Embriyonik Gün 12.5 ve 8 Haftalık Farelerin Dil Epitel ve Mezenkim/Bağ Dokusundan Hücre Ayrışması

Karmaşık dokulardan gelen hücrelerin yüksek verimi ve kalitesi, tek hücreli RNA dizilimi ve birincil kök hücre kültürleri gibi yaygın olarak kullanılan deneysel analizler için gereklidir. Bu protokol, dil epitel ve bağ dokusu da dahil olmak üzere memeli dilinin farklı bölgelerinden ve doku bölmelerinden yüksek verim ve kalitede sağlıklı hücreler üretir. Epitelleri bir E 12.5 fare dilinin mezenkiminden ayırmak için, ötenazili hamile kadın fareyi cerrahi bölgeye aktarın ve kürkün ameliyat bölgesine girmesini önlemek için fare karnını% 70 etanol ile ıslatın.

Embriyoları taşıyan rahim boynuzlarını ortaya çıkarmak için diseksiyon makası kullanarak karnı açın, rahim boynuzlarını parçalara ayırın ve 100 milimetrelik bir kültür çanağına 15 mililitre taze Tirot çözeltisine aktarın. Bir diseksiyon mikroskobu altında, embriyoları rahim boynuzlarından parçalamak için mini makas ve ince tokmaklar kullanın. Ağız boşluğunu ince önps ile açın ve mini makas kullanarak dili mandibuladan kesin.

Dilleri 100 milimetrelik bir kültür çanağına 15 mililitre taze steril Tyrode çözeltisi ile yıkayın. Daha sonra dokuları 35 milimetrelik bir kültür çanasında dispaz ve kollajenöz enzim karışımının iki mililitresine aktarın ve 37 santigrat derecede 20 dakika kuluçkaya yatırın. Dilleri 15 mililitre taze steril Tyrode çözeltisine aktarın ve mezenkim ve epitelleri ince forseps kullanarak ventral taraftan hafifçe ayırın.

Ayrılmış epitel ve mezenkimleri 15 mililitre taze steril Tyrode çözeltisinde iki kez yıkayın. Dil epitelini yetişkin bir farenin alttaki bağ dokusundan ayırmak için, ötenazili fareyi cerrahi bölgeye aktarın ve kürkün ağız boşluğuna girmesini önlemek için% 70 etanol kullanarak fare kafasını ıslatın. Ağız boşluğunu açmak için ağız köşelerini yanak boyunca kesmek için kesme makası kullanın.

Dili bir mandibula ile parçalara bölün, yıkayın ve plastik bir tabakaya plastik bir sargı tabakası ile yerleştirin. Dili tutmak için cerrahi tokmaklar kullanarak, dilin subepithelial uzayındaki dispaz ve kollajenaz enzim karışımını arka dilin kesme kenarından enjekte edin. Doku toplanması için tüm dil için bir mililitre enzim karışımını eşit olarak enjekte edin, ardından dil ucundan doku toplanması için ön dile veya circumvallate papilla doku koleksiyonu için arka diline lokal olarak 0,5 mililitre enzim karışımı enjekte edin.

Dili plastik sargı ile sarın ve 37 santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya bırakın. Circumvallate papilla ve dil ucunu parçalamak için mini makas kullanın. Daha sonra bir dokuyu 15 mililitre taze steril Tyrode çözeltisine aktarın.

Epitelleri, aşağı akış deneylerinin gereksinimine göre, mini makas kullanarak sindirilmiş subepithelial alandaki alttaki bağ dokusundan ayırın ve dokuları uygun bir boyuta kırpın. Ayrılmış epitel ve alttaki bağ dokusunu 15 mililitre taze steril Tyrode çözeltisinde 100 milimetrelik bir kültür çanağına iki kez yıkayın. Dokuları yeni bir 35 milimetrelik kültür çanağıyla %0,25 trypsin EDTA'nın üç mililitresine aktarın.

Yemeği 37 santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın, her beş dakikada bir bir mililitre pipet uçlarıyla dokuları hafifçe çalkalayın. Reaksiyonu durdurmak ve ortamı beş mililitre düşük bağlayıcı santrifüj tüpüne aktarmak için DMEM F12'ye 500 mikrolitre %5 FBS ekleyin. Hücre süspansiyonu oda sıcaklığında sekiz dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleyin ve üst yapıyı çıkarın.

Hücreleri%10 FBS ve %1 BSA içeren üç mililitre DMEM F12'de hafifçe yeniden biriktirin ve hücreleri 70 mikrometre hücre süzgeci ve ardından 35 mikrometre hücre süzgeci ile filtreleyin. Hücre süspansiyonu oda sıcaklığında sekiz dakika boyunca 200 kez G'de santrifüjleyin, ardından ortamın çoğunu çıkarın, hücreleri yeniden depolamak için son hacim olarak 50 ila 300 mikrolitre bırakın. Embriyonik fare dilinde, uygun enzim sindiriminden sonra subepithelial boşlukta bir boşluk görülür.

Yetişkin fare dilinde, enjekte edilen bölgelerde şişme ile başarılı bir enzim enjeksiyonu belirtilir, bu da enzimin dil tarafından tutulabileceğini gösterir. E12.5 dillerin epitel levhalarını ve ince mezenkim katmanlarını biriktikten sonra, manuel hücre sayımı, protokolün epitel levhalardan% 95.2 canlılık ile toplamda 63, 917 hücre ve mezenkimden% 96.3 canlılık ile toplamda 294, 333 hücre sağladığını göstermiştir. Sekiz haftalıkken 10 yetişkin dili kullanıldığında, protokol, dil ucunun epitel tabakalarından %95,4 canlılığa sahip 187, 333 hücre, circumvallate papillanın epitel tabakalarından %96,3 canlılığa sahip 544,000 hücre ve bağ dokularından %93 canlılığa sahip 150.500 hücre elde etti.

Bu protokolden sonra, ayrışmış hücreler, tek hücreli RNA dizilimi ve 3D test organoid kültürü için lingual epitel altında tanınmayan test progenitör hücrelerini tanımlamak için kullanılabilir.