Name: Embriyonik Gün 12.5 ve 8 Haftalık Farelerin Dil Epitel ve Mezenkim/Bağ Dokusundan Hücre Ayrışması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Öğrenin, fare dilinin epitel ve mezenkim dokularından yüksek verimli tek hücre ayrıştırma yöntemini. Bu protokol, tek hücre RNA dizileme ve organoid kültürleri için sağlıklı hücreler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri, R01DC012308 ve R21DC018089 hibe numarası tarafından HXL'ye desteklendi. Brett Marshall (Georgia Üniversitesi, Atina, GA) ve Egon Ranghini'ye (10X GENOMICS, Pleasanton, CA) hücre ayrışması ile ilgili teknik yardım ve danışmanlık için teşekkür ederiz; İngilizce düzenleme için Francisca Gibson Burnley'e (Georgia Üniversitesi, Atina, GA).

Hayvan kullanımı (çalışma boyunca C57BL/6 fareler) Georgia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır ve hayvanların bakımı ve kullanımı için Ulusal Sağlık Yönergeleri Enstitüleri'ne uygundu.
1. Hayvan kullanımı
NOT: Fareler, Gürcistan Üniversitesi Hayvan ve Süt Bilimi bölümünün hayvan tesisinde 12-h gündüz/gece döngüleri altında 22 °C'de yetiştirildi ve bakımı yapıldı.
<ol><li>Farelerde vajinal tıkaç tespiti gününün öğlenini embriyonik (E) gün 0.5 olarak belirleyin. Aşağıdaki deneyler için E12.5'te embriyoları ve 8 haftalık doğum sonrası fareleri kullanın.</li>
</ol>2. Deneyden önce hazırlık
NOT: Bu protokol için gerekli olan araçlar Malzeme Tablosundalistelenmiştir.
<ol><li>Deneyden önce otoklav aletleri. Deney sırasında bir boncuk sterilizatörü kullanarak aletleri sterilize edin.</li>
	<li>p etanol mendil kullanarak cerrahi bölgeyi, diseksiyon mikroskobu ve biyogüvenlik kabinini temizleyin. Biyogüvenlik kabininin UV ışığını açın ve deneysel prosedürden önce 20 dakika boyunca açık tutun.</li>
	<li>Sırasıyla 2,5 ve 1,0 mg/mL'lik son konsantrasyona 1:1 dispaz (5,0 mg/mL) ve kollajenaz (2,0 mg/mL) enzim karışımı hazırlayın ve çözeltiyi 0,22 μm şırıng filtresi7kullanarak filtreleyin.<ol>
<li>Yetişkin bir dil için 1 mL enzim karışımı veya belirli bir dil bölgesi (ör. posterior veya ön dil) için 0,5 mL hazırlayın.</li>
		<li>Embriyonik diller için 2 mL enzim karışımı hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>0,1 M PBS'de %2,5 BSA'nın 10 mL'sini yapın ve çözeltiyi 1 mL şırınna ve 0,22 μm şırınna filtresi kullanarak filtreleyin.</li>
	<li>DMEM/F12'de %5 FBS'nin 500 μL'sini yapın.</li>
	<li> FBS ve %1 BSA içeren 3 mL DMEM/F12 yapın ve çözeltiyi 1 mL şırınna ve 0,22 μm şırınna filtresi kullanarak filtreleyin.</li>
</ol>3. Dil epitelinin mezenkim/alttaki bağ dokusundan ayrılması
<ol><li>Epitelinin bir E12.5 fare dilinin mezenkiminden ayrılması<ol>
<li>Ötenazi, E12.5 embriyosu taşıyan hamile dişi fareleri bir CO2 odasına ve ardından servikal çıkıklara yerleştirerek zamanlanmıştır. NOT: E12.5'teki fare embriyoları, hamile dişi farelerde vajinal tıkaç tespit edildikten sonra 12.</li>
		<li>Fareleri cerrahi bölgeye aktarın. Kürkün çalışma alanına girmesini önlemek için% 70 etanol kullanarak fare karnını ıslatın.</li>
		<li>Embriyo taşıyan rahim boynuzlarını ortaya çıkarmak için diseksiyon makası kullanarak karnı açın. Rahim boynuzlarını diseksiyon makası kullanarak parçalara aktarın ve 100 mm'lik bir kültür çanağına 15 mL taze Tyrode çözeltisine aktarın.</li>
		<li>Embriyoları ( Şekil1A 1) rahim boynuzlarından mini makas ve ince etops kullanarak bir diseksiyon mikroskobu altında parçalara ayrıştırın.</li>
		<li>İnce önseziler kullanarak ağız boşluğunu dikkatlice açın ve mini makas kullanarak dili mandibuladan sökün (Şekil 1A2).</li>
		<li>Dilleri 15 mL taze steril Tyrode çözeltisini 100 mm'lik bir kültür kabında yıkayın.</li>
		<li>Dokuları, biyogüvenlik kabininde spatula ve ince tokmaklar bulunan 35 mm'lik bir kültür çanasında dispaz (2,5 mg/mL) ve kollajenaz (1,0 mg/mL) enzim karışımına 2 mL'ye aktarın. 37 °C'de 20 dakika kuluçkaya yaslanın.</li>
		<li>Dilleri 100 mm'lik bir kültür çanağına 15 mL taze steril Tyrode çözeltisine aktarın ve ince forsepsler kullanarak mezenkimi epitelden hafifçe çıkarın. NOT: Epitel levhalar inkübasyon sırasında mekanik kuvvet olmadan ayrılabilir.</li>
		<li>Ayrılmış epitel ve mezenkimleri 15 mL taze steril Tyrode çözeltisinde 100 mm'lik bir kültür tabağında iki kez yıkayın. NOT: Hücre ayrışması prosedüründe dispaz ve kollajenaz aktiviteleri EDTA tarafından inhibe edilecektir (adım 4.1).</li>
	</ol></li>
	<li>Dil epitelinin yetişkin farelerin alttaki bağ dokusundan ayrılması<ol>
<li>Fareyi 8 haftalıkken co2 haznesine yerleştirerek ötenazi yaptırın. Farenin nefessiz ve önceden çimdikleme yanıtı olmadan ötenazi yaptığını onaylayın.</li>
		<li>Fareleri cerrahi bölgeye aktarın. Kürkün ağız boşluğuna girmesini önlemek için% 70 etanol kullanarak fare kafasını ıslatın.</li>
		<li>Ağız boşluğunu açmak için kesme makası kullanarak ağız köşelerini yanak boyunca kesin. Dili mandibula ile parçalara bölün (Şekil 1B1) ve plastik bir tabakaya plastik bir sargı tabakası ile yerleştirin.</li>
		<li>Dili bir diseksiyon mikroskobu altında tutmak için cerrahi epoplar kullanarak, dilin epitel altı boşluğuna dispaz (2,5 mg/mL) ve kollajenaz (1,0 mg/mL) enzim karışımını arka dilin kesme kenarından(Şekil 1B1, oklar) enjekte edin.<ol>
<li>Hem ön hem de arka dilden doku toplanması için tüm dil için 1 mL enzim karışımını eşit olarak enjekte edin.</li>
			<li>Dil ucundan doku toplanması için ön dile veya circumvallate papilla doku koleksiyonu için arka dil için lokal olarak 0,5 mL enzim karışımı enjekte edin. NOT: Enzim biriktikçe dil şişer (Şekil 1B2). Enzimin nazik enjeksiyonu, basıncın epitellere zarar vermesini önleyebilir ve dilde mümkün olduğunca fazla enzim tutabilir.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Dili plastik sargı ile sarın ve dili 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Dil ucunu ve/veya circumvallate papillayı parçalamak için mini makas kullanın ve 100 mm'lik bir kültür çanağına 15 mL taze steril Tyrode çözeltisine doku aktarmak için spatula ve ince forseps kullanın.</li>
		<li>Epitelleri, mini makas kullanarak enzimle sindirilen alt epitel uzayındaki alttaki bağ dokusundan ayırın. Aşağı akış deneylerinin ihtiyacına göre dokuları uygun bir boyuta kırpın.</li>
		<li>Ayrılmış epitel ve alttaki bağ dokusunu 15 mL taze steril Tyrode çözeltisinde 100 mm'lik bir kültür kabında iki kez yıkayın. NOT: Hücre ayrışması prosedüründe dispaz ve kollajenaz aktiviteleri EDTA tarafından inhibe edilecektir (adım 4.1).</li>
	</ol></li>
</ol>4. Hücre ayrışması
NOT: Burada açıklanan hücre ayrışma protokolü hem E12.5 embriyonik hem de 8 haftalık farelerde dil epitel ve mezenkim/bağ dokusuna uygulanabilir. Hücre süspansiyonunun ajitasyonu ve transferi sırasında hücre kaybını azaltmak için, pH 7.48'de0.1 M PBS'de% 2.5 BSA ile ticari düşük tutma pipet uçları veya önceden kaplanmış pipet uçları kullanın.
<ol><li>Spatula ve ince forseps kullanarak dokuları 37 °C'de 30 dakika boyunca yeni bir 35 mm kültür çanağıyla % 0,25 trypsin-EDTA'nın 3 mL'sine aktarın. 1 mL pipet uçları ile her 5 dakikada bir dokuları hafifçe çalkalayın. NOT: Kesme kenarı ayrışmış hücrelere fiziksel olarak zarar verebileceği için pipet ucunu kesmeyin.</li>
	<li>Reaksiyonu durdurmak ve ortamı 5 mL düşük bağlayıcı santrifüj tüpüne aktarmak için DMEM/F12'ye 500 μL%5 FBS ekleyin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 8 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj hücre süspansiyonu ve süpernatantı çıkarın.</li>
	<li>1 mL pipet uçları kullanarak % 10 FBS ve% 1 BSA içeren 3 mL DMEM / F12'deki hücreleri yavaşça yeniden askıya alın ve hücreleri 70 μm hücre süzgeci ve ardından 35 μm hücre süzgeci kullanarak filtreleyin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 8 dakika boyunca 200 x g'da santrifüj hücre süspansiyonu. Ortamın çoğunu çıkarın ve hücreleri yeniden askıya almak için son hacim olarak 50-300 μL bırakın. NOT: Tek hücreli süspansiyonun son hacmini değiştirerek hücrelerin konsantrasyonlarını aşağı akış deneylerinin gereksinimlerine göre ayarlayın.</li>
</ol>5. Hemositometre kullanılarak hücre sayımı ve uygulanabilirlik testi
NOT: Ölçüm doğruluğunu artırmak için her numune için 3 teknik çoğaltma önerilir.
<ol><li>Tek hücreli süspansiyonun 5-10 μL'lik kısmını eşit hacimde Trypan mavisi ile hafifçe karıştırın ve hemositometreye ekleyin. NOT: Kullanmadan önce hemositometreyi p etanol kullanarak iyice temizleyin. Hemositometredeki toz parçacıkları koyu mavi renkte boyanacak ve canlılık testinin doğruluğunu etkileyecektir. Hemositometreyi mikroskop altında kontrol edin.</li>
	<li>Görüntüleme sistemi ile ters mikroskop kullanarak 16 ızgaralı 4 karede sırasıyla Trypan mavisi(Şekil 2, oklar) ile boyanmış toplam hücre sayısını, canlı hücre sayısını(beyaz)ve ölü hücre sayısını (koyu mavi) sayın.</li>
	<li>Hücre konsantrasyonu hesaplayın: Hücre konsantrasyonu = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62163/62163eq01v2.jpg"><ol>
<li>Uygulanabilirliği hesaplayın: Yaşayabilirlik = <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62163/62163eq02.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Grada, A., Weinbrecht, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing%3A+methodology+and+application%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+investigative+dermatology%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing: methodology and application.</a> The Journal of investigative dermatology. 133 (8), 11(2013).</li>
<li>Whitley, S. K., Horne, W. T., Kolls, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+techniques+made+simple%3A+methodology+and+clinical+applications+of+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Research techniques made simple: methodology and clinical applications of RNA sequencing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 136 (8), 77-82 (2016).</li>
<li>Schaum, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+of+20+mouse+organs+creates+a+Tabula+Muris%3A+The+Tabula+Muris+Consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris: The Tabula Muris Consortium.</a> Nature. 562 (7727), 367(2018).</li>
<li>Sukumaran, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+transcriptome+profiling+of+taste+bud+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Whole transcriptome profiling of taste bud cells.</a> Scientific reports. 7 (1), 1-15 (2017).</li>
<li>Ren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analyses+of+taste+organoids+reveal+multiple+pathways+involved+in+taste+cell+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li>
<li>Ren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5-or+Lgr6-expressing+taste+stem%2Fprogenitor+cells+generate+taste+bud+cells+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5-or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (46), 16401-16406 (2014).</li>
<li>Venkatesan, N., Boggs, K., Liu, H. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+bud+labeling+in+whole+tongue+epithelial+sheet+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Taste bud labeling in whole tongue epithelial sheet in adult mice.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (4), 332-337 (2016).</li>
<li>Nguyen-Ngoc, K. -V., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNguyen-Ngoc%2C+K-V+%22Tissue+Morphogenesis%22">Tissue Morphogenesis</a>. , Springer. 135-162 (2015).</li>
<li>Okubo, T., Clark, C., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+mapping+of+taste+bud+cells+and+keratinocytes+in+the+mouse+tongue+and+soft+palate%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Cell lineage mapping of taste bud cells and keratinocytes in the mouse tongue and soft palate.</a> Stem Cells. 27 (2), 442-450 (2009).</li>
</ol>

Çıkar çatışması bildirilmedi.

Bugüne kadar, dil epitelinden ve alttaki mezenkim/ bağ dokusundan hücre ayrışması için ayrıntılı bir protokol mevcut olmamıştır. Bu geçerli hücre ayrıştırma protokolü, yüksek hücre canlılığı (%>90) olan tek bir hücre süspansiyonu oluşturmak için tekrarlanabilir bir yordam sağlar E12.5 ve yetişkin farelerden izole edilmiş hücreler farklı olsa da hem embriyonik hem de doğum sonrası evrelerde epitel levhalar ve mezenkim/bağ dokuları da dahil olmak üzere fare dili dokularından. Örneğin, E12.5 fare dillerinin epitel ve mezenk...

Memeli dili tat, konuşma ve gıda işleme için kritik olan karmaşık bir organdır. Mezenkime/bağ dokusu ile bölümlere ayrılmış ve tat papilla ve tat tomurcukları içeren tabakalı bir epitel levha ile kaplanmış çok sayıda yüksek organize doku türünden oluşur. Hem dil epitel hem de mezenkim/bağ dokusundaki hücre popülasyonları heterojendir. Dildeki belirli bir hücre türünün işlevlerini ve dağılımını daha iyi anlamak için, ayrışmış hücrelerin kullanılarak yapılan çalışmalar gereklidir. Örneğin, tek hücreli RNA dizilimi, tek hücreli çözünürlükte karmaşık dokunun transkriptom'u anlamak için tasarlanmış, tek tek hücreli hücrelerde transkriptomik profil oluşturma için güçlü ve yüksek aktarım hızına sahip biryöntemdir. Birincil hücre kültürünün, tat tomurcukları için kök/ progenitör hücrelerin işlevini ve farklılaşmasını incelemek için yararlı bir araç olduğu kanıtlanmıştır5,6. Bu çalışmalar çok miktarda yüksek kaliteli izole hücre popülasyonu gerektirir (örneğin, uygun konsantrasyon ve yüksek canlılık ile yeterli toplam hücre sayısı).
Bu nedenle, lingual dokuların farklı bölgelerinden ve farklı gelişim aşamalarında hücreleri izole etmeye ihtiyaç vardır. Şu anda, dil epitelinden ve alttaki mezenkim/ bağ dokusundan hücre ayrışması için ayrıntılı bir protokol bulunmamaktadır. Burada, hücreleri tek hücreli RNA dizilimi ve birincil kök hücre kültürleri gibi yüksek kalitede canlı hücreler gerektiren deneylere hazırlamak için optimize edilmiş bir hücre ayrıştırma yöntemi rapor ediyoruz. Enzimatik sindirim tamponu seçimi, nazik pipetleme, resüspenzyon ortamının seçimi ve bu büyük miktarlarda yüksek kaliteli hücre üretmek için optimum santrifüj süresi ve hızının çok önemli olduğunu gördük.

<table><tbody><tr><td>sığır serum albümini (BSA)</td><td>Altın Biyoteknoloji</td><td>A-420-100</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 fare (C57BL/6J)</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>kollajenaz (Kollajenaz A)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>kültür kabı (35 mm çapında)</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-103G</td><td></td></tr><tr><td>kültür kabı (100 mm çapında)</td><td>Genesee Bilimsel</td><td>32-107G</td><td></td></tr><tr><td>dispase (Dispase II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>04942078001</td><td></td></tr><tr><td>diseksiyon makası (Öğrenci İnce Makası)</td><td>Bilim Aracını Bul</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>fetal sığır serumu (FBS)</td>İnce forseps <td>C838U82</td><td></td> <td>hiklon</td></tr><tr><td>(Dumount #3 Forseps)</td><td>Bilim Aracını Bul</td><td>11293-00</td><td></td></tr><tr><td>hemositometre</td><td>Hausser Scientific</td><td>3520</td><td></td></tr><tr><td>görüntüleme sistemli ters mikroskop (EVOS XL Çekirdek Hücre Görüntüleme Sistemi)</td><td>Düşük</td> tutma noktalı pipet uçları <td>AMEX1000</td><td></td>Yaşam Teknolojileri</tr><tr><td></td><td>METTLER TOLEDO</td><td>17014342</td><td></td></tr><tr><td>mini makas (Evo Yaylı Makas)</td><td>Güzel Bilim Aracı</td><td>15800-01</td><td></td></tr><tr><td>plastik çözgü</td><td>VWR</td><td>46610-056</td><td></td></tr><tr><td>spatula (Moria Kaşık)</td><td>Güzel Bilim Aracı</td><td>10321-08</td><td></td></tr><tr><td>cerrahi forseps (Dumount #2 Laminektomi Forseps)</td><td>Güzel Bilim Aracı</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Tripan mavisi</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tyrode' s çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2145-10L</td><td>, Tyrode tuzlarından</td></tr><tr><td>% 0.25 typsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>0.1 M Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td> <td>Hoefer</td><td>33946</td>, <td>1 M PBS</td></tr><tr><td>0.22-&mu'dan yapılmıştır; m şırınga filtresi</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-243</td><td></td></tr><tr><td>%70 etanol</td><td>Koptec</td><td>233919</td><td>%100 etanolden yapılmıştır</td></tr><tr><td>1 mL şırınga</td><td>BD</td><td>8194938</td><td></td></tr><tr><td>5 mL düşük bağlayıcı mikrosantrifüj tüpü</td><td>Eppendorf</td><td>30122348</td><td></td></tr><tr><td>30-G iğne</td><td>BD</td><td>9193532</td><td></td></tr><tr><td>35-&mu; m hücre süzgeci</td><td>Falcon</td><td>64750</td><td></td></tr><tr><td>70-&mu; m hücreli süzgeç</td><td>Falcon</td><td>64752</td><td></td></tr></tbody></table>

embriyonik gün 12.5 ve 8 haftalık farelerin dil epitel ve mezenkim/bağ dokusundan hücre ayrışması

Cell Dissociation from the Tongue Epithelium and Mesenchyme/Connective Tissue of Embryonic-Day 12.5 and 8-Week-Old Mice

Hücre ayrışması, birey-hücre düzeyinde ve/veya hücre popülasyonu düzeyinde (örneğin, tek hücreli RNA dizilimi ve birincil hücre kültürü) çalışmalar için önemli bir prosedür olmuştur. Büyük miktarlarda uygulanabilir, sağlıklı hücreler elde etmek kritik öneme sahiptir ve bunu yapmak için en uygun koşullar dokuya bağlıdır. Dil epitel ve alttaki mezenkim/bağ dokusundaki hücre popülasyonları heterojendir ve doku yapıları farklı bölgelerde ve farklı gelişim evrelerinde farklılık gösterir. Erken gelişimsel [embriyonik gün 12.5 (E12.5)] ve genç yetişkin (8 haftalık) evrelerde fare dili epitel ve mezenkim/bağ dokusundan hücreleri izole etmek için protokolleri test ettik. Epitel ve alttaki mezenkim/bağ dokusu arasında temiz bir ayrım yapmak kolaydı. Bununla birlikte, hücreleri daha fazla işlemek ve izole etmek, büyük miktarlarda uygulanabilir sağlıklı hücreler elde etmek ve enzimatik sindirim tamponunun dikkatli seçimi, kuluçka süresi ve santrifüj hızı ve zamanı kritiktir. 37 °C'de 30 dakika boyunca %0,25 Trypsin-EDTA'da ayrılmış epitel veya alttaki mezenkime/bağ dokusunun inkübasyonu, ardından 8 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleme yüksek canlılık oranında (%>90) yüksek hücre verimi ile sonuçlandı. fare aşamaları ve dil bölgeleri ne olursa olsun. Ayrıca, embriyonik ve yetişkin dillerinden hem ayrışmış epitel hem de mezenkimal/bağ dokusu hücrelerinin hücre kültürüne dayalı ortamda hücre canlılığında önemli bir azalma olmadan en az 3 saat hayatta kalabileceğini bulduk. Protokoller, erken gelişimsel (E12.5) ve farklı doku bölmelerinden hücre ayrışması gerektiren genç yetişkin (8 haftalık) aşamalarda fare dillerinden izole hücrelerin hazırlanmasını gerektiren çalışmalar için yararlı olacaktır.

Dil epitelinin alttaki mezenkim/bağ dokusundan ayrılması Embriyonik fare dilinde, uygun enzim sindiriminden sonra epitel altı boşlukta bir boşluk görülür. Bazı dillerin epitel levhaları inkübasyon sırasında mekanik kuvvet olmadan ayrılır.
Yetişkin fare dilinde, enjekte edilen bölgelerdeki şişlik ile başarılı bir enzim enjeksiyonu belirtilir (Şekil 1B2), bu da enzimin dil tarafından tutulabileceğini düşündürmektedir. ...

Embriyonik ve yetişkin fare dillerinin epitel ve mezenkim/bağ dokusundan çok miktarda yüksek kaliteli tek hücreyi ayrıştırmak için genelleştirilmiş bir protokol geliştirdik.

Embriyonik Gün 12.5 ve 8 Haftalık Farelerin Dil Epitel ve Mezenkim/Bağ Dokusundan Hücre Ayrışması

Cell dissociation has been an essential procedure for studies at the individual-cell level and/or at a cell-population level (e.g.,&#160;single cell RNA ...

Karmaşık dokulardan gelen hücrelerin yüksek verimi ve kalitesi, tek hücreli RNA dizilimi ve birincil kök hücre kültürleri gibi yaygın olarak kullanılan deneysel analizler için gereklidir. Bu protokol, dil epitel ve bağ dokusu da dahil olmak üzere memeli dilinin farklı bölgelerinden ve doku bölmelerinden yüksek verim ve kalitede sağlıklı hücreler üretir. Epitelleri bir E 12.5 fare dilinin mezenkiminden ayırmak için, ötenazili hamile kadın fareyi cerrahi bölgeye aktarın ve kürkün ameliyat bölgesine girmesini önlemek için fare karnını% 70 etanol ile ıslatın.Embriyoları taşıyan rahim boynuzlarını ortaya çıkarmak için diseksiyon makası kullanarak karnı açın, rahim boynuzlarını parçalara ayırın ve 100 milimetrelik bir kültür çanağına 15 mililitre taze Tirot çözeltisine aktarın. Bir diseksiyon mikroskobu altında, embriyoları rahim boynuzlarından parçalamak için mini makas ve ince tokmaklar kullanın. Ağız boşluğunu ince önps ile açın ve mini makas kullanarak dili mandibuladan kesin.Dilleri 100 milimetrelik bir kültür çanağına 15 mililitre taze steril Tyrode çözeltisi ile yıkayın. Daha sonra dokuları 35 milimetrelik bir kültür çanasında dispaz ve kollajenöz enzim karışımının iki mililitresine aktarın ve 37 santigrat derecede 20 dakika kuluçkaya yatırın. Dilleri 15 mililitre taze steril Tyrode çözeltisine aktarın ve mezenkim ve epitelleri ince forseps kullanarak ventral taraftan hafifçe ayırın.Ayrılmış epitel ve mezenkimleri 15 mililitre taze steril Tyrode çözeltisinde iki kez yıkayın. Dil epitelini yetişkin bir farenin alttaki bağ dokusundan ayırmak için, ötenazili fareyi cerrahi bölgeye aktarın ve kürkün ağız boşluğuna girmesini önlemek için% 70 etanol kullanarak fare kafasını ıslatın. Ağız boşluğunu açmak için ağız köşelerini yanak boyunca kesmek için kesme makası kullanın.Dili bir mandibula ile parçalara bölün, yıkayın ve plastik bir tabakaya plastik bir sargı tabakası ile yerleştirin. Dili tutmak için cerrahi tokmaklar kullanarak, dilin subepithelial uzayındaki dispaz ve kollajenaz enzim karışımını arka dilin kesme kenarından enjekte edin. Doku toplanması için tüm dil için bir mililitre enzim karışımını eşit olarak enjekte edin, ardından dil ucundan doku toplanması için ön dile veya circumvallate papilla doku koleksiyonu için arka diline lokal olarak 0,5 mililitre enzim karışımı enjekte edin.Dili plastik sargı ile sarın ve 37 santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya bırakın. Circumvallate papilla ve dil ucunu parçalamak için mini makas kullanın. Daha sonra bir dokuyu 15 mililitre taze steril Tyrode çözeltisine aktarın.Epitelleri, aşağı akış deneylerinin gereksinimine göre, mini makas kullanarak sindirilmiş subepithelial alandaki alttaki bağ dokusundan ayırın ve dokuları uygun bir boyuta kırpın. Ayrılmış epitel ve alttaki bağ dokusunu 15 mililitre taze steril Tyrode çözeltisinde 100 milimetrelik bir kültür çanağına iki kez yıkayın. Dokuları yeni bir 35 milimetrelik kültür çanağıyla %0,25 trypsin EDTA'nın üç mililitresine aktarın.Yemeği 37 santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın, her beş dakikada bir bir mililitre pipet uçlarıyla dokuları hafifçe çalkalayın. Reaksiyonu durdurmak ve ortamı beş mililitre düşük bağlayıcı santrifüj tüpüne aktarmak için DMEM F12'ye 500 mikrolitre %5 FBS ekleyin. Hücre süspansiyonu oda sıcaklığında sekiz dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleyin ve üst yapıyı çıkarın.Hücreleri%10 FBS ve %1 BSA içeren üç mililitre DMEM F12'de hafifçe yeniden biriktirin ve hücreleri 70 mikrometre hücre süzgeci ve ardından 35 mikrometre hücre süzgeci ile filtreleyin. Hücre süspansiyonu oda sıcaklığında sekiz dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleyin, ardından ortamın çoğunu çıkarın, hücreleri yeniden depolamak için son hacim olarak 50 ila 300 mikrolitre bırakın. Embriyonik fare dilinde, uygun enzim sindiriminden sonra subepithelial boşlukta bir boşluk görülür.Yetişkin fare dilinde, enjekte edilen bölgelerde şişme ile başarılı bir enzim enjeksiyonu belirtilir, bu da enzimin dil tarafından tutulabileceğini gösterir. E12.5 dillerin epitel levhalarını ve ince mezenkim katmanlarını biriktikten sonra, manuel hücre sayımı, protokolün epitel levhalardan% 95.2 canlılık ile toplamda 63, 917 hücre ve mezenkimden% 96.3 canlılık ile toplamda 294, 333 hücre sağladığını göstermiştir. Sekiz haftalıkken 10 yetişkin dili kullanıldığında, protokol, dil ucunun epitel tabakalarından %95,4 canlılığa sahip 187, 333 hücre, circumvallate papillanın epitel tabakalarından %96,3 canlılığa sahip 544,000 hücre ve bağ dokularından %93 canlılığa sahip 150.500 hücre elde etti.Bu protokolden sonra, ayrışmış hücreler, tek hücreli RNA dizilimi ve 3D test organoid kültürü için lingual epitel altında tanınmayan test progenitör hücrelerini tanımlamak için kullanılabilir.

cell-dissociation-from-tongue-epithelium-mesenchymeconnective-tissue

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Kranial mezenşimi muhtemel nöral kıvrımların yükselmesi için bir itici güç sağlar dramatik morfojenik hareketleri...

Kranial mesenchyme Hücresel Davranış Değerlendirme için bir Eksplantasyon Assay

Bu videoda, bir murin dilinden epitel hücrelerinin izolasyonunu anlatıyoruz. Bu hücreler, hücre kolonilerine yol açmak için daha fazla kültürlenebilir.

Murin Dil Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü: Dil Epitel Hücrelerini Fare Modelinden İzole Etme ve Kültür Prosedürü

Bu video, alınan dilin bir dizi fiziksel, kimyasal ve enzimatik işleme maruz bırakılmasını içeren hücre dışı matris kullanılarak murin dili hücre dışı matrisinin hazırlanmasını göstermektedir. Elde edilen TEM iskelesi, hücresel bileşenleri uzaklaştırarak doğal hücre dışı matris bileşimini korur.

Fare Modelinden Hücre Dışı Matriks Üretimi: Murin Dilinden Decellularize Dil Hücre Dışı Matriks Hazırlamak İçin Etkili Bir Prosedür

Bu videoda, bir murin dilinden circumvallate papilla (CVP) epitelinin izolasyonunu açıklıyoruz.

Fare Modelinden Circumvallate Papilla (CVP) Epitelinin İzolasyonu: CVP Epitelini Fare Dilinden Ayırmak İçin Enzimatik Bir İşlem

Bu video, fare embriyolarının dorsolateral telensefalonundan birincil serebral korteks hücrelerini izole etmek ve kültürlemek için bir protokolü göstermektedir.

Fare Embriyo Dorsolateral Telenefalonlarından Hücrelerin İzolasyonu ve Kültürlenmesi

Embriyo yüz ektoderm ve mezenşimi ayrılması için bir protokol tanımlanmıştır. Biz, ilk bütün embriyolar tedavisinde tüm yüz çıkıntıları üzerinden incelemek dispase II kullanın ve sonra yüz ektoderm ve mezenşimi ayırın.

Fare Embriyonik Yüz Ektoderm ve mesenchyme ayrılması

Sürekli büyüyen fare kesici diş epitel kök hücreler (DESCs) diş dokularının yenilenmesini eğitim için bir model sağlar. Sürekli ve güvenilir bir şekilde kesici bu hücrelerin elde edilmesi ve in vitro ile genişletilmesi için sağlam bir sistem burada bildirilmektedir.

Yetişkin Fare insizör Diş Epitel Kök Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Burada, konfokal mikroskopi kullanarak fare sekonder damak füzyonunun canlı görüntülemesi için bir protokol sunmaktayız. Bu protokol, çeşitli floresan muhabir fare hatları ve mekanik içgörü için yol inhibitörleri ile birlikte kullanılabilir. Bu protokol, diğer gelişimsel sistemlerde canlı görüntüleme için uyarlanabilir.

Fare İkincil Palin Füzyonunun Canlı Görüntüsü

İki boyutlu (2D) büyüme ve yara onarım testlerinin hızlandırılmış görüntülemesi için primer fare embriyonik palatal mezenkimal hücrelerin izolasyonu ve kültürü için bir protokol sunuyoruz. Ayrıca hücre akışı oluşumunu ve yönlü hareketliliği belirlemek için zaman atlamalı görüntüleme verilerinin analizi için metodoloji sağlıyoruz.

Kolektif Hareket Niteliklerini Analiz Etmek için Birincil Fare Embriyonik Palatal Mezenkim Hücrelerinin İzolasyonu ve Zaman Atlamalı Görüntülenmesi

Protokol, yetişkin farelerin arka tat papillasından izole edilmiş tat kök hücrelerinden elde edilen dil organoidlerini kültleme ve işleme için bir yöntem sunar.

Yetişkin Fare Tadı Kök Hücrelerinden Elde Edilen Lingual Organoidlerin Üretimi ve Kültürü

Öğrenin, fare dilinin epitel ve mezenkim dokularından yüksek verimli tek hücre ayrıştırma yöntemini. Bu protokol, tek hücre RNA dizileme ve organoid kültürleri için sağlıklı hücreler sağlar.

Embriyonik Gün 12.5 ve 8 Haftalık Farelerin Dil Epitel ve Mezenkim/Bağ Dokusundan Hücre Ayrışması

Daha fazla video keşfet