Name: Membranlar Arasında Fosfataylserine/Fosfatidiylinositol 4-Fosfat Değişiminin Floresan Bazlı Ölçümleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Öğrenin, floresan bazlı ölçümlerle fosfatidilserin ve fosfatidilinozitol 4-fosfat transferini incelemeyi. Bu yöntem, Osh6p proteininin lipit transfer kinetiğini niceliksel olarak analiz etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. A. Cuttriss'e el yazmasını dikkatli bir şekilde düzelttikleri için minnettarız. Bu çalışma Fransız Ulusal Araştırma Ajansı hibe ExCHANGE (ANR-16-CE13-0006) ve CNRS tarafından finanse edilmektedir.

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Bu tahlillerin sonuçları doğrudan floresan lipid sensörlerinin sinyallerine dayanır. Bu nedenle, NBD ile 1:1 oranında etiketlenen ve serbest NBD florofor kontaminasyonu olmadan etiketlenen bu probların saflaştırılması bu protokolde kritik bir adımdır. Muayene edilen LTP'nin düzgün bir şekilde katlanıp katlanmadığını ve toplanmadığını kontrol etmek de zorunludur. Bu LTP'nin bu lipitleri verimli bir şekilde çıkarıp çıkarmadığını düzgün bir şekilde ölçmek için ekstraksiyon testlerinde test edilen LTP miktarı erişilebilir PS...

Lipitlerin farklı membranlar arasında ve ökaryotik hücrelerin zarları içinde kesin dağılımı1,2 derin biyolojik etkilere sahiptir. LTP'lerin nasıl çalıştığının şifresini çözmek hücre biyolojisinde önemli bir konudur3,4,5,6ve in vitro yaklaşımlar bu sorunu ele almada büyük değere sahiptir 7 ,8,9,10,11. Burada, birkaç ORP/Osh proteininin PS/PI(4)P hücre zarları12 arasındaki değişimi etkilediğini ve böylece yeni bir LTP sınıfı oluşturduğunu belirlemede etkili olan in vitro,floresan tabanlı bir strateji sunulmuştur. PS, ökaryotik hücrelerde toplam membran lipitlerinin% 2-10'unu temsil eden aniyonik bir gliserofsfolipiddir13,14,16. Sırasıyla17, 18,19 gliserofosfolipidlerin% 5-7'sini ve% 30'unu temsil ettiği ER ve PM arasında birgradyanboyuncadağıtılır. Ayrıca, PS esasen PM'nin sitosolik broşüründe yoğunlaşmıştır. Bu birikme ve PM'deki PS'nin düzensiz bölümü hücresel sinyal işlemleri için kritiktir19. PS moleküllerinin negatif yükü nedeniyle, PM'nin sitosolik broşürü, diğer organellerin sitozolitik broşürü 1,2,19,20'dençok daha anioniktir. Bu, elektrostatik kuvvetler aracılığıyla işe alıma olanak sağlar, miristosilat alanin bakımından zengin C-kinaz substratı (MARCKS)21, sarkom (Src)22, Kirsten-rat sarkom viral onkogen (K-Ras)23ve Ras ile ilgili C3 botulinum toksin substratı 1 (Rac1)24 gibi pozitif yüklü amino asitler ve lipidik kuyruk içeren sinyal proteinleri.
PS ayrıca geleneksel protein kinaz C tarafından stereoselektif bir şekilde C2 etki alanı25 aracılığıyla tanınır. Ancak, PS sentezlendi ER26, rolünü oynayabilmesi için PM'ye dışa aktarılması gerektiğini gösterir. Mayada, Osh6p ve Osh7p'nin PS'yi ACIL'den PM27'yeaktardığı bulguya kadar bunun nasıl19'a başarıldığı bilinmiyordu. Bu LTP'ler, kurucu üyesi OSBP olan ve bir lipid molekülü barındırmak için OSBP ile ilgili bir etki alanını (ORD) bir ceple entegre eden proteinler (insanda ORP'ler, mayadaki Oş proteinleri) içeren ökaryotlarda evrimsel olarak korunmuş bir aileye aittir. Osh6p ve Osh7p, yalnızca yapısal özellikleri PS'yi özellikle bağlamak ve membranlar arasında aktarmak için uyarlanmış bir ORD'den oluşur. Bununla birlikte, bu proteinlerin PS'yi acil servisten PM'ye nasıl aktardığı belirsizdi. Osh6p ve Osh7p, PI(4)P'yi alternatif bir lipid ligand12olarak hapsedebilir. Mayada PI(4)P, Golgi ve PM'deki fosfatidylinositol'den (PI) sırasıyla PI 4-kinaz, Pik1p ve Stt4p ile sentezlenmiştir. Buna karşılık, ER membranında PI(4)P yoktur, çünkü bu lipit Sac1p fosfataz tarafından PI'ye hidrolize edilir. Bu nedenle, hem ER/Golgi hem de ER/PM arabirimlerinde bir PI(4)P gradyanı bulunur. Osh6p ve Osh7p, bu iki membran arasında bulunan PI(4)P gradyanını kullanarak PS/PI(4)P değişim döngüleri aracılığıyla PS'den PM'ye TRANSFER12.
Bir döngü içinde, Osh6p ACIL'den PS çıkarır, PM'de PI(4)P için PS değiştirir ve başka bir PS molekülü çıkarmak için PI(4)P'yi ER'ye geri aktarır. Osh6p / Osh7p ist2pile etkileşime girer 28, ER membranını ve PM'yi birbirine bağlayan ve yakın bir hale getiren birkaç proteinden biri maya29,30,31'deER-PM temas siteleri oluşturmak için. Ek olarak, Osh6p'nin negatif yüklü membranlarla ilişkisi, protein lipid ligandlarından birini elektrostatik özelliklerini değiştiren konformasyonsal bir değişiklik nedeniyle çıkarır çıkarmaz zayıflar32. Bu, membran tutma süresini kısaltarak Osh6p'ye yardımcı olur, böylece lipid transfer aktivitesinin verimliliğini korur. Ist2p'ye bağlama ile birlikte, bu mekanizma Osh6p/7p'nin ER/PM arabiriminde lipid değişimini hem hızlı hem de doğru bir şekilde yürütmesine izin verebilir. İnsan hücrelerinde, ORP5 ve ORP8 proteinleri ER-PM temas bölgelerinde PS/PI(4)P değişimini farklı mekanizmalar aracılığıyla yürütür33. Osh6p'ye benzeyen merkezi bir ORD'ye sahiptirler, ancak doğrudan bir C terminali transmembransegmenti 33 aracılığıyla ACIL'ye bağlanırlar ve PI(4)P ve PI(4,5)P233 , 34,35'i tanıyan bir N terminali Pleckstrin homolojisi (PH) etki alanı aracılığıyla PM'ye yanaşırlar. ORP5/8, PS'yi aktarmak için PI(4)P kullanır ve ORP5/8'in PM PI(4,5)P2 seviyelerini ayrıca düzenlediği ve muhtemelen sinyal yollarını modüle ettiği gösterilmiştir. Buna karşılık, PI(4)P ve PI(4,5)P2 seviyelerindeki bir düşüş, bu proteinler PIP'e bağlı bir şekilde PM ile ilişkili olduğu için ORP5 / ORP8 aktivitesini düşürür. Lenz-Majewski sendromuna yol açan anormal derecede yüksek PS sentezi, ORP5/836aracılığıyla PI(4)P seviyelerini etkiler. Her iki proteinin aktivitesi engellendiğinde, PS PM'de daha az bol hale gelir ve proteinlerin onkojenik yeteneğini düşürür37.
Tersine, ORP5 aşırı ifade kanser hücre invazyonunu ve metastatik süreçleri teşvik ediyor gibi görünüyor38. Bu nedenle, ORP5/8 aktivitesindeki değişiklikler lipid homeostazındaki değişikliklerle hücresel davranışı ciddi şekilde değiştirebilir. Ayrıca, ORP5 ve ORP8 ER-mitokondri temas alanlarını işgal ediyor ve muhtemelen PS39sağlayarak bazı mitokondriyal işlevleri koruyor. Ayrıca ORP5, PS/PI(4)P exchange40ile LIPID damlacıklarına PS teslim etmek için ER-lipid damlacık iletişim sitelerine yerelleştirir. Burada açıklanan strateji, (i) PS ve PI(4)Lipozomlardan P ekstraksiyonunu ve (ii) LIPOMLAR ARASıNDAKI PS ve PI(4)P naklini ölçmek için Osh6p/Osh7p12,32'nin PS/PI(4)P değişim aktivitesini kurmak ve analiz etmek için tasarlanmıştır ve diğer gruplar tarafından ORP5/ORP835 ve diğer LTP10'larınaktivitesini analiz etmek için kullanılmıştır. 41. Bir floresan plaka okuyucu, standart bir L-format spektrofluorometre ve sırasıyla PS ve PI(4)P'yi algılayabilen iki floresan sensör, NBD-C2Lact ve NBD-PHFAPPkullanımına dayanmaktadır.
NBD-C2Lact, glikoprotein, lactadherin'in C2 etki alanına karşılık gelir, bu da varsayılan PS bağlama bölgesinin yakınında benzersiz bir çözücüye maruz kalan sistein içerecek şekilde yeniden tasarlanmıştır; polariteye duyarlı bir NBD (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol) floroforu bu kalıntıya yaygın olarak bağlıdır (Şekil 1A)12. Daha kesin olmak gerekirse, lactadherin C2 etki alanı (Bos taurus, UniProt: Q95114, kalıntılar 270-427) Escherichia coliglutatyon S-transferaz (GST) ile füzyon ifade etmek üzere bir pGEX-4T3 vektör içine klonlanmıştır. C2Lact dizisi daha sonra iki solventle erişilebilir sistein kalıntısını (C270, C427) alanin kalıntıları ile ve daha sonra N,N'-dimetil-ile etiketlenebilen putatif PS-bağlama bölgesinin (H352C mutasyonu) yakınındaki bir bölgeye sistein kalıntısı sokmak için N-(iodoacetyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) etilen diamin (IANBD) 12. GST proteini ile C2 alanının N-terminusu arasında trombin için bir bölünme bölgesi bulunur. Önemli bir avantaj, bu etki alanının PS'yi bilinen diğerC2alan adlarına veya Annexin A542'yeaykırı olarak Ca 2+ bağımsız bir şekilde seçici olarak tanımasıdır. NBD-PHFAPP, PI(4)P bağlama bölgesinin yakınındaki bir NBD grubu ile etiketlenebilen tek bir solvent maruziyeti sistein içerecek şekilde yeniden tasarlanmış insan dört fosfat adaptör proteini1'in (FAPP1)PH etki alanından türetilmiştir ( Şekil 1A )43. İnsan FAPP proteininin PH etki alanının nükleotid dizisi (UniProt: Q9HB20, segment [1-100]), bir GST etiketiyle birlikte ifade edilecek bir pGEX-4T3 vektörüne klonlanmıştır. PHFAPP dizisi, protein43'ünmembran bağlayıcı arayüzüne benzersiz bir sistein kalıntısı eklemek için değiştirilmiştir. Ayrıca, proteazlara erişilebilirliği sağlamak için trombin bölünme bölgesi ile PH alanının N-terminus'u arasında dokuz kalıntılı bir bağlayıcı getirilmiştir.
Lipozomlardan PS ekstraksiyonunu ölçmek için NBD-C2Lact, eser miktarda PS içeren fosfatidiylcholine (PC) yapılmış lipozomlarla karıştırılır. PS'ye olan yakınlığı nedeniyle, bu yapı lipozomlara bağlanır ve NBD floroforu, zarın hidrofobik ortamıyla temas ettikçe polaritede bir değişiklik yaşar ve bu da mavi kayma ve floresan artışı sağlar. PS neredeyse tamamen bir stoichiometric LTP miktarı ile ayıklanırsa, prob lipozomlarla ilişkilendirmez ve NBD sinyali daha düşüktür (Şekil 1B)32. Bu sinyal farkı, bir LTP'nin(örneğin, Osh6p) PS'yi ayıklayıp ayıklamadığını belirlemek için kullanılır. Benzer bir strateji, daha önce açıklandığı gibi PI(4)P ekstraksiyonunu (Şekil 1B) ölçmek için NBD-PHFAPP ile kullanılır12,32. (i) SıRASıYLA ER membranını ve PM'yi taklit eden LA'dan LB lipozomlarına PS taşımacılığını ve (ii) PI(4)P taşımasını ters yönde ölçmek için iki FRET tabanlı test tasarlanmıştır. Bu tahliller PS/PI(4)P değişimini ölçmek için aynı koşullar(yani aynı tampon, sıcaklık ve lipid konsantrasyonu) altındagerçekleştirilir. PS taşımacılığını ölçmek için, NBD-C2Lact PC'den oluşan L A lipozomları ile karıştırılır ve 5 mol% PS ve 2 mol% 5 mol PI (4) P içeren floresan rhodamin etiketli fosfatidylethanolamine (Rhod-PE) ve LB lipozomları ile karıştırılır.
Sıfır noktasında, Rhod-PE'li FRET, NBD floresanını bastırır. PS LA'dan LB lipozomlarına taşınırsa(örneğin, Osh6p enjekte edildikten sonra), NBD-C2Lakt moleküllerinin LA'dan LB lipozomlarına translokasyonu nedeniyle hızlı bir söndürme meydana gelir (Şekil 1C). Erişilebilir PS miktarı göz önüne alındığında, NBD-C2Lact esasen deney boyunca zara bağlı bir durumda kalır12. Bu nedenle, NBD sinyalinin yoğunluğu, NBD-C2Lakt'in LA ve LB lipozomları arasındaki dağılımıyla doğrudan ilişkilidir ve ne kadar PS aktarıldığını belirlemek için kolayca normalleştirilebilir. PI(4)P'nin ters yönde transferini ölçmek için, NBD-PHFAPP LA ve LB lipozomları ile karıştırılır; Sadece PI(4)P içeren LB lipozomlarına bağlandığı, ancak Rhod-PE'ye bağlanmadığı göz önüne alındığında, floresan yüksektir. PI(4)P LA lipozomlarına transfer edilirse, bu lipozomlara doğru hareket eder ve Rhod-PE ile FRET nedeniyle sinyal azalır (Şekil 1C). Sinyal, ne kadar PI(4)P aktarıldığını belirlemek için normalleştirilir43.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; L-sistein ve ge; 97 % (FG)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>W326305-100G</td><td>Suda 10 mM L-sistein stok çözeltisi hazırlayın. Alikotlar -20 °C'de saklanır; C</td></tr><tr><td>2 mL Amber Şişe, PTFE / Rub Lnr, CHCL 3 </td><td>Wheaton</td><td>W224681</td><td></td></tr><tr><td>4 mm çapında cam boncuklarda</td> lipit saklamak için <td>Sigma</td><td>Z265934-1EA</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konik santrifüj tüpü</td><td>Falcon</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>& Auml; KTA temizleyici</td><td>GE healthcare</td><td></td><td>FPLC</td></tr><tr><td>Alüminyum folyo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 ve 10 kDa Merck UFC900324 MWCO'lu Amicon Ultra-15, 3 ve 10 kDa</td><td></td><td></td> MWCO'lu UFC901024 <td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4</td><td>Merck</td><td>UFC800324, UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin</td> Filtrelenmiş ve sterilize edilmiş su ile 50 mg / mL'lik <td></td><td></td><td>bir stok çözeltisi hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın. derece;C.</td></tr><tr><td>Bestatin</td><td>Sigma</td><td>B8385-10mg</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Altın Yetkin Hücreler</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C16:0 Liss&nbsp; (Rhod-PE) CHCl3 (1 mg / mL)</td> <td>içinde Avanti Polar Lipidler</td><td>810158C-5MG</td><td></td></tr><tr><td>C16: 0 / C16: 0-PI (4) P ve nbsp; &nbsp;</td><td>Echelon Lipids</td><td>P-4016-3</td><td>1 mg C16: 0 / C16: 0-PI (4) P tozunu 250 & mikroda çözün; L MeOH ve 250 &mikro; CHCl3'nin L'si. Daha sonra CHCl3 ile 1 mL ile tamamlayın. Çözüm netleşmeli.</td></tr><tr><td>CHCl3 (10 mg / mL) içinde C16: 0 / C18: 1-PS (POPS)</td> <td>Avanti Polar Lipidler</td><td>840034C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>C18: 1 / C18: CHCl3 (25 mg / mL) içinde (DOPC)</td> <td>Avanti Polar Lipidler</td><td>850375C-500mg</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&nbsp;</td><td>Sigma</td><td></td><td>Suda 10 mM CaCl2 stok çözeltisi hazırlayın.</td></tr><tr><td>Hücre Bozucu</td><td>Sabit Dinamik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kloroform (CHCl3) RPE-ISO</td><td>Carlo Erba</td><td>438601</td><td></td></tr><tr><td>Komple EDTA içermeyen proteaz inhibitör kokteyli</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>Deiyonize (Milli-Q) su</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetilformamid (DMF), susuz, %>99 saf</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAse I Rekombinant, RNAse içermez, toz halinde</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Euromedex</td><td>EU0006-B</td><td>Milli-Q suda 1 M DTT stok çözeltisi hazırlayın. 1 mL alikot hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Econo-Pac kromatografi sütunları (1,5 > 12 cm).</td><td>Biorad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporasyon küveti 2 mm</td><td>Ozyme</td><td>EP102</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporatör Eppendorf 2510</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sabit Açılı Rotor Ti45 ve Ti45 tüpleri</td><td>Beckman</td><td>Pil lizatlarının</td><td></td>eğirilmesi</tr><tr><td>Cam şırıngalar (10, 25 ve 50 &mikro; L) floresan deneyi için</td><td>Hamilton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cam şırıngaları (25, 100, 250, 500 ve 1000 &mikro; L) lipid stok çözeltilerini işlemek için</td><td>Hamilton</td><td>1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN tip3, 1001RN</td><td></td></tr><tr><td>Glutatyon Sefaroz 4B boncukları</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0756-05</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol (%99 saf)</td><td>Sigma</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Kapaklı</td><td></td><td></td><td></td>hemoliz tüpleri</tr><tr><td>HEPES ,% >99 saf</td><td>Sigma</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>Illustra NAP 10 tuz giderme sütunu</td><td>GE healthcare</td><td>GE17-0854-02</td><td></td></tr><tr><td>İzopropil &beta;-D-1-tiyokalaktopiranosit (IPTG)&nbsp;</td><td>Euromedex</td><td>EU0008-B</td><td>Milli-Qwater'da 1 M IPTG stok çözeltisi hazırlayın. 1 mL alikot hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>K-Asetat</td><td>Prolabo</td><td>26664.293</td><td></td></tr><tr><td>Lennox LB Glikozsuz</td><td></td><td></td> et suyu ortamı <td>Mili-Q su ile hazırlanır ve otoklavlanır.</td></tr><tr><td>Sıvı nitrojen</td><td>Linde Metanol</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(MeOH) > % 99.8VWR</td><td></td> <td>20847.24</td><td></td></tr><tr><td>MgCl 2 </td><td>Sigma</td><td></td><td>2 M MgCl 2 çözeltisi hazırlayın. Çözeltiyi 0.45 & mikro kullanarak filtreleyin; m filtresi.&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroplaka 96 Kuyulu PS F-Botom Siyah Bağlayıcı Olmayan</td><td>Greiner Bio-one</td><td>655900</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Ekstruder, iki adet 1 mL gaz geçirmez Hamilton şırınga ile</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>Monokromatör bazlı floresan plaka okuyucu</td><td>TECAN</td><td>M1000 Pro</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-Dimetil-N-(İyodoasetil)-N'-(7-Nitrobenz-2-Oksa-1,3-Diazol-4-il)Etilendiamin) (IANBD Amid)</td><td>Moleküler Problar</td><td></td><td>25 mg IANBD'yi 2.5 mL dimetilsülfoksit (DMSO) içinde çözün ve 100 & mikrodan 25 alikot hazırlayın; 1,5 mL vidalı kapaklı tüplerde L. Kapağı tamamen vidalamayın. Ardından, tüp başına 1 mg kuru IANBD elde etmek için DMSO'yu dondurarak kurutucuda çıkarın. Tüpler kapatılır ve -20 ° C'de saklanır; Karanlıkta C.&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1.8 mM KH2PO4, otoklavlanmış ve 4 ° C'de saklanmıştır.</td></tr><tr><td>Armut biçimli cam şişeler (25 mL, 14/23, Duran camı)</td><td>Duran Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin</td><td>Sigma</td><td>p5318-25mg</td><td></td></tr><tr><td>pGEX-C2LACT&nbsp; plazmit</td><td></td><td></td><td>Laboratuvarımızdan istek üzerine temin edilebilir</td></tr><tr><td>pGEX-PHFAPP plazmit</td><td></td><td></td><td>Talep üzerine laboratuvarımızdan temin edilebilir</td></tr><tr><td>Fenilmetilsülfonil florür (PMSF) &ge; % 98,5 (GC)</td> <td>Sigma</td><td>P7626-25g</td><td>İzopropanol</td></tr><tr><td>Fosforamidon</td><td>Sigma</td><td>R7385-10mg</td><td></td></tr><tr><td>Polikarbonat filtrelerde (19 mm çapında) 200 mM PMSF stok çözeltisi hazırlayın, gözenek boyutu 0.2 & mikro; m</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610006</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Prep kromatografi kolonu (0-2 mL yatak hacmi ve 10 mL rezervuarlı)</td><td>Biorad</td><td>7311550</td><td></td></tr><tr><td>Ön Filtreleri (10 mm çapında).</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610014</td><td></td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>http://pymol.org/</td><td></td> <td>Proteinlerin 3D modellerinin yapımı (Şekil 1A)</td></tr><tr><td>UV/görünür floresan için kuvars küvet (minimum hacim 600 & mikro; L)</td> <td>Hellma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kuvars küvetleri</td><td>Hellma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soğutmalı santrifüj ve nbsp; Eppendorf 5427R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Döner buharlaştırıcı</td><td>Buchi</td><td>B-100</td><td></td></tr><tr><td>Vidalı mikrosantrifüj tüpleri (1,5 mL)</td><td>Sarsted</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Küçük manyetik PFTE karıştırma çubuğu (5 & kez; 2 mm)Geçmeli</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>kapaklı mikrosantrifüj tüpleri (0,5, 1 ve 2 mL)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYPRO turuncu</td><td></td><td></td><td>SDS-PAGE jel Thermomixer</td></tr><tr><td></td><td>Starlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TROMBİN, İNSAN PLAZMASINDAN</td> proteini tespit etmek için floresan <td>leke Sigma</td><td>10602400001</td><td>20 birimi 1 mL mili-Q suda çözün ve 25 & mikro hazırlayın; 0.5 mL Eppendorf tüplerinde L alikotları. Sonra dondurun ve -80 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Tris, ultra saf</td><td>MP</td><td>819623</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj L90K</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV/Görünür absorbans spektrofotometresi</td><td>SAFAS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV/sıcaklık kontrollü hücre tutuculu ve karıştırma cihazlı görünür spektroflorometre</td><td>Jasco veya Shimadzu</td><td>Jasco FP-8300 veya Shimadzu RF-5301PC</td><td></td></tr><tr><td>Vakum odası</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sephacryl S200HR</td><td>GE healthcare</td><td></td><td></td> ile paketlenmiş</tr> <tr><td>su banyosu</td><td>Julabo</td><td></td><td></td></tr> XK 16/70 sütunu</tbody></table>

membranlar arasında fosfataylserine/fosfatidiylinositol 4-fosfat değişiminin floresan bazlı Ölçümleri

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

Evrimsel olarak korunmuş oksisterol bağlayıcı protein (OSBP) ile ilişkili proteinler (ORP)/OSBP homologları (Oş) ailesinin birkaç üyesinin son zamanlarda maya ve insan hücrelerinde yeni bir lipit transfer proteini (LTP) grubunu temsil ettiği bulunmuştur. Fosfatidiylinositol 4-fosfat (PI(4)P) değişim döngüleri ile endoplazmik reticulumdan (ER) plazma membranlarına (PM) fosfatidiylserine (PS) aktarırlar. Bu bulgu, sinyalizasyon işlemleri için kritik olan PS'nin hücre boyunca nasıl dağıtıldığının ve bu işlem ile fosfoinositid (PIP) metabolizması arasındaki bağlantının araştırılmasının daha iyi anlaşılmasını sağlar. Yeni floresan bazlı protokollerin geliştirilmesi, bu yeni hücresel mekanizma in vitro'nun moleküler düzeyde keşfedilmesinde ve karakterizasyonunda etkili olmuştur. Bu makale, bir proteinin PS veya PI(4)P çıkarma yeteneğini ölçmek ve bu lipitleri yapay zarlar arasında aktarmak için floresan etiketli iki lipit sensörünün, NBD-C2Lact ve NBD-PHFAPP'ınüretimini ve kullanımını açıklamaktadır. İlk olarak, protokol bu iki yapının yüksek saflıkta örneklerinin nasıl üretılacağını, etiketlenerek ve elde edilir. İkinci olarak, bu makale, bir proteinin Osh6p'yi vaka çalışması olarak kullanarak lipozomlardan PS veya PI(4)P çıkarıp çıkarabileceğini belirlemek için bu sensörlerin floresan mikro plaka okuyucu ile nasıl kullanılacağını açıklar. Son olarak, bu protokol, tanımlanmış lipid bileşiminin lipozomları arasındaki PS/PI(4)P değişiminin kinetiğinin nasıl doğru bir şekilde ölçüleceğini ve standart bir florometre kullanılarak floresan rezonans enerji transferi (FRET) ile lipid transfer oranlarının nasıl belirleneceğini göstermektedir.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62177/62177fig01.jpg"> Şekil 1: Floresan lipit sensörlerinin ve in vitro tahlillerin açıklaması. (A) Sığır laktadherin C2 etki alanının kristal yapısına (PDB ID: 3BN648)ve insanFAPP1 proteininin PH alanının NMR yapısına dayanan NBD-C2Lact ve NBD-PH FAPP'ın üç boyutlu modelleri (PDB ID: 2KCJ46)...

Burada, bir proteinin fosfatidiylserine veya fosfatidiliinositol 4-fosfat in vitro'yuayıklayıp taşımadığını belirlemek için floresan lipid sensörleri ve lipozomlar kullanarak protokolleri açıklıyoruz.

Membranlar Arasında Fosfataylserine/Fosfatidiylinositol 4-Fosfat Değişiminin Floresan Bazlı Ölçümleri

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

Bu yöntem, biyolojik olarak önemli bir liqid'e bir protein transferinin sentetik membran arasında olup olmadığını belirlemek ve böylece bu lipitlerin ökaryotik hücreler içinde dağılımına katkıda bulunmak için floresan kullanır. Bu teknik, doğal bir lipitin bir protein tarafından çıkarılmasını ve taşınmasını mümkün kılar, yapılması kolay hücreler ve lipozomlar gerektirir ve gerektirir. Bu yöntem, bazı temel lipitlerin organ ve zarlar arasında dağılımının arkasındaki proteinler tarafından hücresel biyoloji hakkında fikir almak için kullanılabilir ve değiştirilebilir.Görsel gösterim, floresan ile lipit transferinin gerçek zamanlı ölçümlerinin nasıl gerçekleştirildiğini açıklamak için kritik öneme sahiptir. Prosedürü gösteren aynı zamanda Maud Magdeleine olacak, laboratuvarımın mühendisi. HKM tamponu oluşturmak için bir milimoler magnezyum klorür ile desteklenmiş taze filtrelenmiş ve gazsız HEPES potasyum asetat tamponu hazırlayarak başlayın.Ardından, sadece PC'den yapılmış veya ek olarak yüzde iki azı dişi PS veya PI(4)P ile doped lipozomlar hazırlayın. Şimdi, lipid'i vakum altında kurutmak için şişeyi bir döner evaporatöre yerleştirin. Bir kuyuda, lipid sensörü NBD-C2 Lact ile iki az

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu videoda, mikroakışkan platform adı verilen, desteklenen bir lipid çift tabakasının fosfatidiletanolamin lipidine etiketlenmiş pH'a duyarlı floresan boya kullanarak, pH modülasyon testini kullanarak mikroakışkan bir modelde protein-fosfoinositid etkileşimlerini gösteriyoruz. Proteinin fosfolipide bağlanmasından sonra pH'daki modülasyonlar floresan söndürmeye neden olur.

Protein-Fosfoinositid Etkileşimlerini Tespit Etmek için Desteklenen Lipid Çift Katmanları Üzerinde pH Modülasyon Testi

Polarizasyon tabanlı Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskobu (pTIRFM) hücre zarı dinamiklerinin gerçek zamanlı algılama sağlar. Bu makalede, düzenlenmiş Ekzositoz sırasında zar yeniden çalışma için pTIRFM uygulanmasını tarif etmektedir. Teknik doğrudan veya dolaylı membran şekil değişiklikleri içeren hücre biyolojisi diğer işlemler için genellenebilir.

PTIRFM ile görüntüleme Plazma Membran deformasyonlar

Plazma zarı proteinlerinin ve lipitlerinin mekansal dağılımı ve zamansal dinamikleri biyolojide sıcak bir konudur. Burada bu sorun, kavramsal olarak tek parçacık izlemenin aynı fiziksel miktarlarını sağlayan bir uzaysal-zamansal görüntü dalgalanma analizi ile ele alınmaktadır, ancak küçük moleküler etiketler ve standart mikroskopi kurulumları kullanır.

Ticari Mikroskop Canlı Hücre Zarları Moleküler Difüzyon Kanunu Hızlı Floresans Görüntüleme Gönderen

Bir damlacık tek tabakasını düz bir monotabaka üzerine birleştirerek sıvı-akışkan arayüzünde yüzey aktif bir türün yanal difüzyonunu ölçmek için yeni bir teknik sunuyoruz.

Bir Damlacık birleştirme sonra Floresan Kurtarma Fosfolipid Monolayer İki boyutlu Difüzyon Tedbir

Fosfoinosititler nispi bolluk hızlıca, çeşitli uyarılara cevap olarak değişen lipidleri işaret ediyor. Bu makalede, ekstre etme ve Deaçillendirme ardından 3 H, miyo -inositol ile metabolik etiketlenmesi hücreleri tarafından fosfoinositidlerde bolluğunu ölçmek için bir yöntem tarif edilir. Çıkarılan glisero-inositides daha sonra yüksek performanslı sıvı kromatografisi ile ayrılmıştır ve akış sintilasyon ile nicelendirilir.

Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografi-birleştiğinde Akış Parıldama tarafından Radyoetiketleme ve Fosfoinosititler Hücresel Düzeylerinin Quantification

PI (4,5) P2 çeşitli hücresel fonksiyonlarını düzenler, ancak hücre plazma zarı kendi nano örgütü tam olarak anlaşılamamıştır. Etiketleme PI pleckstrin homoloji alanı ile kaynaşmış bir çift renkli flüoresan sonda ile (4,5) P2, biz nanometre ölçeğinde (4,5) p plazma membranında 2 dağılımını PI incelemek için yeni bir yaklaşım tarif .

Roman Floresan Probları Plazma Membran Fosfatidilinositol 4,5-bisfosfatın tek molekül Süper çözünürlüklü görüntüleme

Opsin ile sulandırılmış büyük unilameller lipozomlarda fosfolipid karıştırmayı ölçmek için floresan bazlı bir test tarif ediyoruz.

Fosfolipid Scramblase Aktivitesinin bir floresan bazlı analiz

pH'ya duyarlı bir florofor ile bir membran proteinin hücre dışı alanını Etiketleme, superecliptic pHluorin (SEP), hücre içi lokalizasyonu, sentezleme ve trafik saptanmasına olanak sağlamaktadır. Görüntüleme toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) proteinleri Eylül-etiketli periferal ER ve plazma membranı protein seviyelerinin ölçümü sağlar.

pHluorin etiketli Reseptör kullanarak Subselüler Yerelleşme ve Ticareti Monitör

Bu protokol, hücre ekzositozu ve endositoz döngüsü sırasında lipid membran trafiğini izlemek için pH'a duyarlı lipid florofor sınıfı kullanan bir floresan görüntüleme yöntemi sunar.

pH'a duyarlı Floresan Lipid Analog ND6 ile Membran Lipid Devir Hızının Ölçülmesi

Bu protokol, bireysel iyon kanallarını izlemek ve desteklenen lipit membranlarındaki aktivitelerini belirlemek için TIRF mikroskopisinin nasıl kullanılacağını açıklar, böylece yanal membran hareketi ile kanal fonksiyonu arasındaki etkileşimi tanımlar. Membranların nasıl hazırlanacağını, verilerin nasıl kaydedileceğini ve sonuçların nasıl analiz edileceğini açıklar.

Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) Mikroskobu Kullanılarak Lipid Çift Katmanlarında Yanal Mobilite ve İyon Kanalı Aktivitesinin Tek Moleküllü Görüntülenmesi

Plazma zarının lipitleri ile eksojen lipitler arasındaki değişime aracılık etmek için siklodekstrin kullanmak için bir yöntem tarif ediyoruz. Bu teknik, lipid sal benzeri ortamlarda, sal benzeri olmayan ortamlarda olduğundan farklı davranan transmembran proteinleri inceleyen deneylerle eşleştirilebilir.

Canlı Hücrelerde Lipid Değişim Testi

Öğrenin, floresan bazlı ölçümlerle fosfatidilserin ve fosfatidilinozitol 4-fosfat transferini incelemeyi. Bu yöntem, Osh6p proteininin lipit transfer kinetiğini niceliksel olarak analiz etmenizi sağlar.

Membranlar Arasında Fosfataylserine/Fosfatidiylinositol 4-Fosfat Değişiminin Floresan Bazlı Ölçümleri

Daha fazla video keşfet