Tadı Uyaranlara Fare Genikül Ganglion Nöron Yanıtlarının In vivo Kalsiyum Görüntülemesi

Bu teknik, iç chorda tympani tat yolunun önemli bir parçası olan genikül gangliyonunda tatmak için nöronal yanıtlar hakkında önemli fonksiyonel soruları yanıtlayabilir. Bu teknik, tek bir deneysel denemede birden fazla bireysel nöronun gerçek zamanlı reaksiyonlarını izlemek için kullanılabilir, çünkü hayvan başına kaydedilen hücreler elektrofizyolojik yöntemle tipik olarak gözlenenden önemli ölçüde daha yüksektir. Baş direğine monte edilmiş fare bir ısıtma yastığı üzerinde supine konumundayken, ciltte sternumdan çeneye kadar iki santimetrelik bir orta çizgi kesisi yapın.

Digastrik kasları tamamen açığa çıkarmak için deri ve maksiller altı bezleri geri çek. Dikişi paratracheal kas yapısında tespit ettikten sonra, dikişi künt diseksiyonla ayırın ve açmak için dokuyu geri çekin. Trakeanın çapını yarıya kadar kesmeden bir parça polietilen boruya sığacak kadar büyük olan trakeanın üst kısmındaki bir açıklığı dikkatlice kesin ve boruyu akciğerlere doğru trakeaya yerleştirin.

Paratrakial kasları serbest bırakmak ve alt maksiller bezleri geri çekmek için retraktörleri yeniden konumlandırın. Daha sonra, paratracheal kasları tüp üzerinde birbirine kapatmak için az miktarda veteriner yapıştırıcısı kullanın. Tympanic bulla'yı kırmak için, istenen digastrik kası yukarı doğru hafifçe kızdırin ve bağ dokusunu ayırın.

Kan damarlarından kaçınarak kasın ön ucunda bir kesi yapın. Ve tympanic bulla'dan temizlene kadar arka arkaya çekin. Tympanic bulla'yı kaldırmak ve karotis arter ön kısmının dalını digastrik kasın arka yerleştirme noktasına bulmak için başı hafifçe geriye doğru eğin.

Tirpanik bullanın dışbükey yapısı için bu kan damarının sadece arkasını palpate edin ve kas yapısında bir dikiş bulun. İki ince toka seti kullanarak, timpanik bullanın kemiği görünene kadar dikişte künt diseksiyon yapın ve kemiğin net bir görünümünü korumak için retraktörler kullanın. Bulla üzerinde arka tarafta ön tarafta çalışan dikişi bulun ve dikişin ortasındaki kemikte bir delik açmak için cerrahi bir prob kullanın, Ardından, kemikte dairesel bir alanı kesmek için bir dizi ince uç makası kullanın, kan damarları ön ve arkasını bullanın içine veya altına kesmemeye dikkat edin.

Genikülleri açığa çıkarmak için kokleayı bulun. Kokleanın ön ucu tensör tympani kasıdır. Bu kası kesmek ve çıkarmak için yay makası kullanın.

Koklear promontory'de bir delik açmak için cerrahi probu kullanın ve delikten akan herhangi bir sıvıyı emmek için hemen emme kullanın. Kokleayı çevreleyen kan damarına, arka ve yanal kenara zarar vermemeye dikkat ederek kokleadaki deliği büyütün. Ve farenin başını öne doğru eğerek eski koklear yapının altındaki zamansal kemikteki deliği bulun.

Sırt ön kısmının, yedinci sinirin hemen üzerine oturan deliğe dikkat edin. Ve yedinci siniri açığa çıkarmak için zamansal kemiğin dikkatlice kaldırılmasını sağlamak için deliğe cerrahi bir sonda yerleştirin. Genikül tam olarak görünmüyorsa, hayvanın başını hafifçe geriye doğru eğin ve kemik ön kenarını sinire çekmeye çalışın.

Gangliyon hala gizlenmişse, aşağıdan daha fazla kemik çekin, sondayı kemiğin derinlerine yerleştirmemeye dikkat edin, çünkü bu geniküle zarar verebilir. Lezzetli paneli çalıştırmak için, sıvıyı geniş bir yüzeyden çıkarmak için emişli kullanın ve fareyi bir diseksiyon mikroskobu altında emici bir ped üzerine yerleştirin. Bulla'da kalan deliği, temporal kemikteki deliği ve genikül ganglionu bulmak için yedinci siniri kullanın.

Ve genikül ganglion nöronlarını ifade eden bireysel GCaMP'yi kontrol etmek için epifluoresan dürbündeki FITCGFP filtresini kullanın. Bir tastant hattı için dağıtım iğnesini hayvanın ağzına sıkıca yerleştirin ve herhangi bir sıvıyı yakalamak için ağzın altına bir Petri kabı yerleştirin. Video kaydının başlangıcını, kayıt sırasında yanıtlar, sürüklenme ve sızıntı için canlı akışı izleyerek, lezzetli sunumun başlangıcıyla senkronize edin.

Sızıntı meydana gelirse, genikül görünümü net olana kadar sıvıyı emiş edin ve lezzetliyi yeniden bildirin. Sürüklenme meydana gelirse, baş direğin tüm kısımlarının sıkıca sıkılıp sıkıldığını kontrol edin. Yanıt alınmazsa, sıvının akıp aktığını ve mikroskop ve kameranın görüş alanını gizleyen bir şey olmadan uygun konuma odaklanıp odaklanmadığını kontrol edin.

İstenilen tüm deneyler tamamlandığında, retraktörleri hafifçe gevşetin ve hayvanın karşı tarafındaki maruziyet ve şok analizini tekrarlayın. Gözlemlendiği gibi, dile uygulanan tat uyaranları GCaMP floresanında hızlı bir geçici artışa neden olmalı ve yanıt veren nöronlar arasında parlaklıkta gözle görülür bir değişikliğe neden olmalıdır. Floresan video görüntülerinin analizi, zaman içinde tek tek ilgi çekici bölgelerdeki temel yanıt üzerindeki floresan değişikliklerine karşılık gelen izlerin üretilmesini sağlar.

Eşik seviyesinin üzerindeki floresan yoğunluğundaki değişiklikler olumlu bir yanıt olarak kabul edilir. Gangliyona zarar vermenin yanı sıra kanamayı önlemek önemlidir. Kanama meydana gelirse, kanı görme alanından çıkarmak için salin ve emme uygulamadan önce kanın pıhtılaşmasını bekleyin.

Genikül gangliyonunun görselleştirilmesi, araştırmacıların nöronların tat benzeri uyaranlara verdiği tepkileri doğrudan ölçmelerine ve bu nöronları Cre'ye bağımlı GCaMP gibi araçlarla tanımlamalarına izin sağlamıştır.