Name: Kistik Fibrozis Akciğerinde Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus Biofilms Ex vivo Modelinde Antibiyotik Etkinliği Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-01-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Keşfedin, kistik fibrozis akciğerinde Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus biyofilmlerinin antibiyotik duyarlılığını ex vivo domuz akciğer modeliyle test etme yöntemini. Bu yaklaşım, klinik sonuçları daha iyi tahmin eden gerçekçi bir platform sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Örnek sonuçlar aldığımız orijinal makaleler için tüm ortak yazarlarımıza teşekkür ederiz. Çalışma, FH'a verilen bir MRC Yeni Araştırmacı Araştırma Hibesi (MR/R001898/1hibe numarası) tarafından finanse edildi; NEH ve IA'ya verilen BBSRC Midlands Bütünleştirici Biyobilimler Eğitim Ortaklığı'ndan (MIBTP) doktora öğrencileri tarafından; ve Warwick Üniversitesi Lisans Araştırma Destek Programı tarafından bir yaz tatili araştırma projesi yürütmek için FA'ya verildi. Steve Quigley, Sons (Cubbington, Warwickshire) ve John Taylor, Son (Earlsden, Coventry) akciğer temini için teşekkür ederiz. Ayrıca, Warwick Üniversitesi Yaşam Bilimleri Fakültesi'ndeki Medya Hazırlık Tesisi'nin, Cerith Harries ve Caroline Stewart'a özel teşekkür ve Warwick Antimikrobiyal Tarama Tesisi'ndeki Anita Catherwood'un yardımını da kabul etmek istiyoruz.

Bu protokol, insan tüketimi için et sağlayan ticari bir a sittoirden elde edilen domuz akciğerlerini kullanır. İngiltere mevzuatına göre, et için kesilen hayvanlardan arta kalan dokuların kullanılması etik onay gerektirmez; okuyuculara işe başlamadan önce ilgili yerel yasaları ve kurumsal yönergeleri kontrol etmelerini tavsiye ederiz.
1. Sentetik CF BalgamLı Ortamın Hazırlanması (SCFM)
<ol><li>EVPL dokusu ile kullanılmak üzere SCFM yapmak için, glikozun tariften çıkarıldığı modifikasyonu ile Palmer ve ark.24 tarafından özetlenen tarifi izleyin. NOT: Palmer ve arkadaşlarının tarifi, CF hastalarından alınan balgam örneklerinden oluşan bir seçimde bulunan ortalama konsantrasyonları temsil eden konsantrasyonlarda serbest amino asitler, takyonlar, anionlar ve laktat içerir. Benzer karbon kullanım yollarını ve P. aeruginosa PA14 tarafından çekirdek algılama sinyallerinin ifadesini, liofili hasta balgamından yapılan orta büyüme için işaret ettiği gösterilmiştir24. Tablo S1'de 1 L modifiye SCFM tarifi verilir.</li>
	<li>Hazırlık işleminden hemen sonra SCFM'yi sterilize edin ve 1 aya kadar 4 °C'de saklayın.</li>
</ol>2. Ex vivo domuz akciğer (EVPL) dokusunun diseksiyonu ve enfeksiyonu
<ol><li>Diseksiyondan önce, P. aeruginosa/S. aureus (örneğin, lysogeny broth + % 1.2 agar) için laboratuvarda standart olan agarı kullanarak enfeksiyon için gerekli bakteriyel suş / s agar plakasını hazırlayın.</li>
	<li>Enfekte olmayan kontrol dokusu parçaları da dahil olmak üzere deney için kaç porcine bronş dokusu parçası gerektiğini hesaplayın. Sonuçların tekrarlanabilirliğini doğrulamak için deneyi iki çoğaltılmış akciğerde tekrarlamak için bu sayıyı ikiyle çarpın.</li>
	<li>400 μL / doku parçası için yeterli ortam yapmak için agarose pedleri yapmak için gereken SCFM agarose (mL) hacmini belirlemek için gereken toplam doku parçası sayısını 0,5 ile çarpın ve hazırlık sırasında herhangi bir pipetleme hatasını veya buharlaşmayı hesaba katmak için yedek SCFM agar.</li>
	<li>%0,8 ağırlık/hacim agarose ile istenen toplam SCFM hacmini yapmak için gereken her 15 mL SCFM'ye 0,12 g agarose ekleyin.</li>
	<li>SCFM agarose çözeltisini agarose tamamen çözünene kadar ısıtın. Düşük güçte yerli mikrodalga fırın önerilir. Gereken süre mikrodalganın watt'ına bağlıdır. Agarose'un yaklaşık 50 °C'ye kadar soğumasını bekleyin (dokunmaya sıcak ama tutması rahat). Daha fazla soğumaya izin vermeyin.</li>
	<li>Pipet kullanarak, gerekli doku parçası başına 24 kuyulu bir plakanın bir kuyusuna 400 μL SCFM agarose ekleyin.</li>
	<li>SCFM agarose içeren 24 kuyu plakasını/plakalarını ultraviyole ışık altında 10 dakika sterilize edin.</li>
	<li>20 mL steril Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamı (DMEM) artı 50 μg/mL ampisilin ile desteklenmiş 20 mL steril Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 kullanılarak incelenen her sağlam akciğer için üç kopya yıkama hazırlayın.</li>
	<li>Parçalanan her sağlam akciğer için son yıkama olarak 40 mL SCFM'lik bir aliquot yapın. Tüm yıkamalar gece boyunca 4 °C'de saklanabilir veya hemen kullanılabilir.</li>
	<li>Kesimden sonra belirlenen kaynaktan akciğerleri mümkün olan en kısa sürede elde ederek, yerli bir soğutucuda laboratuvara taşınarak soğuk tutulmalarını sağlayın. NOT: Kesim gününe daha yakın akciğerler depodan daha az morarma gösterir, ancak kesimden itibaren 4 güne kadar soğuk depoda tutulan dokular da kullanılabilir. Soğutucunun kasabın dükkanına veya mezbahaya alınması gerektiğinden, kontaminasyon riskini ve muhafaza ihlalini azaltmak için her kullanımdan sonra yerel laboratuvar yönergelerine uyup kullanılmadığında mikrobiyoloji laboratuvarının dışında saklanmalıdır.</li>
	<li>Sterilize edilmiş bir yüzey üzerinde ve bir alevin altında çalışarak, akciğerleri otomatik kapatılmış alüminyum folyo ile kaplı temiz bir plastik doğrama tahtasına yerleştirin. Bronşiollerin bozulmadan kaldığından kontrol edin. Sitoserde veya nakliye sırasında herhangi bir hasar olmuşsa akciğerler kullanıma uygun değildir.</li>
	<li>Bir palet bıçağını bir alevin altında ısıtın ve doku yüzeyini sterilize etmek için bıçağı bronşiol çevreleyen akciğer bölgesine çok kısa bir süre dokunun.</li>
	<li>Steril monte edilmiş bir jilet kullanarak bronşiol çevreleyen yüzey dokusunu kesin. Herhangi bir hasarı önlemek için bronşiol paralel kesiler yapın.</li>
	<li>Bronşiol açığa çıktıktan sonra, bronşiolden serbest kalmak için görünür en yüksek noktadaki bronşiolden kesitsel bir kesi yapın.</li>
	<li>Steril forseps kullanarak, bronşiolün serbest ucunun hafifçe tutun ve steril monte edilmiş bir jilet kullanarak kalan istenmeyen dokuları kesin. Bronşiolden bronşiol çıkarmak için herhangi bir dallanma görünmeden önce bronşiol boyunca son bir kesi yapın.</li>
	<li>Bronşiolleri ilk DMEM/RPMI 1640 yıkamaya yerleştirin. Bronşiolleri yıkamada bırakın ve planlanan deney için yeterli doku kesiti elde etmek için gerektiği gibi aynı akciğerden ek bronşiol bölümleri toplamak için 2.11-2.14 adımlarını tekrarlayın.</li>
	<li>Aynı akciğerden ilave bronşlar bölümlerini yıkamaya yerleştirin (adım 2.16). Yıkamada en az 2 dakika bekletin.</li>
	<li>Bronşiolleri ilk DMEM/RPMI 1640 yıkamadan çıkarın ve numuneleri steril bir Petri kabına yerleştirin.</li>
	<li>Her bronşiolleri steril tokmaklar kullanarak hafifçe tutun, dokuya zarar vermediklerden emin olun. Kalan yumuşak dokuyu mümkün olduğunca çıkarın ve steril diseksiyon makası kullanarak dokuyu ~5 mm genişliğinde şeritler halinde kesin.</li>
	<li>Tüm bronşiyoler doku şeritlerini ikinci DMEM/RPMI 1640 yıkamaya yerleştirin. Yıkamada en az 2 dakika bekletin.</li>
	<li>Doku şeritlerini steril tokalar kullanarak ikinci yıkamadan çıkarın, dokuya zarar vermemeye dikkat edin. Dokuyu temiz, steril bir Petri kabına yerleştirin.</li>
	<li>Bronşiole bağlı kalan yumuşak dokuları çıkarın ve steril diseksiyon makası kullanarak şeritleri kareler halinde (~5 mm x 5 mm) kesin.</li>
	<li>Petri kabına üçüncü DMEM/RPMI 1640 yıkamayı ekleyin. Kabı döndürerek yıkamadaki doku parçalarını hafifçe karıştırın.</li>
	<li>Üçüncü yıkamayı doku parçalarını çıkarmadan Petri kabından dökün.</li>
	<li>Son SCFM yıkamasını doku içeren Petri kabına ekleyerek tüm doku parçalarının kaplanmasını sağlayın.</li>
	<li>SCFM'deki doku parçalarını UV ışığı altında 5 dakika sterilize edin.</li>
	<li>Sterilize edilmiş her bronş dokusu parçasını SCFM agarose pedleri içeren 24 kuyulu bir plakanın/plakanın ayrı kuyularına aktarmak için steril tokmaklar kullanın.</li>
	<li>Her doku parçasını istenen bakteri suşu ile enfekte etmek için, bir agar plakasında yetişen bir koloniye steril 0,5 mL insülin şırıngasına bağlı 29 G iğnenin ucuyla dokunun. Daha sonra koloniye doku parçasına dokunun, doku yüzeyini hafifçe batırın. NOT: 29 G iğne ile donatılmış bir insülin şırıngası kullanmak, parmakları hem iğne hem de akciğer dokusundan güvenli bir mesafede tutarken iğnenin doğru ve rahat bir şekilde tutulmasını sağlar. Bu adımı şırıngaya bağlı olmayan 29 G iğne kullanarak gerçekleştirmek mümkündür, ancak bu daha fazla el becerisi gerektirir ve iğne sapı yaralanması riskini arttırır. İnsülin şırınnaları kolayca mevcuttur.</li>
	<li>Enfekte olmayan kontroller için, doku parçasının her birinin yüzeyini steril 0,5 mL insülin şırıngasına bağlı 29 G'lık bir iğnenin ucuyla hafifçe batırın.</li>
	<li>Her kuyuya 500 μL SCFM eklemek için bir pipet kullanın.</li>
	<li>Ultraviyole ışık altındaki her 24 kuyu plakası için 10 dakika boyunca nefes alabilir bir sızdırmazlık zarı sterilize edin(Malzeme Masası).</li>
	<li>Kapak/ları 24 kuyu plakasından/plakalardan çıkarın ve solunabilir zarla değiştirin.</li>
	<li>Tabakları 37 °C'de, istenen kuluçka (enfeksiyon) süresi boyunca titremeden kuluçkaya yatırın. Enfekte olmayan kontrol parçalarında (kontaminasyon kontrolü) aşılanmış patojenin gözle görülür bir büyümesi olmadığından kontrol edin. NOT: İstenirse, 2.5. adımda SCFM agarose pedlerine ampisilin eklenebilir ve 2.30. Bu, P. aeruginosa veya S. aureus büyümesini etkilemeden akciğerlerdeki çoğu endojen bakterinin büyümesini baskılayacaktır, ancak ampisilin varlığı diğer antibiyotiklere yatkınlığı etkileyebileceğinden, okuyucu test etmek istedikleri suşlara ve antibiyotiklere bağlı olarak bu seçimi yapmaya bırakılır.</li>
</ol>3. Antibiyotik etkinliğinin belirlenmesi
NOT: Şekil S1'de bu tahlil adımlarını ayrıntılı olarak açıklayan bir şema verilmiştir.
<ol><li>EVPL'de oluşan biyofilmlerin antibiyotik toleransını ölçmek için, diseksiyon ve enfeksiyon sırasında en az iki bağımsız akciğerden akciğer parçaları kümelerini çoğaltmak gerekir. Negatif kontrol için bir parça seti gereklidir (antibiyotik tedavisi yoktur) ve test edilecek her antibiyotik konsantrasyonu için bir set gereklidir.</li>
	<li>48 saatlik kuluçkadan sonra, enfekte olmayan doku parçalarını görsel olarak inceleyin. Domuz akciğerine endojen bakteri büyümesi meydana gelmiş olabilir ve bu da SCFM'nin bu bölümlerin etrafındaki bulanık olmasına yol açabilir. Seçilen çalışma türlerinin tipik büyümesi gözlenirse (örneğin, P. aeruginosa'nınmavi-yeşil pigmentasyon tanısı), deneye taze akciğerlerle yeniden başlayın.</li>
	<li>Enfekte olmayan doku bölümleri bakteri üremesi göstermiyorsa veya sadece minimum bakteriyel büyüme göstermiyorsa, her biri antibiyotiksiz veya akciğer dokusu parçası başına kuyu başına ilgi çekici antibiyotik içeren bir 24 kuyu yıkama plakası ve bir 24 kuyu tedavi plakası hazırlayın.</li>
	<li>Enfekte olmuş her doku parçasını alev sterilize edilmiş tokalarla kuluçka plakasından çıkarın, biyofilmle ilişkili olmayan bakteri hücrelerini çıkarmak için yıkama plakasının taze bir kuyusunda kısa bir süre döndürün ve tedavi plakasının uygun kuyusuna aktarın.</li>
	<li>Tedavi plakalarını taze nefes alabilen membranla kapatın.</li>
	<li>Tedavi plakasını /plakasını 18-24 saat boyunca titremeden 37 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Alev sterilize edilmiş önseziler kullanarak, her akciğer parçasını 24 kuyu plakasından çıkarın ve 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ve 1 g metal boncuk(Malzeme Masası)içeren steril bir 2 mL homojenizasyon tüpüne koyun.</li>
	<li>Boncuk 4 m/s'de 40 saniye boyunca çırpın. NOT: Malzeme Tablosunda önerilen spesifik boncuklar ve homojenizatör ile boncuk dövmesi önemli bakteri lizizine neden olmaz, ancak protokolü kullanan her laboratuvar AST testlerine başlamadan önce seçtikleri boncukların ve homojenizatörün etkilerini kontrol etmelidir.</li>
	<li>Standart kaplama yöntemlerine göre bireysel işlenmemiş ve antibiyotikle tedavi edilmiş doku parçalarında koloni oluşturan birimleri (CFU) belirlemek için Lysogeny Broth (LB) agar üzerinde PBS ve plaka kullanarak akciğer homojenatını seri olarak seyreltin. NOT: İsteğe bağlı: Koloni kimliklerini onaylamak için seçici medyada yinelenen plakalar hazırlayın; örneğin, S. aureusiçin mannitol tuz agar kullanarak.</li>
</ol>

<ol><li>Elborn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis.</a> The Lancet. 388 (10059), 2519-2531 (2016).</li>
<li>Høiby, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+biofilm+infections+in+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of biofilm infections in cystic fibrosis patients.</a> APMIS. 125, 339-343 (2017).</li>
<li>Bjarnsholt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+in+the+respiratory+tract+of+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Pulmonology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa biofilms in the respiratory tract of cystic fibrosis patients.</a> Pediatric Pulmonology. 44 (6), 547-558 (2009).</li>
<li>Høiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Antimicrobial+Agents%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance of bacterial biofilms.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 35 (4), 322-332 (2010).</li>
<li>Penesyan, A., Gillings, M., Paulsen, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+discovery%3A+Combatting+bacterial+resistance+in+cells+and+in+biofilm+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Antibiotic discovery: Combatting bacterial resistance in cells and in biofilm communities.</a> Molecules. 20 (4), 5286(2015).</li>
<li>Son, M. S., Matthews, W. J., Kang, Y., Nguyen, D. T., Hoang, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+evidence+of+Pseudomonas+aeruginosa+nutrient+Acquisition+and+pathogenesis+in+the+lungs+of+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">In vivo evidence of Pseudomonas aeruginosa nutrient Acquisition and pathogenesis in the lungs of cystic fibrosis patients.</a> Infection and Immunity. 75 (11), 5313-5324 (2007).</li>
<li>Flynn, J. M., Niccum, D., Dunitz, J. M., Hunter, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+and+role+for+bacterial+mucin+degradation+in+cystic+fibrosis+airway+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Evidence and role for bacterial mucin degradation in cystic fibrosis airway disease.</a> PLoS Pathogens. 12 (8), 1005846(2016).</li>
<li>Stites, S. W., Plautz, M. W., Bailey, K., O'Brien-Ladner, A. R., Wesselius, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+concentrations+of+iron+and+isoferritins+in+the+lower+respiratory+tract+of+patients+with+stable+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Increased concentrations of iron and isoferritins in the lower respiratory tract of patients with stable cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 160 (3), 796-801 (1999).</li>
<li>Cornforth, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+transcriptome+during+human+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa transcriptome during human infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (22), 5125-5134 (2018).</li>
<li>Drevinek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+changes+linked+to+antimicrobial+resistance%2C+oxidative+stress%2C+iron+depletion+and+retained+motility+are+observed+when+Burkholderia+cenocepacia+grows+in+cystic+fibrosis+sputum%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Gene expression changes linked to antimicrobial resistance, oxidative stress, iron depletion and retained motility are observed when Burkholderia cenocepacia grows in cystic fibrosis sputum.</a> BMC Infectious Diseases. 8, 121(2008).</li>
<li>Goerke, C., Wolz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+and+genomic+plasticity+of+Staphylococcus+aureus+during+persistent+colonization+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Regulatory and genomic plasticity of Staphylococcus aureus during persistent colonization and infection.</a> International Journal of Medical Microbiology. 294 (2-3), 195-202 (2004).</li>
<li>Wolter, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcus+aureus+small-colony+variants+are+independently+associated+with+worse+lung+disease+in+children+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Staphylococcus aureus small-colony variants are independently associated with worse lung disease in children with cystic fibrosis.</a> Clin Infect Dis. 57 (3), 384-391 (2013).</li>
<li>Roberts, A. E. L., Kragh, K. N., Bjarnsholt, T., Diggle, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+limitations+of+in+vitro+experimentation+in+understanding+biofilms+and+chronic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The limitations of in vitro experimentation in understanding biofilms and chronic infection.</a> Journal of Molecular Biology. 427, 3646-3661 (2015).</li>
<li>Ceri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Calgary+biofilm+device%3A+New+technology+for+rapid+determination+of+antibiotic+susceptibilities+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The Calgary biofilm device: New technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms.</a> Journal of Clinical Microbiology. 37 (6), 1771-1776 (1999).</li>
<li>Moskowitz, S. M., Foster, J. M., Emerson, J., Burns, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinically+feasible+biofilm+susceptibility+assay+for+isolates+of+Pseudomonas+aeruginosa+from+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Clinically feasible biofilm susceptibility assay for isolates of Pseudomonas aeruginosa from patients with cystic fibrosis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 42 (5), 1915-1922 (2004).</li>
<li>Smith, S., Waters, V., Jahnke, N., Ratjen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+versus+biofilm+antimicrobial+susceptibility+testing+to+guide+antibiotic+therapy+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cochrane+Database+of+Systematic+Reviews%22%5BJournal%5D)">Standard versus biofilm antimicrobial susceptibility testing to guide antibiotic therapy in cystic fibrosis.</a> Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), (2020).</li>
<li>Trust, C. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTrust%2C+CF+%22Annual+Data+Report+2019%22">Annual Data Report 2019</a>. , (2019).</li>
<li>Angelis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+and+economic+costs+and+health-related+quality+of+life+in+non-institutionalised+patients+with+cystic+fibrosis+in+the+United+Kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Health+Services+Research%22%5BJournal%5D)">Social and economic costs and health-related quality of life in non-institutionalised patients with cystic fibrosis in the United Kingdom.</a> BMC Health Services Research. 15 (1), 428(2015).</li>
<li>Eidt-Koch, D., Wagner, T. O. F., Mittendorf, T., von der Schulenburg, J. M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outpatient+medication+costs+of+patients+with+cystic+fibrosis+in+Germany%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Health+Economics+and+Health+Policy%22%5BJournal%5D)">Outpatient medication costs of patients with cystic fibrosis in Germany.</a> Applied Health Economics and Health Policy. 8 (2), 111-118 (2010).</li>
<li>Longitude Prize. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://longitudeprize.org">http://longitudeprize.org</a> (2020).</li>
<li>Harrington, N. E., Sweeney, E., Harrison, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+better+biofilm+-+Formation+of+in+vivo-like+biofilm+structures+by+Pseudomonas+aeruginosa+in+a+porcine+model+of+cystic+fibrosis+lung+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Biofilm%22%5BJournal%5D)">Building a better biofilm - Formation of in vivo-like biofilm structures by Pseudomonas aeruginosa in a porcine model of cystic fibrosis lung infection.</a> Biofilm. 2, 100024(2020).</li>
<li>Harrison, F., Diggle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+lung+model+to+study+bronchioles+infected+with+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">An ex vivo lung model to study bronchioles infected with Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Microbiology. 162, 1755-1760 (2016).</li>
<li>Sweeney, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+cystic+fibrosis+model+recapitulates+key+clinical+aspects+of+chronic+Staphylococcus+aureus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">An ex vivo cystic fibrosis model recapitulates key clinical aspects of chronic Staphylococcus aureus infection.</a> Microbiology. , DOI: 10.1099/mic.0.000987 (2020).</li>
<li>Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+cues+control+Pseudomonas+aeruginosa+multicellular+behavior+in+cystic+fibrosis+sputum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum.</a> Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).</li>
<li>Nakagawa, S., Schielzeth, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeatability+for+Gaussian+and+non-Gaussian+data%3A+A+practical+guide+for+biologists%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Repeatability for Gaussian and non-Gaussian data: A practical guide for biologists.</a> Biological Reviews. 85 (4), 935-956 (2010).</li>
<li>Sweeney, E., Sabnis, A., Edwards, A. M., Harrison, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+host-mimicking+medium+and+biofilm+growth+on+the+ability+of+colistin+to+kill+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Effect of host-mimicking medium and biofilm growth on the ability of colistin to kill Pseudomonas aeruginosa.</a> Microbiology. 166 (12), 1171-1180 (2020).</li>
<li>Stalker, D. J., Jungbluth, G. L., Hopkins, N. K., Batts, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacokinetics+and+tolerance+of+single-+and+multiple-dose+oral+or+intravenous+linezolid%2C+an+oxazolidinone+antibiotic%2C+in+healthy+volunteers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Pharmacokinetics and tolerance of single- and multiple-dose oral or intravenous linezolid, an oxazolidinone antibiotic, in healthy volunteers.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 51 (5), 1239-1246 (2003).</li>
<li>Ager, S., Gould, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+update+on+linezolid+in+the+treatment+of+Gram-positive+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Drug+Resistance%22%5BJournal%5D)">Clinical update on linezolid in the treatment of Gram-positive bacterial infections.</a> Infection and Drug Resistance. 5, 87-102 (2012).</li>
<li>Kirchner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Artificial+Sputum+Medium+to+Test+Antibiotic+Efficacy+Against+Pseudomonas+aeruginosa+in+Conditions+More+Relevant+to+the+Cystic+Fibrosis+Lung%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (64), e3857(2012).</li>
<li>The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. EUCAST Disk Diffusion Method for Antimicrobial Susceptibility Testing - Version 8.0. , Available from: 
 <a target="_blank" href="www.eucast.org">www.eucast.org</a> (2020).</li>
<li>The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Version 10.0. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.eucast.org">http://www.eucast.org</a> (2020).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Ex vivo akciğer modeli yüksek verim ve ucuzdur ve et endüstrisinden tüketici sonrası atık kullandığı için etik kaygılar sunmaz. Kronik olarak enfekte olmuş insan CF hava yollarını şu anda mevcut olandan daha iyi taklit etmek için tasarlanmıştır, in vitro AST platformları. Burada sunulan sonuçlar, bu koşullar altında antibiyotik duyarlılığının daha doğru tahmin edilebileceğini göstermektedir.
Protokolde güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlayacak kritik adımlar şunlardır:
<ol><li>Akciğer örneklerinin kesilmesi, toplanması ve işlenmesi arasında tutarlı zaman ve depolama yöntemleri kullanın. Kesimden sonra akciğerlerin mümkün olan en kısa sürede kullanılması ve bulaşma potansiyelinin minimumda tutulması önemlidir. Deneysel kültürlerin mümkün olduğunca taze olmadıkları takdirde akciğerlerde büyüme yeteneklerinde farklılıklar gözlenmiştir.</li>
	<li>SCFM üretiminde sterilitenin korunması ve akciğer parçalarının diseksiyonu esastır. Sağlıklı akciğerler steril değildir ve bu nedenle kommensal bakterilerin varlığı kronik enfeksiyon için 'doğal' bir ortamı yansıtabilir. Bununla birlikte, daha önce de belirtildiği gibi, çok türlü popülasyonlardaki bakteriyel etkileşimler sonuçları ve antibiyotiklere duyarlılığı değiştirebilir, bu nedenle kontaminasyondan kaçınılmalı ve akciğerler kullanımdan önce sterilize edilmelidir. UV sterilizasyonunun kullanılmasını savunuyoruz, çünkü teneke doku bütünlüğünde değişikliklere ve gerekirse ek antibiyotik yıkamalarına neden olduğu görünmüyor. Bununla birlikte, antibiyotikler dikkatli kullanılmalıdır, çünkü seçici basınçlar getirerek sonuçları etkileyebilir ve test bakteri popülasyonlarında gen ekspresyonunu değiştirebilir.</li>
	<li>Sterilizasyon sırasında çıkarılmamış kirletici veya kommensal bakterilerin büyümesini vurgulamak için seçici olmayan, zengin bir ortamda yetiştirilen sahte enfekte, negatif kontrol doku örneklerini ve hücre sayısı plakalarını kullanın. Bu, bu bakterilerin AST üzerindeki herhangi bir etkisini azaltmak için gereklidir. Yinelenen plakalar koloni tanımlamasını ve hücre numaralandırmasını hızlandırdtıkça, ilgi çekici organizmaya özgü yinelenen, seçici agar, hücre sayısı plakaları üretmek de yararlıdır.</li>
	<li>Modeli ilk kullanırken ve doku bölümleri arasındaki biyofilm CFU varyasyonlarını değerlendirmek için yeni suşlar veya bakteri genotipi ile kullanırken pilot deneyler yapın, güç hesaplamaları yoluyla optimal deneysel örnek boyutlarının (örneğin, kaç kopya akciğerden elde etmek için kaç kopya doku bölümü) seçilmesine izin verin.</li>
	<li>Test standart olmayan bir inoculum kullanır, çünkü bu, 48 saatlik inkübasyondan sonra hızlı aşılamaya ve nispeten tutarlı biyofilm yüklerinin oluşumuna izin verir (özellikle P. aeruginosaiçin). Erken biyofilm büyüme aşamalarında antibakteriyel etkinliği test etmek için, ASM'de askıya alınan koloni tarafından yetiştirilen bakterilerin standartlaştırılmış bir CFU'su ile aşılamayı düşünün. Planktonik bakterilerle aşılamayı önermiyoruz: erken pilot deneyler, bunun güvenilir biyofilm oluşumuna değil akut, invaziv büyümeye yol açtığını gösterdi.</li>
</ol>Bu protokol P. aeruginosaile kullanım için sağlam bir prototip modeli üretir S. aureusile kullanım için büyük bir geliştirme potansiyeline sahip , ancak gelecekte belirli uygulamalar için ele alınması gereken bazı sınırlamalara sahiptir. Doku, klonal popülasyonların gelişmesine izin vermek için tek kolonilerden aşılandı. Sonuçlar, P. aeruginosaiçin bunun 48 saat hücre sayıları üzerinde çok az etkisi olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, S. aureus için bakteri yükünde daha fazla değişkenlik gözlenmiştir ve model içinde farklı bakterilerin farklı büyüyebileceği göz önüne alındığında, standartlaştırılmış bir başlangıç inokülüsyumu ve aynı boyut ve ağırlıktaki doku örneklerinin titiz üretimi çalışma organizmasına bağlı olabilir. Hassas diseksiyon/ enfeksiyon tekniklerindeki veya yerel domuz ırkı / landrace'deki farklılıklar nedeniyle laboratuvarlar arasında farklılıklar da olabilir. Modelin bireysel uygulamaları için bakteri popülasyonlarının tekrarlanabilirliğini değerlendirmek için, sonuçların istatistiksel analizi25'in bir parçası olarak tekrarlanabilirlik hesaplamalarının kullanılmasını ve son deneylerde kullanımları için en uygun örnek boyutunu hesaplamak için pilot deneylere dayalı tekrarlanabilirlik / güç hesaplamalarının kullanılmasını öneriyoruz.
EVPL'nin geleneksel plaka testlerine göre en önemli avantajlarından biri, planktonik olarak veya abiyotik yüzeylerde büyüyen bakterileri test etmek yerine, bakteriyel biyofilmlerin konak bir ortamda ve hücre farklılaşmasıyla mekansal olarak yapılandırılmasına izin veriyor olmasıdır. Bunun, fizyolojik ve besin gradyanlarının antimikrobiyal ajanların aktivitesi üzerindeki etkisinin yanı sıra kronik bir enfeksiyon içindeki farklı mikroçevrimlerde aktif tedavilerin verilmesi ve mevcudiyeti ve bakteriler arasındaki hücre-hücre etkileşimi üzerinde önemli etkileri vardır. Bu son nokta özellikle önemlidir, çünkü çok türlü enfeksiyonlar CF'de rutin olarak gözlenir ve astım ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı gibi diğer solunum yolu rahatsızlıklarıyla ilişkili enfeksiyonlar için giderek daha önemli hale gelmektedir. Klinik tanıda bireyselleştirilmiş hasta balgam örneklemesi için AST için bu modeli geliştirme potansiyeli vardır. Büyüme için yara taklit eden bir in vitro modeli ve kronik yaralardan kaynaklanan debrided biyofilm AST (Lubbock, Teksas'taki Güneybatı Bölgesel Yara Bakım Merkezi, Dr. R. Wolcott) kullanılarak benzer bir deneme zaten devam etmektedir.
Ayrıca, model post-mortem doku kullanır, bu nedenle konak immün yanıtın antibiyotik duyarlılığı üzerindeki etkisi sınırlıdır. Mevcut in vitro modeller de konak bağışıklık yanıtlarını hesaba katmamaktadır, bu nedenle bunu modelin AST uygulamalarında gelecekteki kullanımına bir engel olarak görmüyoruz. Ancak farmakokinetik ve farmakodinamik parametreler ve antibiyotik dozing kılavuzları belirlenirken immün yanıt dikkate alınır. Çalışmalarımız doku23 (ve S. Azimi, kişisel iletişim) içinde artık bağışıklık hücreleri ve yanıtları kanıtlamış olsa da, in vivo koşullarla daha büyük bir eşleşme isteniyorsa, bu modelin daha fazla optimizasyonu ve geliştirilmesi için birincil bir alandır.
CF için klinik olarak daha geçerli AST sağlamak, İngiltere Sağlık, Sosyal Bakım Yasası 2008'in "ihtiyatlı reçete yazma ve antimikrobiyal yönetim sağlamak için prosedürlerin uygulanmalıdır" yönündeki önemli bir tavsiyesini karşılamaya yardımcı olacaktır. EVPL'nin bu ihtiyacı karşılamaya yardımcı olmak için ideal bir aday modeli olduğuna inanıyoruz.

Kronik biyofilm enfeksiyonları, normal bağışıklık savunması tehlikeye atılan bireyleri etkiler. Risk altındaki gruplar arasında genetik durumu kistik fibrozis (CF)1olanlar bulunur. Erken bebeklik döneminde solunum yollarındaki anormal kalın, yapışkan mukusların kolonizasyonu, bronşiollerin inatçı biyofilm enfeksiyonlarına yol açar2,3. Bakterilerin geniş matris kapsüllü biyofilmler olarak büyümesi, immün sistemi baskılanmış kişilerin kronik enfeksiyonlarını sağlıklı konakçıların akut enfeksiyonlarından ayıran bir faktördür ve biyofilm durumu hem bakterileri antibiyotik maruziyetinden korur (matris yoluyla difüzyonun azalması nedeniyle) hem de antibiyotik duyarlılıklarını azaltır (örneğin, quiescence indüksiyonu veya efflux pompalarının kabarması yoluyla)4,5. Bununla birlikte, konak doku fizyolojisi ve kimyasındaki hastalığa özgü değişiklikler, bakteriyel fizyolojiyi akut enfeksiyonlarda veya standart laboratuvar büyüme koşullarında gözlenenden daha da değiştirir. CF'deki önemli örnekler arasında akciğer yüzey aktif maddelerinden salınan ve musinin mikrobiyal bozulmasıyla üretilen yağ asitleri ve amino asitler gibi olağandışı karbon kaynaklarının kullanımı, hasarlı dokulardan demir gibi mikro besinlerin salınması ve mikroaerobiyoz6,7,8 sayılabilir.
Bu nedenle, belirli bir biyofilm enfeksiyonu bağlamındaki spesifik fizikokimyasal durumlar antibiyotiklere verilen yanıtları etkileyebilir. İlk olarak, hücre dışı matrisin yapısı ve derinliği, besin maddeleri veya kesme kuvvetleri gibi yerel çevresel koşullara bağlıdır. İkincisi, çevresel ipuçları spesifik antibiyotik direnci genlerinin ekspresyonini tetikleyebilir. Örneğin, CF patojeni Pseudomonas aeruginosa, CF balgamında beta-laktamazın artan ekspresyonunun ve in vitro9'akarşı porinlerin azaltılmış ekspresyonunun arttığını gösterirken, başka bir CF patojeni, Burkholderia cenocepacia, CF balgamında yetiştirildiğinde beta-laktamları ve efflux pompalarını yükseltir. Üçüncü olarak, konak içi durumlar, in vitro'yu yeniden kapsüllemek zor olan antibiyotiklere dirençli fenotiplere fizyolojik veya genetik bir geçişe işaret edebilir. Bunlar CF patojeni Staphylococcus aureus11,12'ninküçük koloni varyantlarını içerir.
Tüm bu veriler, tanı laboratuvarları tek tek klonları patojenik biyofilmden izole ettiğinde ve standart laboratuvar ortamlarında (et suyu mikrodilüsyon, disk difüzyonu veya Etest) planktonik veya agar plakalı yetiştirilen kültürlerde AST gerçekleştirdiğinde, sonuçların genellikle hangi antibiyotiklerin gerçekten vivo olarak çalışacağını tahmin etmediğini göstermektedir. İn vitro biyofilm tahlilleri kullanılsa bile, kullanılan ortam ve bağlanma yüzeyindeki farklılıklar nedeniyle in vivo benzeri bir biyofilm fenotipi işaret etmeyebilir, bu nedenle akış hücreleri veya yüksek verimli mikro plaka platformları kullanılarak yapılan tahliller antibiyotik hassasiyetini aşırı tahmin edebilir13. Aynı sorun, akademi ve endüstride yeni antibiyofilm ajanları geliştirmek isteyen araştırmacılar için de geçerlidir: akış hücreleri, mikrotiter plakalar veya Hastalık Kontrol Merkezi biyofilm reaktörleri gibi in vitro platformları kullanarak ilaç potansiyelini test etmek biyofilm etkinlik çubuğunu çok düşük ayarlayabilir ve araştırma, geliştirme boru hattında yanlış pozitifler üretebilir.
CF'de antibiyotik tedavisinden sonra AST sonuçları ile klinik sonuç arasındaki zayıf korelasyon iyi bilinmektedir. Birçok klinisyen, bu sonuçları yorumlamak için tek tip, CF'ye özgü yönergeler olmadığı için tanı laboratuvarı AST'yi görmezden gelir ve bunun yerine reçete yazmak için duruma göre kararlar verir. Standart AST ortamı (örneğin, katyon ayarlı Muller-Hinton suyu) içeren bir mikro plakanın kuyuları içinde ayarlanan plastik mandalların yüzeyinde yetişen biyofilmleri kullanan Calgary biyofilm cihazı kullanılarak CF AST'yi iyileştirme girişimleri yapılmıştır14,15. Bu tahlil, hangi antibiyotiklerin vivo olarak çalışacağını tahmin etmede standart planktonik AST16'dandaha iyi bir şey yapmaz. CF'li hastalar üzerindeki etkisi çok keskindir. Tekrarlanan antibiyotik tedavisine rağmen (düzenli inhale antibiyotikler ve Birleşik Krallık'ta CF'li bireyler için 27 gün / yıl intravenöz antibiyotik alan bir ortanca)17, akut pulmoner alevlenmenin sık ve öngörülemeyen atakları ilerleyici akciğer hasarına ve vakaların yaklaşık% 90'ında solunum yetmezliğinden ölüme yol açar. Yakın tarihli bir analizde, bakteriyel akciğer enfeksiyonu CF'deki ilaç maliyetlerinin en güçlü tahmincisiydi ve sağlık maliyetlerini yönlendirmek için ortalama 3.6K / hasta / yıl ekledi18,19.
Aksi takdirde sağlıklı bireylerin akut enfeksiyonları için, örneğin, bakım noktası genomik tahminine dayanan hızlı AST'ye odaklanan mevcut araştırma ve politika idealdir20. Ancak kronik CF enfeksiyonları durumunda, farklı bir yaklaşıma ihtiyaç duyulduğu açıktır: in vivo ortamı ve patojen metabolik durumu daha iyi rekapitüle eden ve gerçekçi biyofilm yapısının oluşumuna izin veren konak taklit modellerinde AST'nin uygulanması.
Daha önce sentetik CF balgamında inkübe edilmiş ve P. aeruginosa veya S. aureusile enfekte domuz bronşiol bölümlerini içeren bir CF biyofilm modeli geliştirdik. Enfekte olmayan EVPL normal histopatolojiyi 7 gün boyunca korur, ancak P. aeruginosa ve S. aureus'un laboratuvar veya klinik izolatları, cf enfeksiyonunun etiyolojisini taklit ederek doku etrafında tekrar vivo benzeri agregalar oluşturur21,22,23. Bu yüksek geçerlilikli, yüksek verimli modeli CF için özel bir biyofilm AST platformu olarak kullanmak için bir protokol sunuyoruz ve modelde yetiştirildiğinde patojen biyofilmlerin klinik olarak kullanılan antibiyotiklere yüksek toleransını gösteren örnek sonuçlar sunuyoruz. Model, biyofilm oluşumunun yönetimi veya önlenmesi için araştırma, geliştirme boru hatlarına ve potansiyel olarak tanısal AST'ye kolayca dahil edilebilir. Kullanılan ekipmanların çoğu (bkz. Malzeme Tablosu) tipik bir mikrobiyoloji laboratuvarında kolayca bulunabilir, ancak bir boncuk çırpıcı gereklidir ve işbirlikçilerle yaptığımız işten uygun bir ultraviyole mikrop öldürücü kabinin de temin edilmesi gerekebileceğini bulduk. Akciğerler ticari kasaplardan veya abattoirlerden kaynaklandığından, model etik kaygılar sunmaz.

<table><tbody><tr>29G iğne takılı <td></td><td></td><td></td><td>0,5 mL insülin şırıngaları</td></tr><tr><td>24 oyuklu kültür plakaları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Yüzey sterilizasyonu ve flamin gof diseksiyon ekipmanı</td><td></td><td></td><td></td>için %70 etanol veya benzeri</tr><tr><td>P. aeruginosa/S. aureus (herhangi bir uygun ortam)</td><td></td><td></td><td></td> Agarozunun</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> çizgilerini hazırlamak için Agar plakaları<tr><td>Alüminyum folyo - otoklavlama ile önceden sterilize edilmiştir - akciğerleri inceleyeceğiniz doğrama tahtasını kaplamak için.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mL'lik tüpler almak için tasarlanmış boncuk çırpıcı</td><td>MP Biomedicals</td><td>116004500</td><td>FastPrep-24 Klasik boncuk çırpma öğütücü ve lizis sistemi</td></tr><tr><td>Çok kuyulu plakalar için Breathe-easy veya Breathe-easy-sızdırmazlık membranı</td><td>Diversified Biotech</td><td>BEM-1 veya BERM-2000</td><td></td></tr><tr><td>Bunsen brülörü&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Doğrama tahtası - alkolle kolay dekontaminasyon sağlamak için plastik bir tahta öneririz.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Akciğerleri laboratuvara</td><td></td><td></td><td></td>taşımak için coolbox</tr><tr><td>Farklı boyutlarda</td><td></td><td></td><td></td>diseksiyon makası</tr><tr><td>Dulbecco' s modifiye Eagle ortamı (DMEM)&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 2 mL takviyeli tüpler&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>15545809</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 2,38 mm metal boncuklar</td><td>Thermo Fisher</td><td>15505809</td><td></td></tr><tr><td>Antiseptik UV kabini</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnsülin şırıngaları -&nbsp; 0,5 mL, 29G iğne takılı.</td><td>VWR</td><td>BDAM324892</td><td></td></tr><tr><td>Akciğer biyofilm homojenatında</td><td></td><td></td><td></td>CFU'yu değerlendirmek için</tr><tr><td>büyük palet bıçağı</td><td></td><td></td><td></td></tr> LB agar plakaları <tr><td>Monte edilmiş tıraş bıçakları</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nalgene RapidFlow PES 75 mm x 0,1 & mikro; m x 500 ml steril filtre ünitesi</td><td>Thermo Fisher</td><td>10474415</td><td>SCFM</td></tr><tr><td>Petri kaplarını</td><td></td><td></td><td></td></tr> filtreyle sterilize etmek için <tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su steril</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ve temizlenebilir bir diseksiyon yüzeyi</td><td></td><td></td><td></td>oluşturmak için plastik doğrama tahtası ve alüminyum folyo</tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tablo S1'de listelendiği gibi SCFM bileşenleri</td> Forseps seçimi (künt uçlar önerilir) Gerekirse, akciğer biyofilm homojenatında P. aeruginosa / S. aureus CFU'yu spesifik olarak değerlendirmek için seçici agar plakaları.<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kurumunuzun sağlık ve güvenlik politikalarına göre kontamine kesici aletlerin ve domuz dokularının atılması için uygun kaplar.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kistik fibrozis akciğerinde pseudomonas aeruginosa ve staphylococcus aureus biofilms ex vivo modelinde antibiyotik etkinliği testi

Antibiotic Efficacy Testing in an Ex vivo Model of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Biofilms in the Cystic Fibrosis Lung

Kistik fibrozis (CF) olan bireylerin akciğerlerinde bulunan bakteriyel biyofilmler için etkili antibiyotik reçetesi, standart tanı yöntemleri (örneğin, et suyu mikrodilüsyonu, disk difüzyonu veya Etest) kullanılarak antibiyotik duyarlılık testi (AST) sonuçları ile antibiyotik tedavisinden sonraki klinik sonuçlar arasındaki zayıf bir korelasyon ile sınırlıdır. Hazır biyofilm büyüme platformları kullanılarak AST'yi iyileştirme girişimleri sonuçlarda çok az iyileşme göstermektedir. İn vitro biyofilm sistemlerinin CF akciğerinin fizikokimyasal ortamını taklit etme kabiliyetinin sınırlılığı ve dolayısıyla bakteriyel fizyoloji ve biyofilm mimarisi, CF enfeksiyonu için yeni tedavilerin keşfinde de bir fren görevi görür. Burada, domuz bronşiyolar doku ve sentetik CF balgamdan (ex vivo domuz akciğeri, EVPL) oluşan bir ex vivo CF akciğer modelinde olgun, in vivo benzeri biyofilmler olarak yetiştirilen CF patojenlerinin AST'lerini gerçekleştirmek için bir protokol sunuyoruz.
Mikroter plakalarda standart laboratuvar ortamı veya sentetik CF balgamının çeşitli formülasyonlarını kullanarak biyofilm duyarlılık testi için çeşitli in vitro tahliller mevcuttur. Hem büyüme ortamı hem de biyofilm substratı (polistiren plaka vs. bronş dokusu) biyofilm antibiyotik toleransı etkilemesi muhtemeldir. Ex vivo modelde klinik Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus izolatlarının toleransının artmış olduğunu gösteriyoruz; biyofilmlerin antibiyotik tedavisinin etkileri, standart mikrodilümasyon testlerinde minimum inhibitör konsantrasyon (MIC) veya disk difüzyon tahlillerinde hassas/dirençli bir sınıflandırma ile ilişkili değildir.
Ex vivo platformu, hasta örneklerinin ısmarlama biyofilm AST'si için ve farmasötik araştırma ve geliştirme sırasında potansiyel antibiyofilm ajanları için geliştirilmiş bir test platformu olarak kullanılabilir. Daha fazla in vivo benzeri test platformları kullanılarak antibiyofilm ilaç keşfinin reçetesini veya ivmesini iyileştirmek, CF'li bireyler için sağlık sonuçlarını büyük ölçüde iyileştirebilir ve klinik tedavi ve keşif araştırmalarının maliyetlerini azaltabilir.

EVPL modeli, bir kerede antibiyotik duyarlılığı için çok sayıda bakteriyel izolatın taranmasını mümkün karak(Şekil 1 ve 2)veya bir deneyde bir dizi antibiyotik konsantrasyonuna karşı suşların taranmasını mümkün karakarak yüksek verimli bir test platformu sağlar (Şekil 3). Uygulama ile akciğerlerden 2 saatte yaklaşık 200 bronşiyoler doku bölümünün hazırlanabileceğini tespit ettik. AST için tüm deneme normal çalışma saatleri içinde tamamlanabilir. Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus'un büyümesi izole eder ve modelde 48 h biyofilm kurulması güvenilirdir ve uygulanabilir hücre sayısı ile izlendiğinde tutarlı bakteri yükleri üretir (Şekil 1 ve 2). EVPL'de yetişen Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus'un doku ile ilişkili biyofilmlerinin görüntüleri, ışık mikroskopisi ve histolojik lekelemeye hazırlık protokolleri ile birlikte yayınlarımızdabulunabilir 21,23. Bununla birlikte, CFU sayılarının tekrarlanabilirliği farklı bakteri türleri için farklılık gösterir. Bu, ANOVA25'densonra standart tekrarlanabilirlik hesaplamaları kullanılarak ölçülebilir; S. aureus için çoğaltılmış akciğer örneklerinde CFU arasında tipik olarak P. aeruginosa'dandaha fazla varyasyon olduğunu bulduk. Modelin bir laboratuvar tarafından benimsenmesi üzerine, deneysel teknikleri optimize etmek ve son deneylerde kullanılacak numune boyutlarını belirlemek için pilot deneyler üzerinde tekrar hesaplamalar yapılmasını öneririz (bunun bir örneği Sweeney veark. 26için veri ekinde bulunabilir).
EVPL'de yetiştirildiğinde, P. aeruginosa ve S. aureus'un biyofilmleri, standart, endüstri onaylı et suyu MIC(Şekil 1)ve standart ortam kullanan disk testlerine kıyasla antibiyotiklere karşı toleransın arttığını göstermektedir (Şekil 2). Farklı antibiyotiklerin EVPL yerleşik biyofilm üzerindeki çeşitli etkileri ayırt edilebilir, örneğin P. aeruginosa öldürme EVPL'de 4-16X MIC siprofloksasin ile elde edilir, ancak 4-8X MIC kloramfenikol ile elde edilemez (Şekil 1). Günde iki kez 600 mg linezolid dozu, duyarlı patojenler(4 μg / mL)27 için MIC 90'ın üzerinde bir serum konsantrasyonu elde eder ve olumsuz yan etkileri olmadan yeterli maruziyet olarak kabul edilir28. Şekil 2'de sunulan veriler, disk testinde linezolid'e duyarlı olan S. aureus popülasyonlarının EVPL'de hedef serum konsantrasyonlarında ve daha yüksek (12 μg/mL) hayatta kalabildiğini göstermektedir. P. aeruginosa için EVPL tarafından yetiştirilen biyofilmler üzerinde MIC ve antibiyotik etkileri arasında net bir korelasyon yoktur (Şekil 1). In vivo antibiyotik toleransının daha doğru bir ölçüsünün kazanı önemli çünkü antibiyotiklerin optimalin altında dolsun, kronik enfeksiyonda direnç için seçim riskini artırabilir.
Biyofilm büyüme modunun antibiyotiklere karşı bakteriyel duyarlılığı önemli ölçüde azaltabileceği iyi bilinmektedir. Bu, birçok in vitro biyofilm testinin gelişmesine ve kronik enfeksiyonda duyarlılığın daha doğru bir tahmincisi olarakMICyerine minimum biyofilm eradikasyon konsantrasyonu (MBEC) 14,15 kullanılmasına yol açmıştır. SCFM'nin (değişen formülasyonlarda) kullanımı, MIC veya MBEC29testinde de kullanılması önerilir. Burada, optimize edilmiş bir in vitro testinin bile P. aeruginosa'nın EVPL'deki colistin duyarlılığını doğru bir şekilde tahmin edemediğini gösteriyoruz. EVPL tarafından yetiştirilen bakterilerin 3 kütük10 öldürmesini elde etmek için gereken antibiyotik miktarı, scfm bu tahliller için kullanıldığında bile, genellikle standart in vitro testlerden hesaplanan MIC veya MBEC'den önemli ölçüde daha yüksektir (Şekil 3). Bu, in vitro biyofilm duyarlılık testinin mevcut uygulamalarının STANDART duyarlılık testine kıyasla CF'de antibiyotik reçeteleme için artan tahmin gücü sağlamadığını bildiren bir Cochrane incelemesi ile tutarlıdır16.
Yıkıcı örneklemeye izin vermek için yeterli akciğer replika parçaları aşılanabildiğinden, antibiyotiklerin zaman içinde biyofilm bakterileri üzerindeki etkisini değerlendirmek için modeli kullanmak da kolaydır. Antimikrobiyal ajanlar arasındaki farklılıkları ayırt etmenin yanı sıra, model farklı bakteri üreme aşamalarında veya biyofilm çağında ve farklı antibiyotik dosing aralıklarında duyarlılıktaki değişiklikleri vurgulayabilir. Şekil 4, P. aeruginosa biyofilmlerinin olgunlaştıkça meropenem'e artan toleransını göstermektedir. Bu, örneğin hızlı hücre bölünmesi sırasında daha etkili olup olmadıklarını, yeni ajanların etkinliğini belirlemek için yararlı olabilir. Bir deneyin kısıtlamalarını belirlerken de önemli bir husus olabilir, çünkü yaşın sonuçlar üzerinde bir etkisi olmasını önlemek için biyofilm yaşını standartlaştırmak ve doğrulamak gerekebilir.
Şekil 5'te S. aureus sağkalımı flukoksiakillin'e maruz kalma sonrası 4 saat ve 24 saat olarak ölçüldü ve bakteri hücre sayılarının zaman içinde ve izolatlar arasında azalmasında farklılıklar gözlemlemek mümkündü. Bu, örneğin farmakokinetik ve farmakodinamik parametreleri tanımlarken veya yeni bir ajanın eylem şeklini aydınlatırken ilaç gelişimi için yararlı olabilir.
Bakteriyel yükteki değişimler genellikle uzun kültür süreleri ile artar. Bu, 48 h biyofilm gelişimini takiben Şekil 5'teki tedavi edilmemiş kontrolde ve antibiyotik dosing aralığını hesaba katmak için 24 saat daha maruz kalmada görülebilir. Varyasyon modelin özündedir; her akciğer örneği diğerlerinden bağımsızdır ve akciğerlerin doğal varyasyonlarını yansıtır. Bu nedenle, doğrulama ve sonuçların doğru yorumlanmasına izin vermek için yeterli sayıda çoğaltmanın dahil olduğundan emin olmak önemlidir. Okuyucuyu, sağlam örnek boyutların seçimini sağlamak için veriler üzerinde tekrarlanan hesaplamalar yapmak için önerimize geri yönlendiriyoruz.
Basitlik için, her deneyde tek bir çift akciğerden elde edilen doku bölümlerinin çoğaltılmasından alınan temsili verileri sunduk, ancak pratikte çoğaltılmış hayvanlardan alınan doku bölümleri üzerinde tekrar deneyler yapmak gerekir. Bu, bireysel domuzlar arasındaki herhangi bir biyolojik varyasyonu hesaba katmak için yapılmalıdır ve okuyucuyu, sonuçların çoğaltma domuzlarından alınan dokular arasında ne kadar tutarlı olabileceği ve bu varyasyonun varyans analizi (ANOVA)/genel doğrusal modeller (GLM)21,26kullanılarak verilerin istatistiksel analizinde nasıl hesaba katıldığına dair örnekler için yayınlanan çalışmamıza yönlendiriyoruz.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62187/62187fig01.jpg"> Şekil 1. Antibiyotiklerle tedavi edildikten sonra EVPL modelinden kurtarılan 11 CF Pseudomonas aeruginosa klinik izolatlarının toplam CFU'su. EVPL modelinde P. aeruginosa antibiyotik tedavisinin temsili sonuçları. Her suş EVPL dokusunda 48 saat boyunca yetiştirildi, daha sonra 18 saat boyunca kontrol (daire) olarak antibiyotik (üçgenler) veya PBS'ye aktarıldı ve CFU / akciğer belirlendi. Standart katyon ayarlı MHB'de belirlenen uygun antibiyotik için MIC, her bir suşun (x ekseni) yanındaki braketlerde gösterilir. Suşlar, MIC değerlerini artırarak sıralanır. Veriler uygun olduğunda t-testleri ve parametrik olmayan veri kümeleri için Mann-Whitney U testleri kullanılarak analiz edildi. Tedavi edilen antibiyotik ve tedavi edilmeyen dokular arasındaki önemli farklar yıldızlarla gösterilir(P &lt; 0.05). A. EVPL modelinde yetişen ve 64 μg/mL kloramfenikol (kaydedilen en yüksek MIC değeri) ile tedavi edilen P. aeruginosa biyofilmlerinden elde edilebilir sayımlar kurtarıldı. Her izole için, kloramfenikol ile tedavi edilmemiş doku bölümleri arasındaki CFU'daki standart ortalama fark Cohen'in d'leri kullanılarak hesaplandı. Standart testte MIC değeri ile Cohen'in d (Spearman'ın rütbe korelasyonu, rs = 0.45, p = 0.16) B ile ölçülen EVPL modelinde uygulanabilir hücre sayılarındaki azalma arasında bir korelasyon yoktu. EVPL modelinde yetişen ve 64 μg/mL ciprofloksasin (kaydedilen en yüksek MIC değeri) ile tedavi edilen P. aeruginosa biyofilmlerinin sonuçları. Kesik çizginin altındaki değerler algılama sınırının altındaydı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62187/62187fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62187/62187fig02.jpg"> Şekil 2. Linezolid ile tedavi edildiktan sonra EVPL modelinden kurtarılan 8 Staphylococcus aureus CF klinik izolatının toplam CFU'u. Her suş EVPL dokusunda 48 saat boyunca yetiştirildi, daha sonra 24 saat boyunca linezolid'e (üçgenlere) aktarıldı veya kontrol (daireler) olarak tedavi edildi. Eucast yönergeleri30 (inhibisyon bölgesi &gt; 21 mm) aşağıdaki standart disk difüzyon tahlilini kullanarak tüm suşların linezolid'e duyarlı olduğu bulunmuştur. Veriler uygun olduğunda t-testleri ve parametrik olmayan veri kümeleri için Mann-Whitney U testleri kullanılarak analiz edildi(P &lt; 0.05). Suşların herhangi biri için tedavi edilen antibiyotik ile tedavi edilmeyen arasında anlamlı bir fark bulunmadı. Kesik çizginin altındaki değerler algılama sınırının altındaydı. A. 4 μg/mL linezolid ile tedavi edilen EVPL modelinde S. aureus biyofilmlerinin sonuçları (EUCAST sınıflandırmasına göre hassas/dirençli klinik kırılma noktası31). B. 12 μg/mL linezolid ile tedavi edilen EVPL modelinde S. aureus biyofilmlerinin sonuçları (Sweeney veark. 23'tençoğaltılan veriler). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62187/62187fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62187/62187fig03.jpg"> Şekil 3. Laboratuvar suşu PA14'ün uygulanabilir Pseudomonas aeruginosa hücre sayıları ve artan kolistin konsantrasyonları ile tedaviden sonra EVPL modelinden kurtarılan 4 CF klinik izolat. Her suş EVPL dokusunda 48 saat yetiştirildi ve 18 saat boyunca colistin'e maruz kaldı. Standart katyon ayarlı MHB ortamında belirlenen MIC, her gerinim adının yanındaki braketlerde gösterilir. Dikey çizgiler, değerin her iki ortamda da aynı olduğu SED6 dışında, MHB (katı) ve SCFM'de (kesikli) belirlenen MBEC değerini gösterir. Doldurulmamış veri noktaları, tedavi edilmemiş örneklerle (0 μg/mL colistin) (Sweeney ve ark.26'dançoğaltılan veriler) karşılanan CFU/akciğerde 3-log10'≥ azalma ile sonuçlanan test edilen en düşük kolistin konsantrasyonunu temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62187/62187fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62187/62187fig04.jpg"> Şekil 4. Temsili uygulanabilir Pseudomonas aeruginosa hücresi, EVPL modelinde 24 saatin üzerinde bir büyüme süresinden ve daha sonra 64 μg / mL meropenem ile tedaviden sayılır. Laboratuvar suşu P. aeruginosa PA14 ve 3 CF klinik izolatları, x ekseninde gösterilen süre boyunca EVPL dokusunda yetiştirildi, daha sonra 24 saat boyunca meropenem'e (üçgenlere) aktarıldı veya kontrol olarak tedavi edilmeden bırakıldı (daireler). Daha sonra CFU/akciğer belirlendi. Katyon ayarlı MHB ortamında belirlenen MIC, her gerinim adının yanındaki braketlerde gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62187/62187fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62187/62187fig05.jpg"> Şekil 5. EVPL modelinde büyümeden sonra temsili uygulanabilir Staphylococcus aureus hücre sayısı daha sonra 24 saat boyunca 5 μg / mL fluklikoksisilin ile tedavi edilir. Kontrol suşu ATCC29213 ve iki CF klinik izolat, EVPL dokusunda 48 saat boyunca yetiştirildi, daha sonra fluklaoksasiline (üçgenlere) aktarıldı veya CFU / akciğer belirlenmeden önce 4 saat ve 24 saat boyunca kontrol (daireler) olarak tedavi edilmeden bırakıldı (veriler Sweeney veark. 23).). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62187/62187fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Şekil S1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62187/FigureS1_updated.pdf" target="_blank">Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>  
Tablo S1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62187/TABLE%20S1.docx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Bu iş akışı, kistik fibrozisli bireylerin akciğerlerinde bakteriyel biyofilm için yerleşik bir ex vivo modeli kullanılarak antibiyotik duyarlılık testi yapmak için kullanılabilir. Bu modelin kullanımı MBEC (minimal biyofilm eradikasyon konsantrasyonu) testlerinin klinik geçerliliğini artırabilir.

Kistik Fibrozis Akciğerinde Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus Biofilms Ex vivo Modelinde Antibiyotik Etkinliği Testi

The effective prescription of antibiotics for the bacterial biofilms present within the lungs of individuals with cystic fibrosis (CF) is limited by a ...

Bu yöntem, kistik fibrozis akciğer enfeksiyonlarında gördüğünüze benzer hücre fizyolojisini ve biyofilm morfolojisini tetikleyen bir ortamda bakteri yetiştirmenizi sağlar. Akciğerler et endüstrisinde atık bir ürün olduğu için etik kaygılar yok. Model, canlı bir hayvan modeline ihtiyaç duymadan insan enfeksiyonunu taklit etmek için bir platform sunar.Bu teknik, araştırmacılara kistik fibrozis akciğerlerinde oluşan biyofilmlere girme ve yok etme potansiyeli için aday ilaçları taramanın yeni bir yolunu sunar. Daha fazla geliştirme ve doğrulama ile, EVPR modelinin özel ve bireyselleştirilmiş antibiyotik duyarlılık testi için potansiyel kullanıma sahip olabileceğine inanıyoruz. Kesimden hemen sonra akciğerleri elde edin ve evsel bir serin kutuda laboratuvara taşıyın.Sterilize edilmiş bir yüzeyde ve bir alevin altında çalışın. Akciğerleri otoklavlı alüminyum folyo ile kaplı temiz bir plastik doğrama tahtasına yerleştirin ve bronşiollerin bozulmadan kaldığını kontrol edin. A sitoirde veya taşıma sırasında herhangi bir hasar meydana geldiyse akciğerler kullanıma uygun değildir.Bir palet bıçağını bir alevin altında ısıtın ve doku yüzeyini sterilize etmek için bıçağı bronşiol çevreleyen akciğer bölgesine çok kısa bir süre dokunun. Steril monte edilmiş bir jilet kullanarak bronşiol çevreleyen yüzey dokusunu kesin, herhangi bir hasarı önlemek için bronşiol paralel kesileri olun. Bronşiol açığa çıktıktan sonra, görünür en yüksek noktadaki bronşiolden kesitsel bir kesi yapın.Steril forseps kullanarak, bronşiolün serbest ucunun hafifçe tutun ve steril monte edilmiş bir jilet kullanarak kalan istenmeyen dokuları kesin. Bronşiolden bronşiol çıkarmak için herhangi bir dallanma görünmeden önce bronşiol boyunca son bir kesi yapın. Bronşiolleri ilk DMEM RPMI 1640 yıkamaya yerleştirin.Yıkamada bırakın ve planlanan deney için yeterli doku bölümleri elde etmek için aynı akciğerden ek bronşiol bölümleri hasat edin. Aynı akciğerden ilave bronş bölümlerini yıkamaya yerleştirin ve en az iki dakika yıkamada bırakın. Bronşiolleri ilk yıkamadan çıkarın ve numuneleri steril bir Petri kabına yerleştirin.Her bronşiolleri steril kümeslerle hafifçe tutun, dokuya zarar vermemeye dikkat edin. Kalan yumuşak dokuyu mümkün olduğunca çıkarın ve steril diseksiyon makası kullanarak dokuyu beş milimetre genişliğinde şeritler halinde kesin. Tüm bronşiyoler doku şeritlerini ikinci DMEM RPMI 1640 yıkamaya yerleştirin.Onları en az iki dakika yıkamada bırakın, ardından steril forseps kullanarak doku şeritlerini ikinci yıkamadan çıkarın ve temiz, steril bir Petri kabına yerleştirin. Bronşiol bağlı kalan yumuşak dokuları çıkarın ve steril diseksiyon makası kullanarak şeritleri kareler halinde kesin. Petri kabına üçüncü DMEM RPMI 1640 yıkamayı ekleyin ve kabı döndürerek yıkamadaki doku parçalarını hafifçe karıştırın.Üçüncü yıkamayı doku parçalarını çıkarmadan Petri kabından dökün. Ardından, tüm doku parçalarının kaplanmasını sağlayarak son SCFM yıkamasını ekleyin. SCFM'deki dokuyu UV ışığı altında beş dakika sterilize edin.Sterilize edilmiş her bronş dokusu parçasını SCFM agarose pedleri içeren 24 kuyulu bir plakanın ayrı kuyularına aktarmak için steril tokmaklar kullanın. Her doku parçasını istenen bakteri suşu ile enfekte etmek için, bir agar plakasında yetişen bir koloniye steril 0,5 mililitre insülin şırıngasına bağlı 29 kalibrelik bir iğnenin ucuyla dokunun, ardından koloniye doku parçasına dokunun, yüzeyi hafifçe batırın. Enfekte olmayan kontroller için, doku parçasının yüzeyini iğnenin ucuyla hafifçe batırın, ardından her kuyuya 500 mikrolitre SCFM eklemek için bir pipet kullanın.Ultraviyole ışık altındaki her 24 kuyu plakası için 10 dakika boyunca nefes alabilir bir sızdırmazlık zarı sterilize edin. Kapağı 24 kuyu plakasından çıkarın ve solunabilir zarla değiştirin, ardından plakaları titremeden 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Negatif kontrol için bir set ve test edilecek her antibiyotik konsantrasyonu için bir set kullanarak en az iki bağımsız akciğerden akciğer parçaları kümelerini ayarlayın.48 saatlik inkübasyondan sonra, enfekte olmayan doku parçalarını endojen bakterilerin büyümesi için görsel olarak inceleyin, bu da bu bölümlerin etrafındaki ortamın bulanık olmasına neden olur. Seçilen çalışma türlerinin tipik büyümesi gözlenirse, taze akciğerlerle deneyi yeniden başlatın. Enfekte olmayan doku bölümleri hiç veya minimum bakteri üreme göstermiyorsa, bir adet 24 kuyu yıkama plakası ve bir adet 24 kuyulu tedavi plakası hazırlayın.Tedavi plakasının her kuyusu, antibiyotiksiz veya ilgi çekici antibiyotik ile 500 mikrolitre taze SCFM içermelidir. Enfekte olmuş her doku parçasını alev sterilize edilmiş asalarla kuluçka plakasından çıkarın. Biyofilmle ilişkili olmayan bakteri hücrelerini çıkarmak ve tedavi plakasının uygun kuyusuna aktarmak için yıkama plakasının taze bir kuyusunda kısa bir süre döndürün.Tedavi plakasını taze nefes alabilir bir zarla kapatın, ardından 18 ila 24 saat boyunca titremeden 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Her akciğer parçasını 24 kuyu plakasından çıkarmak için alev sterilize edilmiş önseziler kullanın ve bir mililitre PBS ve bir gram metal boncuk içeren steril iki mililitrelik homojenizasyon tüpüne koyun. Boncuk saniyede dört metrede 40 saniye boyunca yendi.PBS kullanarak akciğer homojenazatını seri olarak seyreltin ve bireysel, tedavi edilmemiş ve antibiyotikle tedavi edilmiş doku parçalarında koloni oluşturan birimleri belirlemek için LB agar üzerine plakalayın. Ex-vivo domuz akciğerinde veya EVPL'de yetiştirildiğinde, P.aeruginosa ve S.aureus'un biyofilmleri, standart ortam kullanarak standart, endüstri onaylı et suyu MIC ve disk testlerindeki duyarlılığa kıyasla antibiyotiklere karşı toleransın arttığını göstermektedir. Farklı antibiyotiklerin EVPL tarafından kurulan bir biyofilm üzerindeki çeşitli etkileri ayırt edilebilir.Örneğin, P.aeruginosa öldürme EVPL'de 4 ila 16X MIC siprofloksasin ile elde edilir, ancak 4 ila 8X MIC kloramfenikol ile elde edilemez. Disk testinde linezolid'e duyarlı olan S.aureus popülasyonları, evpl'de hedef serum konsantrasyonlarında ve daha yükseklerde hayatta kalabilir. Optimize edilmiş bir in-vitro test bile P.aeruginosa'nın EVPL'deki colistin duyarlılığını doğru bir şekilde tahmin edemez.EVPL tarafından yetiştirilen bakterilerin üç kütük 10 öldürmesini elde etmek için gereken antibiyotik miktarı genellikle standart in-vitro testlerden hesaplanan MIC veya MBEC'den önemli ölçüde daha yüksektir. Anti-mikrobiyal ajanlar arasındaki farklılıkları ayırt etmenin yanı sıra, bu model farklı bakteri üreme aşamalarında ve farklı antibiyotik dosing aralıklarında duyarlılıktaki değişiklikleri vurgulayabilir. P.aeruginosa biyofilmlerinin olgunlaştıkça meropenem'e artan toleransı burada gösterilmiştir.S.aureus sağkalımı fluklaksiline maruz kaldıktan sonra 4 ve 24 saat olarak ölçüldü, bu da bakteri hücre sayılarının zaman içinde ve izolatlar arasında azaltılmasındaki farklılıkları gözlemlemeyi mümkün kıldığını belirtti. Bakteriyel yükteki değişimler genellikle uzun kültür süreleri ile artar. Bu, 48 saatlik biyofilm gelişimini ve antibiyotik dosing aralığını hesaba katmak için 24 saat daha maruz kaldıktan sonra tedavi edilmeyen kontrolde görülebilir.Diseksiyon boyunca mükemmel steril tekniği korumak çok önemlidir, bu nedenle diseksiyonu bir laboratuvarda veya laboratuvarınızın mikrobiyoloji çalışmaları için hiç kullanmadığınız bir alanında yapmanızı öneririz. Son zamanlarda colistin'in biyofilme girişini araştırmak için modeli kullandık ve model biyofilmlere ilaç teslimatını iyileştirmek için araştırmalarda iyi bir kullanım potansiyeline sahip.

antibiotic-efficacy-testing-an-ex-vivo-model-pseudomonas-aeruginosa

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Güncel tanısal antimikrobiyal duyarlılık testi besin açısından zengin, aerobik koşullarda izolatların planktonik büyüme dayanır. Burada, kistik fibrozis akciğer daha fazla temsilcisi hem aerobik hem de mikroaerofilik şartlarda Pseudomonas aeruginosa biyofilmlerin antimikrobiyal duyarlılık incelemek için alternatif yapay balgam orta istihdam.

Karşı Antibiyotik Etkinlik Test Yapay Balgam Orta Kullanımı<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Kistik Fibrozis Akciğer Daha İlgili Koşullar

Biz cfbe41o kullanarak enfekte hava yollarının üç boyutlu ortak kültür modeli için bir protokol tarif- hücreler, THP-1 makrofajlar, ve Pseudomonas aeruginosa, hava-sıvı arayüzü nde kurulan. Bu model aynı anda antibiyotik etkinliğini test etmek için yeni bir platform sağlar, epitel bariyer fonksiyonu, ve inflamatuar belirteçleri.

P. aeruginosa Anti-Enfektiflerin Klinik Öncesi Değerlendirilmesi Için Hava-Sıvı Arabiriminde Bronşiyal Epitel Hücrelerin in enfekte 3D Eş Kültür

Pseudomonas aeruginosa biyofilm mimarisinde antimikrobiyal kaynaklı değişiklikler, kistik fibroz ve kronik akciğer enfeksiyonu olan hastalardan kültürlenen klinik izolatlar arasında farklılık gösterir. Konfokal mikroskobu takiben, anti-enfektif ajanların etkinliğini değerlendirmek için bireysel izolatlar için biyofilm mimarisindeki (örneğin, yüzey alanı, kalınlık, biyokütle) varyasyonları ölçmek için COMSTAT yazılımı kullanılabilir.

Antimikrobiyallerin İn vitro Biyofilm Mimarisi Üzerindeki Etkilerinin COMSTAT Yazılımı Kullanılarak Ölçülmesi

Bu protokol, bakteri türleri arası etkileşimlerin etkisini araştırmak için kullanılabilecek kistik fibroz (KF) akciğerle ilgili dört tür polimikrobiyal biyofilm modelini tanımlar.

Topluluk fenotiplerini araştırmak için kistik fibrozla ilgili bir polimikrobiyal biyofilm yetiştirmek

Bu metodoloji, araştırma ve klinik laboratuvarlarda antimikrobiyal duyarlılık testi için kistik fibrozda bir polimikrobiyal biyofilm modelinin oluşturulmasına izin verir. Bu model, bir dizi çıktıda doğru ve güvenilir sonuçlar sağlar.

Kistik Fibrozisde Antimikrobiyalleri Test Etmek İçin Polimikrobiyal Koloni Biyofilm Modelinin Geliştirilmesi

Bu çalışma, kistik fibroz akciğer ortamını yansıtan Pseudomonas aeruginosa gen ekspresyonunu değerlendirmek için bir agrega polimikrobiyal biyofilm modeli geliştirmek ve bir RNA ekstraksiyon protokolünü optimize etmek için bir çerçeveyi özetlemektedir. Uygulamalar, antimikrobiyal etkilerin değerlendirilmesini ve kistik fibroz ile ilgili koşullar altında antibiyotik alternatiflerinin çalışılmasını içerir.

Enfeksiyonla İlgili Gen Ekspresyonunu İncelemek için Kistik Fibroz Agregat Biyofilm Modeli

Bu kağıt büyüyen farklı yöntemleri açıklar.

Co-kültür Modelleri Pseudomonas aeruginosa</emCanlı İnsan Havayolu Hücreler Yetiştirilen> Biyofilmler

Metisiline dirençli nedeniyle deneysel rat endokardit...

Metisiline Dirençli Deneysel Endokardit Modeli<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; (MRSA) Sıçan

Bu fare modelinde kalıcı, uzun vadeli kronik Pseudomonas aeruginosa enfeksiyonu kurmak için agar-boncuklar bir yöntem tarif eder.

Uzun Vadeli Kronik<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</emFarelerde&gt; Havayolu Enfeksiyon

Pseudomonas aeruginosa bakterisinin intratrakeal enjeksiyonu ile bir fare akciğer hasarı modeli geliştirdik. Bu model pnömoni sırasında akciğer hasarını taklit eder ve klinik olarak önemlidir.

Pseudomonas aeruginosa Kaynaklı Akciğer Hasarı Modeli

Keşfedin, kistik fibrozis akciğerinde Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus biyofilmlerinin antibiyotik duyarlılığını ex vivo domuz akciğer modeliyle test etme yöntemini. Bu yaklaşım, klinik sonuçları daha iyi tahmin eden gerçekçi bir platform sunar.

Kistik Fibrozis Akciğerinde Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus Biofilms Ex vivo Modelinde Antibiyotik Etkinliği Testi (Video) | JoVE Journal

Kistik Fibrozis Akciğerinde Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus Biofilms Ex vivo Modelinde Antibiyotik Etkinliği Testi

Daha fazla video keşfet