Kalsiyum Florofor Etiketleme ve Nanopartikül Takip Analizi Kullanılarak İnsanlarda Üriner Nanokristallerin Tahmini

Bu protokol özellikle insan idrarında kalsiyum içeren nanokristalleri tespit edebilir. Bu teknik, böbrek taşı oluşumunun erken aşamalarını ve kristal üre ile ilişkili diğer hastalıkları tahmin etmek için potansiyel olarak yararlı olabilir. Prosedürü gösteren dr. Parveen Kumar olacak, laboratuvarımda araştırmacı IV.

Katılımcıların üç gün boyunca düşük oksalatlı bir diyet tüketmelerini ve gece boyunca oruç tutmalarını sağla. Daha sonra katılımcılardan oksalat yükü tüketmeden önce 24 saatlik bir idrar örneği toplayın. Katılımcıları yaklaşık sekiz milimol oksalat yüküne sahip meyve ve sebze içeren bir smoothie ile besleyin.

Katılımcıların idrarlarını 24 saat oksalat sonrası tüketim için toplamalarını ve ertesi gün iade etmelerini sağla. İşlemeden önce tüm idrar örneklerini oda sıcaklığında muhafaza edin. İdrar pH'ını ve idrar örneklerinin hacmini ölçün ve kaydedin.

İyice karıştırın ve etiketli steril 50 mililitre konik tüpe 50 mililitre idrar ekleyin. Numuneyi 1.200 kez G'de oda sıcaklığında 10 dakika boyunca tezgah üstü santrifüj kullanarak santrifüjleyin. Süpernatantı atın, sonra peletin beş mililitre% 100 etanol ile tekrar yıkayın ve yeniden ıslatın.

Numuneyi 1.200 kez G'de oda sıcaklığında 10 dakika boyunca tezgah üstü santrifüj kullanarak santrifüjleyin. Süpernatant atın ve peletin%100 etanol mililitresinde yeniden dirildi. Numuneyi daha sonra işlemek için eksi 20 santigrat derecede saklayın veya örnekleri lekeleme işlemine hemen devam edin.

Ultra saf suda 100 nanometre büyüklüğündeki altın nanopartikülleri 1:1.000 oranında seyreltin ve cihazdaki ayarları optimize etmek için kullanın. İdrar örneklerini karanlıkta 30 dakika boyunca beş milimoler Fluo-4 AM ile boyamadan önce suda 20 kez seyreltin ve örnekleri NTA kullanarak analiz edin. NTA analizi öncesinde metin elyazmasında açıklandığı gibi kalsiyum oksalat ve kalsiyum fosfat kristalleri hazırlayın.

Bilgisayarı ve cihazı açın, sonra yazılımı açın ve kamerayı açın. Yakalama modunu başlatmak için pencerenin sol üst köşesindeki yakalama simgesini tıklatın. Platform temiz görünene kadar önce bir mililitre şırınç kullanarak içine hava pompalayarak platformu temizleyin.

Cihaza iki ila üç kez yavaşça su ekleyin ve hava kabarcıklarını çıkarmak için bir mililitre şırınna daha kullanın. Platform temizlendikten sonra, su ekleyin ve kamerayı görüntüleyerek yüzeydeki herhangi bir kirlenme olup olmadığını kontrol edin, ardından cihazı kurmak için numune yükleme pompası enjektörüne kontrol olarak altın nanopartiküller ekleyin. Görüntü renkli pikselleri görüntülemeye başlayana kadar ekrandaki veya düğmedeki kamera düzeyini cihazın sağ tarafındaki şekilde ayarlayın, ardından kamera düzeyini azaltın.

Ardından, görüntüyü optimize etmek için ekranı ayarlayın. Video görüntüsündeki fare düğmesini sol tıklatın. Sol fare düğmesini basılı tutun ve tüm görünümü elde etmek için görüntüyü yukarı ve aşağı sürükleyin.

İnfüzyon hızını ayarlayın ve altın nanopartiküllerin kamera ekranında görünmesi için kamerayı odakla. Altın nanopartiküllerin algılanmasını sağlamak için ilk kurulum için infüzyon hızını yüksek olarak ayarlayın. Tespit edildikten sonra, altın nanopartikülleri görselleştirmek için hızı dakikada 50 mikrolitreye düşürün.

Parçacıkları görselleştirmek için kamera seviyesini ayarlayın. Ulaşılmamış numuneler için, kamera odağına ulaşmak için ekran kazancını beşinci seviyede ayarlayın ve kamera seviyesini sekize ayarlayın. Odak ayarlandıktan sonra örneği kaydedin.

Optimizasyondan sonra, borunun temiz olduğundan ve parçacıkların bulunmadığından emin olmak için diğer numuneleri değerlendirmeden önce cihazı tekrar suyla temizleyin. Lekeli numuneleri analiz etmek için, kamerayı uygun floresan filtreyi içeren filtre konumuna ayarlayın ve seyreltilmiş ve lekeli numuneleri numune yükleme pompası enjektörüne yükleyin ve analiz için hızı dakikada 20 mikrolitreye düşürün. Ekran kazancını beşe ve kamera seviyesini 13'e ayarlayın.

Her ölçümden sonra verileri kaydedin. Her bir örnek için beş okumanın tümü için ortalama nanopartikül sayısını hesaplayın ve standart sapma veya ortalamanın standart hatasını kullanarak verileri analiz edin. Eşleştirilmiş analiz için T testlerini kullanın.

Fluo-4, hem 50 ila 270 nanometre büyüklüğündeki kalsiyum oksalat kristallerine hem de mililitre başına ortalama 1.260 milyon partikül konsantrasyonuna sahip olan ve 30 ila 225 nanometre arasında olan ve mililitre başına ortalama 2.220 milyon parçacık konsantrasyonuna sahip kalsiyum fosfat kristallerine bağlanabildi. Oksalat yükünden önce toplanan 24 saatlik idrar örnekleri, 110 ila 300 nanometre arasında bazı idrar nanokristalleri içeriyordu. Buna karşılık, post-oksalat örneklerinde üriner nanokristallerde önemli bir artış oldu.

Yöntemin tekrarlanabilirliğini doğrulamak için, örnekler üç kez ölçüldü ve teknik kopyalarda önemli bir değişiklik olmadı. Bu protokolü denerken, makineye kabarcıksız örnekler eklemekle ilgili bazı zorluklar olabilir. Bunu önlemek için makineye hava ve su ekleyin ve ardından yavaşça numune ekleyin.

Ayrıca, numunelerinizi sürekli olarak izlediğinizden ve kabarcık bulunmadığından emin olun. Bu yeni yöntem, hastalığın ilerlemesini izlemek ve/veya böbrek taşı riskini tahmin etmek için kalsiyum oksalat böbrek taşı hastalığı olan bireylerde test edilecektir.