Name: Cryo Soft X-ray Tomografisi ile Hücrenin 3D Kartografik Açıklaması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Öğrenin, cryo soft X-ray tomografi ile dondurulmuş hücrelerin boyanmadan ve kesilmeden üç boyutlu görüntülenmesini. Bu yöntem, organelleri ayırt ederek biyomedikal araştırmalarda yüksek çözünürlüklü veri sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu proje, Marie Skłodowska-Curie hibe anlaşması No 75439 kapsamında Avrupa Komisyonu Horizon 2020 iNEXT-Discovery projesinden ve Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programından finansman almıştır.

<ol><li>Carrascosa, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo+X-ray+tomography+of+vaccinia+virus+membranes+and+inner+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryo X-ray tomography of vaccinia virus membranes and inner compartments.</a> Journal of Structural Biology. 168, 234-239 (2009).</li>
<li>Uchida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+X-ray+tomography+of+phenotypic+switching+and+the+cellular+response+to+antifungal+peptoids+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Soft X-ray tomography of phenotypic switching and the cellular response to antifungal peptoids in Candida albicans.</a> PNAS. 106, 19375-19380 (2009).</li>
<li>Schneider, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cellular+ultrastructure+resolved+by+X-ray+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cellular ultrastructure resolved by X-ray microscopy.</a> Nature Methods. 10, 1-3 (2010).</li>
<li>Chichón, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo+nano-tomography+of+vaccinia+virus+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryo nano-tomography of vaccinia virus infected cells.</a> Journal of Structural Biology. 177, 202-211 (2012).</li>
<li>Groen, J., Conesa, J. J., Valcárcel, R., Pereiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+landscape+by+soft+X-ray+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Reviews%22%5BJournal%5D)">The cellular landscape by soft X-ray tomography.</a> Biophysical Reviews. 11, 611-619 (2019).</li>
<li>Kepsutlu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+undergo+major+changes+in+the+quantity+of+cytoplasmic+organelles+after+uptake+of+gold+nanoparticles+with+biologically+relevant+surface+coatings%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Cells undergo major changes in the quantity of cytoplasmic organelles after uptake of gold nanoparticles with biologically relevant surface coatings.</a> ACS Nano. 14, 2248-2264 (2020).</li>
<li>Natterer, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNatterer%2C+F+%22The+mathematics+of+computerized+tomography%22">The mathematics of computerized tomography</a>. , Wiley. New York. (1986).</li>
<li>Weiss, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computed+tomography+of+cryogenic+biological+specimens+based+on+X-ray+microscopic+images%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Computed tomography of cryogenic biological specimens based on X-ray microscopic images.</a> Ultramicroscopy. 84, 185-197 (2000).</li>
<li>Clowney, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+aggregation+of+olfactory+receptor+genes+governs+their+monogenic+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nuclear aggregation of olfactory receptor genes governs their monogenic expression.</a> Cell. 151, 724-737 (2012).</li>
<li>Duke, E. M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+endosomes+and+autophagosomes+in+whole+mammalian+cells+using+correlative+cryo-fluorescence+and+cryo-soft+X-ray+microscopy+%28cryo-CLXM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Imaging endosomes and autophagosomes in whole mammalian cells using correlative cryo-fluorescence and cryo-soft X-ray microscopy (cryo-CLXM).</a> Ultramicroscopy. 143, 77-87 (2014).</li>
<li>Cinquin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putting+molecules+in+their+place%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Putting molecules in their place.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 115, 209-216 (2014).</li>
<li>Hagen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+nanoparticles+as+alignment+and+correlation+markers+in+fluorescence%2Fsoft+X-ray+cryo-microscopy%2Ftomography+of+nucleoplasmic+reticulum+and+apoptosis+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Multimodal nanoparticles as alignment and correlation markers in fluorescence/soft X-ray cryo-microscopy/tomography of nucleoplasmic reticulum and apoptosis in mammalian cells.</a> Ultramicroscopy. 146, 46-54 (2014).</li>
<li>Pérez-Berná, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+changes+in+cells+images+by+soft+X-ray+cryo-tomography+during+Hepatitis+C+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Structural changes in cells images by soft X-ray cryo-tomography during Hepatitis C virus infection.</a> ACS Nano. 10, 6597-6611 (2016).</li>
<li>Chiappi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-soft+X-ray+tomography+as+a+quantitative+three-dimensional+tool+to+model+nanoparticle%3Acell+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Cryo-soft X-ray tomography as a quantitative three-dimensional tool to model nanoparticle:cell interaction.</a> Journal of Nanobiotechnology. 14, 15(2016).</li>
<li>Varsano, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+correlative+cryo-soft+X-ray+tomography+and+stochastic+reconstruction+microscopy.+A+study+of+cholesterol+crystal+early+formation+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Development of correlative cryo-soft X-ray tomography and stochastic reconstruction microscopy. A study of cholesterol crystal early formation in cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 138, 14931-14940 (2016).</li>
<li>Kounatidis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+cryo-structured+illumination+fluorescence+microscopy+and+soft+X-ray+tomography+elucidates+reovirus+intracellular+release+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Correlative cryo-structured illumination fluorescence microscopy and soft X-ray tomography elucidates reovirus intracellular release pathway.</a> Cell. 182, 1-16 (2020).</li>
<li>Kapishnikov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mode+of+action+of+quinoline+antimalarial+drugs+in+red+blood+cells+infected+by+Plasmodium+falciparum+revealed+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Mode of action of quinoline antimalarial drugs in red blood cells infected by Plasmodium falciparum revealed in vivo.</a> PNAS. 116 (46), 22946-22952 (2019).</li>
<li>Conesa, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unambiguous+intracellular+localization+and+quantification+of+a+potent+iridium+anticancer+compound+by+correlative+3D+cryo+X-ray+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Unambiguous intracellular localization and quantification of a potent iridium anticancer compound by correlative 3D cryo X-ray imaging.</a> Angewandte Chemie International Edition. 59, 1270-1278 (2020).</li>
<li>Gal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native-state+imaging+of+calcifying+and+noncalcifying+microalgae+reveals+similarities+in+their+calcium+storage+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Native-state imaging of calcifying and noncalcifying microalgae reveals similarities in their calcium storage organelles.</a> PNAS. 115 (43), 11000-11005 (2018).</li>
<li>Procopio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+fingerprint+of+Zn-hydroxyapatite+in+the+early+stages+of+osteogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Central+Science%22%5BJournal%5D)">Chemical fingerprint of Zn-hydroxyapatite in the early stages of osteogenic differentiation.</a> ACS Central Science. 5, 1449-1460 (2019).</li>
<li>Kahil, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+pathways+of+calcium+transport+and+concentration+toward+mineral+formation+in+sea+urchin+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Cellular pathways of calcium transport and concentration toward mineral formation in sea urchin larvae.</a> PNAS. 117 (49), 30957-30965 (2020).</li>
<li>Conesa, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+nanoparticles+mass+quantification+by+near-edge+absorption+soft+X-ray+nanotomography%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Intracellular nanoparticles mass quantification by near-edge absorption soft X-ray nanotomography.</a> Scientific Reports. 6, 22354(2016).</li>
<li>Otón, J., Sorzano, C. O. S., Maribini, R., Pereiro, E., Carazo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+the+modulation+transfer+function+of+an+X-ray+microscope+based+on+multiple+Fourier+orders+analysis+of+a+Siemens+star%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Measurement of the modulation transfer function of an X-ray microscope based on multiple Fourier orders analysis of a Siemens star.</a> Optics Express. 23 (8), 9567-9572 (2015).</li>
<li>Otón, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+transfer+function%2C+resolution+and+depth+of+field+of+a+soft+X-ray+microscope+applied+to+tomography+enhancement+by+Wiener+deconvolution%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Characterization of transfer function, resolution and depth of field of a soft X-ray microscope applied to tomography enhancement by Wiener deconvolution.</a> Biomedical Optics Express. 7, 5092-5103 (2016).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116, 71-76 (1996).</li>
<li>Heymann, J. B., Cardone, G., Winkler, D. C., Steven, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+resources+for+cryo-electron+tomography+in+Bsoft%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Computational resources for cryo-electron tomography in Bsoft.</a> Journal of Structural Biology. 161, 232-242 (2008).</li>
<li>Messaoudi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+chemical+mapping+by+EFTEM-TomoJ+including+improvement+of+SNR+by+PCA+and+ART+reconstruction+of+volume+by+noise+supression%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional chemical mapping by EFTEM-TomoJ including improvement of SNR by PCA and ART reconstruction of volume by noise supression.</a> Microscopy Microanalysis. 19, 1669-1677 (2013).</li>
<li>Agulleiro, J. I., Fernández, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+tomographic+reconstruction+on+multicore+computers%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast tomographic reconstruction on multicore computers.</a> Bioinformatics. 27, 582-583 (2011).</li>
<li>Toro-Nahuelpan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+cryo-electron+microscopy+grids+by+photo-micropatterning+for+in-cell+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies.</a> Nature Methods. 17, 50-54 (2020).</li>
<li>Attwood, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAttwood%2C+D+%22Soft+X-rays+and+Extreme+Ultraviolet+Radiation.+Principles+and+Applications%22">Soft X-rays and Extreme Ultraviolet Radiation. Principles and Applications</a>. , Cambridge University Press. Cambridge. (2000).</li>
<li>Howells, M., Jacobsen, C., Warwick, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHowells%2C+M+%22Principles+and+Applications+of+Zone+Plate+X-ray.+Microscopes.+Science+of+Microscopy%22">Principles and Applications of Zone Plate X-ray. Microscopes. Science of Microscopy</a>. , Springer. New York. (2007).</li>
<li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Chemistry%22%5BJournal%5D)">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of Computational Chemistry. 25, 1605-1612 (2004).</li>
<li>Belevich, I., Joensuu, M., Kumar, D., Vihinen, H., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopy+image+browser%3A+a+platform+for+segmentation+and+analysis+of+multidimensional+datasets%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Microscopy image browser: a platform for segmentation and analysis of multidimensional datasets.</a> PLOS Biology. 14 (1), 1002340(2016).</li>
<li>Luengo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SuRVoS%3A+Super-region+volume+segmentation+workbench%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">SuRVoS: Super-region volume segmentation workbench.</a> Journal of Structural Biology. 198, 43-53 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Numune hazırlama, yüksek kaliteli yumuşak X-ışını tomogramları elde etmek için kritik bir adımdır, çünkü kaliteleri doğrudan numune vitrifikasyonunun kalitesine ve hücrenin gömülü olduğu buz tabakası kalınlığına bağlıdır. Yüksek sinyal-gürültü oranına sahip projeksiyonlar, ince buz tabakasına sahip bölgelerde toplanacak ve mümkün olan en yüksek çözünürlüğü elde etmek için gereken radyasyon dozunu en aza indirmeye izin verecektir. Ek olarak, hücre akıcılığı son tomogram kalitesini de etkileyecektir, çünkü komşu hücrelerin rotasyon sırasında FoV'ye girmesinden kaçınılmalıdır. Son olarak, Au fiducial işaretleyicilerin doğru dağılımı, projeksiyon hizalamasının doğruluğunu belirleyecek ve daha sonra nihai 3D yeniden yapılandırılmış hacmin kalitesini belirleyecektir. Au referanslarının ızgaraya düzgün bir şekilde yayılmasının, projeksiyon hizalama adımının otomatikleştirilmesini sağladığını ve bu olmadan böyle kritik bir adım için yüksek bir uzmanlığa ihtiyaç duyulduğunu unutmayın.
Buradaki protokol, kriyoelektron tomografisinde (kriyo-ET) kullanılanlarla benzerlikleri olan yalnızca bir olası numune hazırlama stratejisini göstermektedir. Her iki durumda da, daha iyi tekrarlanabilirlik için zorlu numune hazırlığını geliştiren protokoller, bu tekniklerin başarısı için temel olacaktır ve bu hedefe yönelik çabalar sarf edilmektedir29. İzole edilmiş hücrelerin görüntülenmesine ek olarak, bölümden geçen iletim sinyalinin yüksek eğim açılarında yeterli olması koşuluyla doku bölümlerinin de görselleştirilebileceğini belirtmekte fayda var. Tipik olarak, bu birkaç mikronluk bölümler anlamına gelir (10 μm'nin altında).
Bir hücrenin içindeki belirli bir yapıyı veya olayı görüntülemek için, bu özelliğin tilt serisinin FoV'sinde olduğundan emin olunması gerekir. Kriyo-SXT'deki FoV, lense bağlı olarak 10 x 10 μm 2 ila 15 x 15 μm 2 ile sınırlı olduğundan ve çözünürlüğün en az2 faktörüne kadar bir piksel aşırı örneklemesini hesaba kattığından, genellikle tam hücre uzantısından daha küçüktür (Şekil 5'te belirtilen kırmızı karelere bakın). Bu nedenle, yatırım getirisi bulunmalı ve uygun şekilde etiketlenmelidir. Bu genellikle floresan etiketler ve görünür ışık bağıntılı yaklaşımlar aracılığıyla yapılır. Epifloresanı birleştiren 2D stratejileri, yumuşak X-ışını iletim mikroskobunun entegre bir çevrimiçi görünür ışık floresan mikroskobuna sahip olması nedeniyle basittir, ancak yüksek çözünürlüklü 2D veya 3D floresan sinyali için diğer yaklaşımlar da mevcuttur 4,12,13,15,16 . Bu gibi durumlarda, ızgaranın önce süper çözünürlüklü mikroskoplar gibi belirli cihazlarda görüntülenmesi gerekir. En etkili korelasyon yaklaşımlarının, kriyojenik koşullarda veri toplamayı içerenler olduğunu unutmayın. Bunun nedeni, oda sıcaklığı (RT), görünür ışık floresan görüntüleme ve numune vitrifikasyonu arasındaki zaman atlamasının, örneğin, doğru hücresel olayın zamanında yakalanmasını engelleyeceğidir; Ek olarak, vitrifikasyon prosedürü, RT'de görüntülenen ilgili hücreyi ızgaradan ayırabilir. Çoğu korelasyonel görüntüleme yaklaşımı, numune ızgaralarının manipüle edilmesi ve bir cihazdan diğerine taşınması gerektiği anlamına gelse bile ve bunun ortaya çıkardığı ızgara kontaminasyonu veya hasar riskinin artmasına rağmen, ödül açıktır: hücresel manzara içindeki belirli olayları veya molekülleri belirleyebilmek.
Tüm hücre görüntülemesi gerektiğinde, uygulanan toplam dozun radyasyon hasarı sınırını aşmaması koşuluyla farklı tomogramların dikilmesi mümkündür. Genellikle, aynı hücrede birkaç tomogram toplamak için biriken doz, ulaşılabilir çözünürlükteki (109 Gy) sınırın çok altındadır ve bu nedenle, numune ve deneye bağlı olmasına rağmen, dozu düşürmek için spesifik bir strateji gerekmez. Spektro-tomografi gibi yoğun veri toplama durumunda, dozun en aza indirilmesi gerçekten gerekli olacaktır ve uygun veri toplama ve spesifik işleme stratejilerinin uygulanması gerekecektir.
Cryo-SXT'nin burada belirtilmesi gereken birkaç sınırlaması vardır. Birincisi, düz numune desteklerinin kullanılmasına özgü olan iyi bilinen eksik kamadır. 180 derecelik rotasyona izin veren kılcal numune destekleri geçmişte kullanılmış ve hala bazı tesislerde kullanılmaktadır, ancak cam emilimi ve süspansiyonda hücrelerin kullanılmasının kısıtlanması nedeniyle fakirleşmiş bir kontrast gibi dezavantajlar da sunmaktadırlar. Eksik kamanın etkisini azaltmanın bir yolu da dual tilt tomografi yapmaktır. Bu, günümüzde Mistral ışın hattında gerçekten mümkündür. İkinci sınırlama, bu tür mikroskoplarda kullanılan Fresnel bölgesi plaka lensi tarafından belirlenir. Bu lens, her ikisi de sıkı sıkıya ilişkili olan elde edilebilir nihai çözünürlüğü ve alan derinliğini (DoF) ayarlar. Bu, çözünürlüğün arttırılmasının DoF'u azaltacağı, hücrenin kalınlığının ise genellikle daha büyük olacağı anlamına gelir. Örneğin, 40 nm lens, teoride 3 μm'lik bir DoF'ye ve 24.4 nm yarım perdelik bir çözünürlüğe sahip olacaktır. Bu nedenle çözünürlük ve DoF arasındaki uzlaşma stratejiktir ve lensin seçimi30,31 hücresinin tipine bağlı olacaktır. Son olarak, dünya çapında operasyonel TXM'ler ideal mikroskoplar olmaktan uzaktır ve teorik beklentilere ulaşmak için optik sistemleri geliştirmek için çaba sarf edilmektedir. Son olarak, yeniden yapılandırılan hacimlerin görselleştirilmesi ve segmentasyonu, belirli yazılım araçları25,32,33,34 ile gerçekleştirilebilir.
Özetle, kriyo-SXT, görüntüleme hücrelerine kantitatif olarak orta çözünürlükte (25-30 nm yarım perde) ve istatistiksel sayılarda (günde birkaç on tomogram) izin verir. Bu, organellerin organizasyonunu, dağılımını ve boyutunu, örneğin patojen enfeksiyonu veya hastalıkları sırasında, kesin zaman noktalarında veya belirli tedavilerden sonra belirli koşullarda elde etmeyi sağlar. Bu nedenle, her biri belirli bir numune boyutu ve çözünürlüğü aralığını ele alan daha yaygın elektron ve görünür ışık mikroskopileri için yararlı bir tamamlayıcı biyolojik görüntüleme tekniğidir. Kriyo-SXT, görünür ışık floresansını içeren korelasyon yaklaşımlarında sıklıkla kullanılır, ancak diğer kriyo korelasyon stratejileri de mümkündür.

Cryo-SXT, hidratlanmış bütün hücrelerin 1,2,3,4,5,6 hacimlerini 3D orta çözünürlüklü (25-30 nm yarım perde) sağladığı için biyolojik görüntüleme araştırmalarında merkezi bir rol oynayabilir. Su penceresi enerji aralığında, karbon ve oksijen absorpsiyonu K kenarları (4.4-2.3 nm) arasında, karbon bakımından zengin hücresel yapılar, onlara nüfuz eden ve onları çevreleyen oksijen bakımından zengin ortamdan 10 kat daha fazla emer. Bu enerji aralığında, 10 μm kalınlığa kadar vitrifiye hücreler, kesitleme veya boyama işlemine gerek kalmadan görüntülenebilir, bu da numune rotasyon yetenekleriyle birleştiğinde, hücresel yapının tomografik rekonstrüksiyonuna izin veren nicel yüksek absorpsiyon kontrast projeksiyonlarına yol açar. Cryo-SXT, numune boyutları ve uzamsal çözünürlük açısından başka herhangi bir görüntüleme tekniği tarafından kolayca erişilemeyen bir boşluğu doldurur.
Kısacası, kriyo-SXT'nin absorpsiyon kontrastı nicelikseldir, çünkü fotonların t kalınlığı örneği boyunca zayıflaması Beer-Lambert yasasına aşağıdaki gibi uyar: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62190/62190eq01.jpg" style="margin:-.4em 0;">Burada I0, olay yoğunluğunu temsil eder ve μl λ dalga boyuna ve numunenin kırılma indisinin hayali kısmına bağlı olan doğrusal absorpsiyon katsayısı β (<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62190/62190eq02.jpg" style="margin:-.4em 0;"> ). Zayıflama, biyokimyasal bileşimin ve görüntülenen yapıların kalınlığının bir fonksiyonudur ve her biyokimyasal bileşen, l'μ (LAC) belirli bir X-ışını doğrusal absorpsiyon katsayısına sahiptir. Bu, her tomografi voksel değerinin kimyasal elementlere ve bunların voksel7'deki konsantrasyonlarına bağlı olduğu anlamına gelir. Bu, çekirdekler, nükleoller, lipit cisimleri veya mitokondri gibi farklı organellerin doğal ayrımcılığına veya kromatinin farklı sıkıştırma durumlarına, yalnızca doğal LAC değerlerine dayanarak yeniden yapılandırılmasına izin verir 2,8,9.
Ek olarak, kriyo-SXT, tomogramların birkaç dakika içinde toplanmasıyla yüksek verimli bir tekniktir. Bu, özellikle bölünme, farklılaşma ve apoptoz gibi kilit zaman noktalarında, aynı zamanda spesifik ilaç tedavilerine veya patojenik enfeksiyonlara kimyasal maruziyetin neden olduğu gibi farklı yanıt durumlarında yakalanabilen hücre popülasyonlarının mezoölçekli görüntülenmesini sağlar. Bu kilit noktalarda toplanan veriler, bu belirli anlarda farklı hücresel organellerin mekansal organizasyonunun sadık bir kaydı ile sistemin 3D tanımını sunacaktır.
Genellikle, kriyo-SXT, 3D hücresel ortam 4,10,11,12,13,14,15,16 veya sert X-ışını floresan verileri 17,18 içinde belirli özelliklerin, olayların veya makromoleküllerin bulunmasına izin veren korelasyon yaklaşımlarını izleyen diğer tekniklerle birlikte kullanılır. . Kriyojenik koşullardaki korelasyon yaklaşımları, ilgilenilen sistemin en eksiksiz ve değerli resmini elde etmek için büyük önem taşımaktadır. Mistral (Alba) ve B24 (Diamond) kriyo-SXT ışın hatlarındaki tipik iş akışının kısa bir özeti Şekil 1'de çizilmiştir.
Ayrıca, senkrotron tesislerindeki dalga boyu ayarlama yeteneğinden yararlanarak, numunede bulunan belirli elemanların spesifik diferansiyel absorpsiyonu kullanılarak yapısal olana ek olarak spektroskopik bilgi elde edilebilir. Bunun bir örneği, 19,20,21 hücrelerindeki biyomineralizasyon işlemlerinin incelenmesinde kalsiyumun yeri olabilir. Farklı foton enerjilerinde (spektrumlar) veya tomogramlarda ve ilgilenilen x-ışını absorpsiyon kenarında 2D görüntüler çekerek, seçilen elemanı içeren pikseller veya vokseller tanımlanabilir. Spektrumlar ayrıca kimyasal durumların farklılaşmasına izin verir (yani, önceki biyomineralizasyon örneği20'de olduğu gibi amorf kalsiyumun hidroksiapatit'e evrimi). Farklı elemanların nicelleştirilmesi 2D ve 3D olarak mümkündür. Vitrifiye hücrelerin spektroskopik görüntülemesi tipik olarak su penceresinde yapılır, ancak su içeriği yeterince düşükse veya dehidrasyon da dahil olmak üzere diğer numune hazırlama protokolleri kullanılıyorsa diğer enerji aralıklarında da mümkündür22. Ayrıntılı bir spektroskopi adım adım protokolü, buradaki protokolün odağının ötesindedir.
Bundan sonra, protokol ana numune hazırlama adımlarını kısaca özetlemeye odaklanır, ancak her sistem bireysel iyileştirmeye ihtiyaç duyabilir, ardından kriyo yumuşak X-ışını tomografisi için ayrıntılı bir adım adım veri toplama prosedürü izler.

<table><tbody><tr><td>Segmentasyon</td> için <td>Amira Thermo Fisher</td><td></td><td>Yazılımı</td></tr><tr><td>Au Holey Karbon Filmler&nbsp; bulucu ızgaraları</td> <td>(Quantifoil Micro Tools Gmb</td><td>&nbsp; R 2/2 Au G200F1</td><td>Au Holey Karbon Filmler bulucu ızgaralar</td></tr><tr><td>Au nanopartiküller</td> <td>ve nbsp; BBI Group, Cardiff, UK</td><td>Au nanopartiküller 100nm</td><td>100 nm Au nanopartiküller (NP'ler) Mistral (Alba)</td></tr><tr><td>Au nanopartiküller</td><td>&nbsp; BBI Group, Cardiff, Birleşik Krallık</td><td>Au nanopartiküller 250nm</td><td>250 nm Au nanopartiküller (NP'ler) B24'te (Elmas)</td></tr><tr><td>Axio Scope A1</td><td>Zeiss</td><td>430035 9060</td><td>Floresan mikroskobu</td></tr><tr><td>Blotting No.1 filtre kağıdı</td><td>Whatman</td><td>WHA10010155</td><td>Lekeleme filtresi</td></tr><tr><td>Projeksiyon hizalama, yeniden yapılandırma ve görselleştirme için Bsoft</td><td></td><td></td><td></td> Yazılımı (Heymann et al., 2008)</tr><tr><td>Chimera</td><td></td><td></td><td>Segmentasyon yazılımı (Pettersen et al. 2004)</td></tr><tr><td>Cryo-EM Kızdırma Deşarj Seti</td><td>PELCO easiGlow</td><td>91000S</td><td>Kızdırma Deşarjı Temizleme Sistemi</td></tr><tr><td>Cu Holey Karbon Filmler&nbsp; bulucu ızgaralar</td><td>(Quantifoil Micro Tools Gmb</td><td>&nbsp; R 2/2Cu G200F1</td><td>Cu Holey Karbon Filmler bulucu ızgaraları</td></tr><tr><td>Fetal buzağı serumu</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td>Isı ile Etkisizleştirilmiş, steril filtreli, hücre kültürü için uygun</td></tr><tr>Java'da görüntü işleme ve analiz için<td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Yazılımı (NIH & LOCI University of Wisconsin)</td></tr><tr><td>Projeksiyon</td><td>hizalama, yeniden yapılandırma ve görselleştirme için</td> IMOD <td></td><td></td> Yazılımı (Kremer ve diğerleri, 1996)</tr><tr><td>Leica EM GP Izgara Pistonu</td><td>Leica</td><td>16706401</td><td>Otomatik Dalma Dondurucu EM</td></tr><tr><td>LINKAM kriyo aşaması</td><td>Linkam Scientific Instruments</td><td>CMS 196</td><td>Kriyo-Korkorelasyon Mikroskobu Aşaması</td></tr><tr><td>MIB</td><td></td><td></td><td>Segmentasyon yazılımı (Belevich et al. 2016)</td></tr><tr><td>P100 Petri kabı</td><td>Sigma</td><td>P6106</td><td>Hücre kültürü ve steril</td></tr><tr><td>P60 Petri kabı</td> için işlenmiştir <td>Sigma</td><td>D8054</td><td>Hücre kültürü ve steril</td></tr><tr><td>Polilizin</td> için işlenmiştir <td>Sigma</td><td>P4707</td><td>Poli-L-lizin çözeltisi %0.01, steril filtreli</td></tr><tr><td>Yumuşak X-Işını mikroskobu 0.25-1.2keV</td><td>Xradia</td><td>NCT-SB</td><td>Şanzıman yumuşak Segmentasyon için X-Işını mikroskobu</td></tr><tr><td>SURVOS</td><td></td><td></td><td>Yazılımı&nbsp; (Luengo ve ark. 2017)</td></tr><tr>Yeniden yapılandırma için <td>Tomo3d</td><td></td><td></td><td>Yazılımı (SIRT, WBP) (Agulleiro ve ark. 2011)</td></tr><tr>Yeniden yapılandırma için <td>TomoJ</td><td></td><td></td><td>Yazılımı (ART) (Messaoudi ve ark., 2007)</td></tr><tr><td>XM Veri Gezgini</td><td>Zeiss</td><td></td><td>TXM yazılımı</td></tr></tbody></table>

cryo soft x-ray tomografisi ile hücrenin 3d kartografik açıklaması

A 3D Cartographic Description of the Cell by Cryo Soft X-ray Tomography

Görüntüleme teknikleri, biyolojik araştırmalarda ve ilgili alanlarda hücre organizasyonunu ve makinelerini anlamak için temeldir. Bu teknikler arasında, kriyo yumuşak X-ışını tomografisi (SXT), karbon yapılarının sudan doğal olarak daha yüksek emilime sahip olduğu su penceresi X-ışını enerji aralığındaki (284-543 eV) tüm kriyo korunmuş hücrelerin görüntülenmesini sağlar ve her vokelde bulunan malzemenin doğrusal absorpsiyon katsayısının 3D rekonstrüksiyonuna izin verir. 10 μm kalınlığa kadar tüm hücreler seviyesindeki nicel yapısal bilgi, 25-30 nm yarım perdeye kadar yüksek verim ve uzamsal çözünürlük ile bu şekilde elde edilebilir. Cryo-SXT, hücresel enfeksiyon süreçleri (virüs, bakteri veya parazitler), hastalıklara bağlı morfolojik değişiklikler (resesif genetik hastalıklar gibi) hakkında 3D bilgi sağlayarak ve hücresel düzeyde ilaç etkisini anlamamıza yardımcı olarak veya 3D hücresel ortamdaki belirli yapıları konumlandırmamıza yardımcı olarak mevcut biyomedikal araştırmalarla ilgili olduğunu kanıtlamıştır. Ek olarak, senkrotron tesislerindeki ayarlanabilir dalga boyundan yararlanarak, spektro-mikroskopi veya 3D muadili spektro-tomografi, biyomineralizasyon işlemlerinde kalsiyum gibi hücredeki spesifik elementleri görüntülemek ve ölçmek için de kullanılabilir. Kriyo-SXT, elektron mikroskobu, X-ışını floresansı veya görünür ışık floresansı gibi diğer biyolojik görüntüleme tekniklerine tamamlayıcı bilgiler sağlar ve genellikle fonksiyon, konum ve morfolojiyi birbirine bağlamak için kriyojenik koşullarda 2D veya 3D korelasyon görüntüleme için ortak bir yöntem olarak kullanılır.

Kriyo-SXT için numune hazırlamak zor olabilir. Aynı örnek ızgara içinde bile, aynı Au finder ızgarasından iki kare gösteren Şekil 5'te görülebileceği gibi, ideal olan alanlara ve ideal olmayan alanlara sahip olmak mümkündür. İdeal numune, kare bir ağın merkezinde, ince bir buz tabakasına gömülü ve tomografi rekonstrüksiyonundan önce eğim projeksiyonlarının hizalanması için kullanılan iyi dağılmış Au fiducial belirteçlerle çevrili tek hücrelere sahip olmalıdır. Şekil 5A , bu kriterlerin çoğuna uyan fibroblast benzeri bir hücreyi (NIH 3T3) göstermektedir. Görüş alanını (FoV) gösteren kırmızı kutu ile işaretlenmiş alanın ART27 kullanılarak yapılan bir 3B rekonstrüksiyonundan tek bir dilim Şekil 5B'de gösterilmiştir. Mitokondri (M), endoplazmik retikulum (ER), veziküller (V) ve çekirdek (N) gibi birçok farklı organel, LAC'ların kantitatif rekonstrüksiyonu sayesinde ayırt edilebilir. Ek olarak, rekonstrüksiyonun sinyal-gürültü oranı çok yüksektir ve hücresel özelliklerin yüksek kontrastını elde etmeyi sağlar. Öte yandan, Şekil 5C, daha yüksek hücre yoğunluğuna sahip bir kare göstermektedir. Bu nedenle, lekelenme genellikle daha az verimlidir, bu da daha kalın bir buz tabakasına ve hatta vitrifikasyon sorunlarına yol açar. Bazı durumlarda, X-ışını görüntülemeden önce epifloresan haritalaması kullanılarak ızgarayı tararken bu zaten gözlemlenebilir ve bu ızgaralardan ne pahasına olursa olsun kaçınılmalıdır. Şekil 5C'de, ızgara içinde bir çatlak ve vitrifiye buzun tüm ağ karesinden (kırmızı oklarla işaretlenmiş) geçtiği gözlemlenebilir. Çatlakların yakınındaki herhangi bir görüntüleme, kirişe maruz kaldığında ızgaranın olası dengesizliği nedeniyle kaçınılmalıdır. Ek olarak, çatlaklar bu alanda olduğu gibi kalın buzun bir işareti olabilir. Kırmızı kutuyla işaretlenmiş alana bir eğim serisi kaydedildi. Şekil 5D'de, karşılık gelen 3B rekonstrüksiyondan tek bir dilim gösterilmiştir. Bazı daha büyük yapılar tanınabilse de, kalın buzun zayıf vitrifikasyon kalitesi nedeniyle gürültü ve grenli doku içinde ince detaylar kaybolur, örneğin okla işaret edilen üst mitokondride de görülebileceği gibi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62190/62190fig1v2.jpg"> Şekil 1: İş akışı. Kriyo-SXT veri toplamadan önce şematik iş akışı izlendi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62190/62190fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62190/62190fig02.jpg"> Şekil 2: Izgaralarda büyüyen hücreler. (A<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62190/62190fig02large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62190/62190fig03.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62190/62190fig03large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62190/62190fig04.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62190/62190fig04large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62190/62190fig05.jpg"> &amp;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62190/62190fig05large.jpg" target="_blank"></a>

Burada, kriyo yumuşak X-ışını tomografisinde (SXT) kriyo-korunmuş hücrelerin ultrayapısını 25 nm yarım perde çözünürlükte görüntülemek için gerekli numune hazırlama ve veri toplama adımlarını açıklayan bir protokol sunulmaktadır.

Cryo Soft X-ray Tomografisi ile Hücrenin 3D Kartografik Açıklaması

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these ...

Cryo Soft X-ışını tomografisi, hücresel düzeyde bağımsız olarak veya diğer görüntüleme teknikleriyle birlikte kullanılabilecek kantitatif değerli bilgiler sağlayabilir. Boyama veya kesitleme için gerekli olan donmuş hidratlanmış bir durumda sensör görüntüsü. Buna ek olarak, yüksek verimli bir tekniktir, çünkü her tomogram sadece birkaç dakika içinde toplanır.Yumuşak röntgen kriyo-tomografisi, enfekte veya kusurlu hücrelerde hücre restorasyon sürecini tek hücre düzeyinde takip etmek için mükemmel bir platform sunar. Bu teknik, redakte edilmiş fenotiplerin enfeksiyonunu geri döndürmek için yeni antiviral ilaçların veya gen tedavisinin etkinliğini bildirebilir. Numuneleri iletim X-ışını mikroskobuna yüklemek için, transfer odasını 100 Kelvin'den daha azına ulaşana kadar sıvı azotla soğutun.İş istasyonunu ek sıvı azotla doldurun ve iş istasyonu jantının ısıtıcısını açın. İş istasyonu jantı kaynamayı durdurduğunda, ızgaraları içeren kriyo kutusunu, kriyo koşulları altında iş istasyonunda uygun yerlere yerleştirin ve ızgaraları önceden soğutulmuş numune tutuculara yükleyin. Tutucuları mekiğe yükleyin ve kapaklarla koruyun.Mekiği transfer odasına 100 Kelvin'den daha az bir hızda yükleyin ve odayı düşük vakuma pompalayın. Transfer odasını mikroskopa takın ve transfer odası mekiğini mikroskopa yüklemek için ekrandaki vakum prosedürünü izleyin. Mekik örneklerle mikroskopa girdikten sonra, bir örnek tutucuyu numune aşamasına aktarmak için mikroskop robot kolunu kullanın.Çevrimiçi görünür ışık mikroskobu ile ızgaranın parlak alan görüntülemesi için, görünür ışık mikroskobu kamerasını seçin ve parlak alan görüntüleme için görünür ışık mikroskobu LED kaynağını açın. Görünür ışık mikroskobu hedefine bakacak şekilde numuneyi eksi 60 dereceye döndürmek için Hareket, Kontrol, Örnek ve Örnek teta'ya tıklayın ve Hareket Kontrolü ve Örnek'i seçin ve örneği beklenen ortalanmış konumlara taşımak için X ve Y örneğini değiştirin. Mikroskop, Alma, Edinme Ayarları, Edinme Modları, Sürekli ve Başlat'ı seçin ve karbon destek filminin hücreleri ve/veya delikleri netleşene kadar odağı beş mikrona kadar daha küçük adımlarla hassaslaştırmak üzere Z örneğini seçmek için Hareket Kontrolü ve Örnekle'yi tıklatın.Ardından, mozaik için varsayılan değerleri kullanarak parlak alan modunda ızgaranın tam mozaik haritasını almaya başlamak için Mikroskop, Alma, Edinme Ayarları, Edinme Modları, Mozaik ve Başlat'ı seçin. Floresan modu mozaik görüntüleme için, parlak alan görüntüleme için görünür ışık mikroskobu LED kaynağını kapatın ve istenen uyarma dalga boyuna karşılık gelen LED ışık kaynağını ve ilgili optik filtreyi kurulumda manuel olarak seçin. Mikroskop, Alma, Alma Ayarları, Edinme Modları, Sürekli ve Başlat'ı seçin ve floresan görüntüye odaklanmayı hassaslaştırmak üzere Z örneğini seçmek için Hareket Kontrolü ve Örnek'i tıklatın.Ardından, parlak alan mozaiğinden konumsal X ve Y parametrelerini koruyan bir mozaik harita almak için Mikroskop, Alma, Edinme Ayarları, Edinme Modları, Mozaik ve Başlat'ı tıklatın. Ardından, LED ışık kaynağını kapatın. X-ışını mozaik alımı için, çıkış yarığını beş mikrona değiştirin ve MISTRAL'de bir saniyelik bir pozlama kullanın.Örnek Z çevirisini kullanarak odağı ayarlamak için Mikroskop, Alma, Alma Ayarları, Kamera Ayarları ve Binning'i seçin. Numune Z.Beş mikronluk adımlarla başlayarak, hücre veya karbon folyo delikleri iyi odaklanana kadar odağı 0,5 mikronluk adımlara kadar hassaslaştırın. Ağ karesinin mozaik haritasını almak için Mikroskop, Edinme, Edinme Ayarları, Edinme Modu, Mozaik ve Başlat'ı tıklatın.Harita alındığında, Hareket Denetimi ve Örnek'i tıklatın ve örneği düz bir alan konumuna taşımak için X ve Y örneğini değiştirin. MISTRAL'de pozlama süresini bir saniyeye ayarlayın. Ardından, iletimi elde etmek ve normalleştirilmiş mozaiği kaydetmek için edinilen mozaiği düz alan görüntüsüyle normalleştirin.Dönme eksenindeki numuneyi sıfır derecedeki dönüşle hizalamak için Hareket Kontrolü ve Örnekle'yi seçin ve dönüş eksenine yerleştirilecek hücrenin özelliğine odaklanmak için X, Y ve Z örneğini değiştirin. Numuneyi pozitif bir teta konumuna döndürmek için Hareket Kontrolü ve Örnekle'yi seçin ve Numune tetasını pozitif teta olarak değiştirin. Döndürme eksenine yerleştirilecek hücrenin özelliğine çizgi çizmek için çizgi aracını kullanın.Numuneyi negatif teta konumuna döndürmek için Hareket Kontrolü ve Örnekle'yi seçin ve Numune tetasını negatif teta olarak değiştirin. Döndürme eksenine yerleştirilecek hücrenin özelliğine çizgi çizmek için çizgi aracını kullanın. Pozitif veya negatif teta konumundayken, seçilen unsuru her iki çizgi arasındaki merkez konumuna taşımak için örnek Z çevirisini kullanın ve minimum çizgiden satıra mesafe elde edilene kadar numune rotasyonunu tekrarlayın.Örnek teta sıfıra eşit olduğunda, seçilen unsuru görüş alanının merkezine koymak için gereken mesafenin iki katı kadar X örneğini hareket ettirin ve özelliği görüş alanının merkezine geri getirmek için X bölge plakasını hareket ettirin. Z bölge plakası konumunu yeni dönüş eksenine göre yeniden optimize etmek için Mikroskop, Alma, Edinme Ayarları, Edinme Modları ve Odak Serisi'ni seçin ve bir bölge plakası Z odak serisi kaydetmek için Başlat'ı tıklatın. Ardından, Hareket Kontrolü ve Bölge Plakası'nı tıklatın ve Z bölge plakasını numunenin odaklandığı konuma taşımak için Z bölge plakasını seçin.Bir tomogram edinmek için, Hareket Kontrolü ve Örnekle'ye tıklayın ve negatif maksimum açıyı artı 0,1'e taşımak için Örnek teta'yı seçin. Görüntü sayısını sıfır açısındaki ve açısal aralıktaki görüntüyü dikkate alarak toplam açı sayısı olarak ayarlamak için Mikroskop, Alma, Alma Ayarları, Alma Modları ve Tomografi'yi tıklatın ve görüntü sayısını ayarlayın. Açı Başlangıcı ve Açılı Uç'u seçin, Mikroskop, Alma, Alma Ayarları, Kamera Ayarları'na tıklayın ve pozlama süresini ayarlayın.Tomografi tilt serisini satın almaya başlamak için Başlat'ı tıklatın. İdeal numune, ince bir buz tabakasına gömülü kare bir ağın merkezinde tek hücrelere sahip olmalı ve iyi dağılmış altın referans belirteçleri ile çevrili olmalıdır. Mitokondri, endoplazmik retikula, vakuoller ve çekirdek gibi birçok farklı organel, doğrusal absorpsiyon katsayılarının kantitatif rekonstrüksiyonu sayesinde, nihai yeniden yapılandırılmış tomogramda ayırt edilebilmelidir.Bu görüntüde, daha yüksek hücre yoğunluğuna sahip bir kare gözlemlenebilir. Bu örnekte, lekelenme daha az verimliydi ve çatlaklarla daha kalın bir buz tabakasına yol açtı. Bu preparatta bazı daha büyük yapılar tanınabilse de, kalın buzun düşük vitrifikasyon kalitesi nedeniyle gürültü ve grenli doku içinde ince detaylar kayboldu.Kriyo-korunmuş numune minimal olarak ele alınmalıdır, çünkü eserlerin çoğu bu aşamadaki örnekler indüklendiğinde indüklenir. Genellikle, korelasyon kriyo-görünür ışık fotomikroskopisi, kriyo substrat tomografisinden önce kullanılır. Ek olarak, spektral mikroskopi ilgili kimyasal elementlerde yapılabilir.Bu protokol, başka herhangi bir doğrudan görüntüleme tekniği tarafından kolayca erişilemeyen bir numune ve çözünürlük rejiminde çalışarak, birkaç mikron ve 30 nanometre yarım adım çözünürlüğe izin vererek bir nişi doldurur.

a-3d-cartographic-description-cell-cryo-soft-x-ray

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Yerli yakın eyalette bakteri hücrelerinin ultrastrüktür çalışma elektron cryotomography (EKT) nasıl kullanılacağı "makromoleküler" (~ 4 nm) çözünürlük, burada göstermektedir.

Bakteriyel Hücre Elektron Cryotomography

Biz yüksek hızlı 3D canlı hücre floresan ışık mikroskobu ve yüksek çözünürlüklü kriyo-elektron tomografi birleştiren bir karşılıklı mikroskopi yöntemi açıklanmaktadır. Biz burada görüntüleme, dinamik ana HeLa hücreleri ile etkileşime küçük bir HIV-1 parçacıkların bağıntılı yöntemin özelliği göstermektedir.

Dinamik Etkileşimler 3D Yapısal Analiz için karşılıklı Mikroskopi

Ince yapı analizi için nöronal işlemleri korumak için, camsı bir buz tabakası içinde süspansiyon haline numune verecek şekilde flaş dondurma, ardından elektron mikroskobu taramalarında primer nöron kaplanması için bir protokol açıklar. Bu örnekler nanometre ölçeğinde yapıları görselleştirmek için bir kriyo-elektron mikroskobu ile muayene edilebilir.

Cryo-Elektron Tomografi kullanma Frozen-hidratlı Devlette neurites görselleştirme İlköğretim Nöronlar hazırlanması

Biz, moleküler makinelerin yerinde yapılarında yüksek çözünürlük belirlemek için yüksek verimli cryo-elektron tomografisi yararlanmak için nasıl bir protokol mevcut. Protokol ortak darboğazları önler, büyük miktarda veri işlenecek izin verir ve kullanıcı önemli biyolojik sorulara odaklanmak için izin, kaynak çalışmama süresini azaltır.

Tomoauto kullanma: Bir Protokol Yüksek verim Otomatik Cryo-elektron Tomografi için

Bu iletişim kuralı, siyanobakteriler geçici DNA sıkıştırma görselleştirmek açıklar. Zaman uyumlu ekimi, floresans mikroskobu, Hızlı dondurma ve yüksek tarafından izleme gerilim cryo-elektron tomografi kullanılır. Bu metodolojileri için bir protokol sundu ve gelecekteki uygulamalar ve gelişmeler ele alınmıştır.

Siyanobakteriler yüksek gerilim Cryo-elektron tomografi tarafından DNA sıkıştırma görselleştirme

Kriyo-elektron tomografisi ile in situ makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmaları için kriyo odaklı iyon ışını mikromakine ile dalma donmuş biyolojik örneklerin lamel hazırlanması için bir protokol sunuyoruz. Sunulan protokol, Saccharomyces cerevisiaeiçindeki makromoleküllerin yapısal karakterizasyonu için yüksek tekrarlanabilirlik ile yüksek kaliteli lamel hazırlanması için yönergeler sağlar.

Kriyo-Elektron Tomografisi için Saccharomyces cerevisiae'nin Hazırlanması ve Kriyo-FIB mikromakinesi

Bu protokolün amacı, hücre yapıştırma ve büyümesini kriyo-elektron mikroskopisi için hedeflenen ızgara alanlarına yönlendirmektir. Bu, kullanıcı tarafından belirtilen desenlerde ablated bir anti-kirlenme tabakasının uygulanması ve ardından hücre tohumlamadan önce desenli alanlarda hücre dışı matris proteinlerinin birikmesi ile elde edilir.

Tüm Hücreli Kriyo-Elektron Tomografi İş Akışlarında Doğrudan Hücre Konumlandırmasına Mikropatterning İletim Elektron Mikroskopi Izgaraları

Mevcut protokol, Tomo5 kullanılarak yüksek çözünürlüklü kriyo-elektron tomografisi uzaktan veri toplama ve emClarity kullanılarak sonraki veri işleme ve subtomogram ortalamasını açıklamaktadır. Apoferritin, 2.86 şçözünürlükte bir kriyo-ET yapısı elde etmek için ayrıntılı adım adım süreçleri göstermek için bir örnek olarak kullanılır.

Kriyo-elektron Tomografisi Uzaktan Veri Toplama ve Subtomogram Ortalaması

Kriyo-STEM tomografisi, bozulmamış hücrelerin organellerini gömme, kesitleme veya diğer invaziv preparatlar olmadan görselleştirmek için bir araç sağlar. Elde edilen 3D çözünürlük şu anda birkaç nanometre aralığında, birkaç mikrometrelik bir görüş alanı ve 1 μm mertebesinde erişilebilir bir kalınlık ile.

Kriyo-STEM Tomografi ile Organellerin In Situ Görüntülenmesi

Kriyo-elektron tomografisi (kriyo-ET), hücresel üst yapının nanometre çözünürlükte 3D görselleştirilmesini sağlar, ancak manuel segmentasyon zaman alıcı ve karmaşık olmaya devam etmektedir. Kriyo-ET tomogramlarını segmentlere ayırmak için gelişmiş sanal gerçeklik yazılımını entegre eden ve memeli hücrelerinde mitokondrinin segmentasyonu yoluyla etkinliğini gösteren yeni bir iş akışı sunuyoruz.

Kriyo-elektron tomografi verilerinin sürükleyici segmentasyonu ve analizi için sanal gerçeklikten yararlanma

Öğrenin, cryo soft X-ray tomografi ile dondurulmuş hücrelerin boyanmadan ve kesilmeden üç boyutlu görüntülenmesini. Bu yöntem, organelleri ayırt ederek biyomedikal araştırmalarda yüksek çözünürlüklü veri sağlar.

Cryo Soft X-ray Tomografisi ile Hücrenin 3D Kartografik Açıklaması

Daha fazla video keşfet