Membranlar Arasında Fosfataylserine/Fosfatidiylinositol 4-Fosfat Değişiminin Floresan Bazlı Ölçümleri

Bu yöntem, biyolojik olarak önemli bir liqid'e bir protein transferinin sentetik membran arasında olup olmadığını belirlemek ve böylece bu lipitlerin ökaryotik hücreler içinde dağılımına katkıda bulunmak için floresan kullanır. Bu teknik, doğal bir lipitin bir protein tarafından çıkarılmasını ve taşınmasını mümkün kılar, yapılması kolay hücreler ve lipozomlar gerektirir ve gerektirir. Bu yöntem, bazı temel lipitlerin organ ve zarlar arasında dağılımının arkasındaki proteinler tarafından hücresel biyoloji hakkında fikir almak için kullanılabilir ve değiştirilebilir.

Görsel gösterim, floresan ile lipit transferinin gerçek zamanlı ölçümlerinin nasıl gerçekleştirildiğini açıklamak için kritik öneme sahiptir. Prosedürü gösteren aynı zamanda Maud Magdeleine olacak, laboratuvarımın mühendisi. HKM tamponu oluşturmak için bir milimoler magnezyum klorür ile desteklenmiş taze filtrelenmiş ve gazsız HEPES potasyum asetat tamponu hazırlayarak başlayın.

Ardından, sadece PC'den yapılmış veya ek olarak yüzde iki azı dişi PS veya PI(4)P ile doped lipozomlar hazırlayın. Şimdi, lipid'i vakum altında kurutmak için şişeyi bir döner evaporatöre yerleştirin. Bir kuyuda, lipid sensörü NBD-C2 Lact ile iki azı dişi PS içeren lipozomları 250 nanomoler ve 100 mikrolitrelik bir hacimde son konsantrasyonda karıştırın.

İkinci bir kuyuyu üç mikromoler lipid transfer proteini veya LTP ile karıştırılmış aynı miktarda lipozom ve NBD-C2 lakt ile doldurun. Üçüncü bir kuyuyu saf 80 mikromolar PC lipozomları ile karıştırılan 250 nanomolar NBD-C2 lakt ve saf 80 mikromolar PC lipozomları ile dördüncü bir kuyu ile doldurun. Dört kuyudan oluşan üç ek seri hazırlamak için bu adımları tekrarlayın.

Daha sonra çok kuyulu plakayı floresan okuyucuya yerleştirin. Her kuyu için 25 santigrat derecede 490 nanometrede heyecanlanma üzerine beş nanometre bant genişliğine sahip 505 ila 650 nanometre arasında bir NBD spektrumu kaydedin. Her seri için, diğer spektrumdan sadece lipozomlarla kaydedilen spektrumu çıkarın.

PI(4)P ekstraksiyon tahlil için iki azı dişi yüzde fosfatilinositol-4-fosfat ile dopd lipozomlar hazırlamak ve NBD-PH FAPP prob ile ölçümler yapmak. Kontrol deneyleri gerçekleştirin ve ayıklama yüzdesini belirleyin. Ekstrüde lipozomları bitirdikten sonra bir tüpü bu ekstrüde lipozomlarla doldurun.

Yeni gazdan arındırılmış ve filtrelenmiş HKM tamponu hazırlayın ve ekstrüde lipozom içeren tüpleri oda sıcaklığında tutun. Lipozom içeren tüpleri alüminyum folyoya rhodamin etiketli fosfatidylethanolamine ile sarın ve herhangi bir fotoğraf ağartmasını önlemek için opak bir kutuda saklayın. Sıcaklığı 25 ila 37 santigrat derece arasında ayarlayın ve heyecan monokrommetrelerini bir ila üç nanometrelik kısa bant genişliğine sahip 460 nanometreye ve emisyonu 10 nanometreden büyük büyük bant genişliğine sahip 530 nanometreye ayarlayın.

En fazla bir saniyelik zaman çözünürlüğüyle edinme süresini yirmi beş dakika olarak ayarlayın. Kuvars cuvette LA lipozom süspansiyon ve NBD-C2 lakt stok çözeltisinin 30 mikrolitresini seyreltin ve 200 mikromoler toplam lipit ve 250 nanomoler veya NBD-C2 lakt içeren 570 mikrolitrelik bir örnek hazırlamak için ısıtma öncesi HKM tamponu. Küçük bir manyetik karıştırma çubuğu ekleyin ve cuvette'i florometre tutucusuna yerleştirin.

Numune termal olarak dengelendikten sonra ölçümü tetikleyin. Bir dakika sonra, numuneye 30 mikrolitre LB lipozom süspansiyonu ekleyin. Üç dakika sonra LTP'yi numuneye enjekte edin, böylece LTP'nin son konsantrasyonu 200 nanomolardır, ardından kalan 21 dakika boyunca sinyali alın.

NBD sinyalini normalleştirmek için paralel bir deney gerçekleştirin. 30 mikrolitre LA denge lipozom süspansiyonu, 570 mikrolitrelik son hacimde HKM tamponunda 250 nanomolar NBD-C2 lakt ile karıştırın. Bir dakika sonra, 30 mikrolitre LB denge lipozom süspansiyonu enjekte edin.

Zaman içinde LA'den LB lipozomlarına aktarılan PS miktarını belirlemek için ilgi çekici bir LTP ile ölçülen kinetik eğrileri dönüştürün. Ardından eğrinin her veri noktasını normalleştirin. PI(4)P denemesini, PS aktarım tahlili ile aynı zemin yayıcı ayarlarını ve koşullarını kullanarak gerçekleştirin.

Cuvette, 30 mikrolitre lb lipozom süspansiyonu ve NBD-PH FAPP probunu önceden ısıtılmış HKM tamponu ile karıştırarak 570 mikrolitrelik son bir hacim elde edin. Numunenin termal dengeye ulaşıldıktan sonra ölçüme başlayın. Bir dakika sonra, 30 mikrolitre LA lipozom süspansiyonu enjekte edin.

Üç dakika sonra, LTP'ye ilgiyi enjekte edin ve sinyali kaydedin. NBD sinyalini normalleştirmek için ikinci bir deneme gerçekleştirin. 30 mikrolitre lb denge lipozom süspansiyonunu 250 nanomoler NBD-PH FAPP ve 570 mikrolitre HKM tampon ile karıştırın.

Bir dakika sonra, 30 mikrolitre LA denge lipozom süspansiyonu enjekte edin. Zaman içinde LB'den LA lipozomlarına aktarılan PI(4)P miktarını belirlemek için kinetik eğrileri dönüştürün, ardından her veri noktasını normalleştirin. LTP'nin ne ölçüde verimli olduğunu ölçmek için.

Eğim elde etmek için aktarım kinetiğinin ilk veri noktalarının doğrusal bir gerilemesini gerçekleştirin. Zaman birimi başına protein başına aktarılan lipit moleküllerinin sayısını belirlemek için eğim değerini reaksiyon karışımındaki LTP konsantrasyonuna bölün. C2 laktının boncuklardan verimli bir şekilde kurtarılması SDS sayfa analizi ile doğrulandı.

NBD ile etiketlenmiş C2 laktının ultraviyole görünür emici spektrumu, tüm C2 lakt moleküllerinin bir NBD grubu ile etiketlendiğini doğruladı. NBD-C2 laktının saflığı ve floresanları SDS sayfa analizi ile belirlendi. NBD-C2 lakt veya NBD-PH FAPP'ın floresanları, inkübasyon için sadece PS veya PI(4)P içeren lipozomlar kullanıldığında maksimaldi, bu da sensörün zara bağlı olduğunu gösteriyordu.

Osh6p de mevcut olduğunda, bu proteinin lipozomlardan PS veya PI(4)P'yi verimli bir şekilde çıkardığını gösteren düşük bir floresan görüldü. LTP olarak Osh6p kullanan bir PS aktarım tahlilinin sonuçları gösterilir. PS'nin LA lipozomlarından LB lipozomlara, doped veya fosfatidylinositol-4-fosfat ile doped olmayan ortalama kinetik eğrileri hesaplandı.

Ortalama ilk PS aktarım hızı üç farklı deneyden belirlendi. Benzer şekilde, LTP olarak Osh6p kullanan bir PI(4)P aktarım tahlilinin sonuçları burada gösterilmiştir. Sinyal normalleştirmeden sonra elde edilen ortalama kinetik eğrilerle birlikte.

Ortalama transfer oranları, PS ile doped veya doped olmayan LA lipozomları ile ölçüldü. Bu protokolü gerçekleştirirken taze arabellek kullanın ve aynı günleri hazırlayın. Floresan lipozomların ve proteinlerin hafif sergisini en aza indirin, iyi saflaştırılmış NBD etiketli protein kullanın ve onları buzda tutun. genetik olarak kodlanmış floresan lipit sensörleri kullanılarak prokaryotik hücre içindeki organel arasında PS ve PI(4)P transferi ölçülerek doğrulanabilir.

Bu teknik, PS ve PI(4)'ün hücre içinde dağıtıldığını ve etkinliklerinin birkaç LTPS özgüllüğünden geçtiğini daha iyi anlamanın bir yolunu sağlar.