalandıktan sonra, endojen olarak etiketlenmiş yapıları görselleştiriyorsanız, 100 mikroliterlik bir medya damlasında mattek kabına aktarın. TMRE ile etiketlenmiş mitokondrileri görselleştiriyorsanız, 100 mikroliterlik bir TMRE medya damlasındaki yumurtalıkları matTek kabına aktarın. Yumurtalıklar damlacıkların dibine batar.
Dokuyu mümkün olduğunca çabuk görüntülemeye başlamak için diseksiyon uygulamak önemlidir. Yumurtalıklar monte edildikten sonra, yemeği ters mikroskop üzerine yerleştirin ve ön işlem koşullarının bir kaydı olarak durağan görüntüler veya kısa videolar elde edin. Bu yapıldıktan sonra, canlı görüntülemeyi duraklatın, kapağı çıkarın ve hazırlanan iki mikromoler hidrojen peroksitin 100 mikrolitresini dikkatlice ekleyin.
Altta kalan yumurtalıkları yerinden etmemek için mevcut ortam damlacıklarının yüzeyini kırmaktan veya çözeltiyi çok hızlı eklemekten kaçının. Bulaşık kapağını değiştirin, istediğiniz yumurtayı yeniden yerleştirin ve odaklayın ve görüntülemeye devam edin. Deneysel tedavi zamana duyarlı olduğu için görüntülemeye mümkün olduğunca çabuk devam etmeye özen gösterir.
Burada gösterilen, hidrojen sonrası peroksit tedavisi çekilen bir filmden hareketsiz görüntüler. Mitokondri ve dişi mikrop hücreleri, sinekler iyi beslendiğinde ve sağlıklı olduğunda sitoplazma boyunca dağılır. Hidrojen peroksit ilavesi sonrası, oksidatif hasar mitokondrilerin topaklanarak tedaviden 10 dakika sonra görülebilmesine neden olur.
20 dakika sonra, hasar mitokondriyal membran potansiyelinin dağılmasına neden olur. Böylece, mitokondrilerin çoğunluğu kaybolur. Sürecin bu canlı filminde, mitokondri hızla topaklanabilir ve mitokondrilerin çoğunluğu nihayetinde kaybolur.
Sitoplazmada, özellikle çevredeki folikül hücrelerinde yanıp sönen titreşim, TMRE ilavesinin karakteristiği olarak ortaya çıkar. Daha önce de belirtildiği gibi, görüntüleme hidrojen peroksit ilavesinden sonra hızlı bir şekilde yapılmalıdır. Burada gösterildiği gibi, çok fazla zaman geçmesi durumunda, mitokondriyal membran potansiyeli zaten kaybolur ve TMRE etiketlemesi dağılır ve verileri yorumlanamaz hale getirir.
Bu video durağan görüntülerde, GFP endojen olarak etiketlenmiş Clu parçacıkları, iyi beslenen kadınların germplazmında sağlam ve bol miktarda bulunur. Hidrojen peroksit ilavesi sonrası, Clu parçacıkları 10 dakika içinde dağılır. Bu, eşlik eden videoda gösterilmiştir.
Hidrojen peroksit ilavesi sonrası, Clu mutluluk parçacıkları hızla dağılır. Bu protokolü, Drosophila dişi mikrop hücrelerindeki mitokondri ve Clu mutluluk parçacıklarının vahşi tip lokalizasyonunun doğru görüntülenmesini sağlamak için yararlı bir araç olarak bulduk. Bu protokol çok çeşitli canlı görüntüleme çalışmaları için geçerli olmalı ve fiksasyondan önce dokuları tedavi etmek için de kullanılabilir.
En önemli adımlar, ovarioles'i kas kılımlarından arındırmak, yumurtalıkları yerinden çıkarmak için hidrojen peroksiti hafifçe eklemek ve hidrojen peroksit ilavesi sonrası hızlı bir şekilde görüntü almaktır. Bunu çeşitli hücre altı yapıları canlı görüntüleme için yararlı bir kontrol bulacağınızı umuyoruz. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneylerinizde iyi şanslar.
Genel Bakış
Bu protokol, Drosophila yumurtalıklarındaki alt hücresel yapılara oksidatif hasar etkilerini araştırmak için canlı görüntüleme kullanır. Çalışma, hidrojen peroksit tedavisine yanıt olarak mitokondriyal dinamikleri ve lokalizasyonu üzerine odaklanmaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Gelişimsel Biyoloji
Arka Plan
- Drosophila melanogaster, mitokondriyal fonksiyonu araştırmak için bir model organizmadır.
- Oksidatif stres, hücresel yapıları önemli ölçüde etkileyebilir.
- Canlı görüntüleme teknikleri, dinamik hücresel süreçleri gözlemlemenin gereklidir.
- Bu çalışmada oksidatif hasar indüklemek için hidrojen peroksit kullanılır.
Çalışmanın Amacı
- Oksidatif hasarın mitokondri ve diğer alt hücresel yapılar üzerindeki etkilerini görselleştirmek.
- Stresin mitokondriyal lokalizasyonu ve hareketini nasıl etkilediğini değerlendirmek.
- Hidrojen peroksit kullanarak kontrollü oksidatif stres için bir protokol oluşturmak.
Kullanılan Yöntemler
- Görüntüleme için tam Schneider's ortamının hazırlanması.
- Steril koşullar altında Drosophila yumurtalıklarının diseksiyonu.
- Oksidatif hasar indüklemek için hidrojen peroksit uygulaması.
- Tedaviden sonra mitokondriyal davranışı izlemek için canlı görüntüleme.
Ana Sonuçlar
- Oksidatif hasar, mitokondriyal topaklanmaya ve membran potansiyelinin kaybına yol açar.
- Mitokondriyel dinamiklerdeki değişiklikler, tedavi sonrası 10 dakika gibi erken zamanlarda gözlemlenebilir.
- Güvenilir görüntüleme sonuçları için deneysel koşulların kontrolü kritik öneme sahiptir.
- TMRE etiketleme, mitokondriyal sağlık ve dinamikler hakkında bilgiler sağlar.
Sonuçlar
- Canlı görüntüleme, oksidatif stresin mitokondri üzerindeki etkisini etkili bir şekilde gösterir.
- Protokol, Drosophila'daki mitokondriyal fonksiyon üzerine daha ileri çalışmalar için kullanılabilir.
- Oksidatif hasar mekanizmalarının anlaşılması, daha geniş biyolojik araştırmaları bilgilendirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Controlled induction of oxidative damage in Drosophila egg chambers via live imaging enables precise assessment of subcellular structure dynamics under stress, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides a robust control for distinguishing experimental effects from general cellular stress, enhancing predictive confidence in target validation studies. The protocol's adaptability to various subcellular structures increases its value for portfolio-wide assay development and screening readiness.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of stress-induced changes in organelle localization and dynamics.
- Supports functional validation of mitochondrial and ribonucleoprotein particle behavior under controlled oxidative conditions.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing specific treatment effects from general cellular stress responses.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological systems for downstream live imaging workflows.
- Standardizes oxidative stress induction for reproducible quantitative imaging outputs.
- Enables rapid assessment of compound or genetic perturbation effects on subcellular structures.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant mechanisms involving oxidative stress and mitochondrial dysfunction.
- Provides continuity from discovery-stage imaging to preclinical model validation of cellular stress responses.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by clarifying stress-induced phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
This live imaging protocol integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through assay development and preclinical validation, particularly for studies involving cellular stress and organelle dynamics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on the impact of oxidative damage on subcellular localization.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs for comparative analysis.
- Analytics: Provides measurable readouts of mitochondrial clumping and ribonucleoprotein particle dispersion.
- Translational Research: Connects oxidative stress responses in Drosophila to broader disease models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable protocol for diverse subcellular structure studies across R&D teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes oxidative stress induction and imaging workflows for scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by clarifying stress-related phenotypes early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and models based on robust stress response data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila dissection and live imaging techniques.
- Needs access to inverted fluorescence microscopy and appropriate imaging reagents.
- Demands cross-team standardization of oxidative stress induction protocols.
- Adaptable to various subcellular structures but limited to aqueous media (not compatible with halocarbon oil).
- Imaging must be performed rapidly post-treatment to capture dynamic changes before signal loss.
