Endojen Olarak İfade Edilen İnsan RYR1 Varyantlarının İşlevsel Karakterizasyonu

Bu protokol hasta materyali kullandığı için önemlidir. Hastada hastalık varsa, hücrelerini kullanmak hastanın biyolojik yanıtını daha doğru yansıtmalıdır. Bu tekniğin gerçekleştirilmesi kolaydır, basittir ve sofistike ekipman gerektirmez.

Bu yöntemler tanı için, örneğin, bir RYR1 mutasyonunun kalsiyum homeostazını işlevsel olarak değiştirdiğini kanıtlamak ve bir bileşiğin potansiyel terapötik işlevini test etmek için kullanılabilir. Bireysel araştırmacının bilgi ve teknik becerilerine bağlı olarak, gerçek hasta örnekleri kullanılmadan önce test deneyleri yapılmalıdır. EBV'ye dönüştürülmüş B lenfositlerin hücre içi kalsiyum konsantrasyonundaki değişiklikleri izlemek için, ölümsüzleştirilmiş B hücrelerini Krebs Ringer çözeltisinde mililitre konsantrasyonu başına bir kez 10 ila yedinci hücrelere ve Fura-2 AM'yi 37 santigrat derecede 30 dakikalık bir inkübasyon için beş mikromolar son konsantrasyona yeniden biriktirin.

Kuluçkanın sonunda, hücreleri santrifüjleme ile toplayın ve peletin taze Krebs Ringer çözeltisine mililitre konsantrasyonu başına iki kez 10'dan altıncı hücrelere yeniden harcayın. Deneye başlamadan hemen önce, hücreleri tekrar santrifüj edin ve hücreleri krebs Ringer'ın 0,5 milimolar EGTA ile desteklenmiş ancak ilave kalsiyum olmadan 1,5 mililitrelik çözeltisinde hızla yeniden biriktirin. Hücreleri bir cam, üç mililitre spektrofluorometre cuvette aktarın ve floresan oranını maksimum hızda ve yaklaşık 30 saniye boyunca 37 santigrat derece ayarlı manyetik karıştırıcı ile donatılmış bir spektroflorometreye kaydedin.

Tek hücrelerdeki kalsiyum salınım tepkisini değerlendirmek için, Krebs Ringer'ın çözeltisinin bir mililitresinde tek milimoler kalsiyum klorürle desteklenmiş bir mililitredeki bir kez 106 Fura-2 yüklü hücreleri tek tek poli-L-lizin kaplı cam kapak kaymalarına plakalayın ve kapak kaymalarını 37 santigrat derecede nemli bir hücre kültürü inkübatöründe 30 dakika boyunca kuluçkaya bırakın. Hücreler bağlandığında, bir perfüzyon odasına bir kapak kayması yerleştirin ve hücreleri krebs Ringer çözeltisinin dakikada bir milimoler kalsiyumla desteklenmiş iki mililitresinde perfüzyona başlayın. 40 kat yağ daldırma hedefi ve uygun filtrelerle donatılmış ters floresan mikroskop kullanarak, yazılım kontrollü, şarj bağlantılı bir cihaz kamera ataşmanı ile çevrimiçi ölçümleri sabit pozlama zamanında bir saniyelik aralıklarla kaydedin.

Hücre stimülasyonu elde etmek için, farklı agonist konsantrasyonlarını eklemek için 12 valfli bir hücre perfüzyon stimülatörü kullanın. Miyotüpleri insan kas biyopsilerinden izole etmek için, önce dokuyu küçük, 0,5 ila bir milimetrelik parçalara ayırmadan önce fazla kanı çıkarmak için biyopsiyi steril PBS ile durulayın. Kuyu başına 1,5 mililitre insan kası büyüme ortamı ve kesici uç başına 500 mikrolitre orta içeren altı kuyulu bir doku kültürü plakasının her kuyusuna iki ila üç parça yerleştirin ve plakayı hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.

İnsan miyotütlerindeki kalsiyum ifadesindeki değişiklikleri ölçmek için, çok renkli miyotüpler gözlemlenebildiğinde, miyotube kültürü süpernatantlarını hücre kültürü inkübatöründe 30 dakikalık bir inkübasyon için 10 milimoler Fura-2 mikrolitresi ile desteklenmiş taze farklılaşma ortamı ile değiştirin. Kuluçkanın sonunda, bir cam kapak kayma kültürünü perfüzyon odasına aktarın ve hücreleri krebs Ringer'ın iki milimoler kalsiyum klorürle desteklenmiş çözeltisiyle durulayın. Ardından, 20 kat suya daldırma hedefi kullanarak gösterildiği gibi çevrimiçi kalsiyum ölçümleri yapın.

Bu temsili analizde, EBV ölümsüzleştirilmiş B lenfositlerinde, zaman içinde yavaşça dinlenme seviyelerine gerileyen agonistin eklenmesinden sonra kalsiyumda hızlı bir artış gözlenmiştir. Benzer bir deneyde, 400 nanomolar thapsigargin ilavesi, 2.4 keyfi birimlik bir zirve floresan değerine ulaşan büyük bir kalsiyum geçicisine neden oldu. İlgili doz yanıt eğrisi inşa edildiğinde bu floresan değeri %100 olarak kabul edildi.

Bu analizde ölümsüzleştirilmiş B hücreleri 20 saniye boyunca beş milimoler kafein ile uyarılarak 340 ve 380 nanometre floresan oranında anında artış sağlanmıştır. Test edilen her kafein konsantrasyonu için, 340 ila 380 nanometre floresan oranında kafein kaynaklı tepe hesaplandı ve bir doz yanıt eğrisi oluşturmak için kullanıldı. Farklılaştırılmış miyotüplerden kalsiyum salınımı, potasyum klorür, farklı agonist konsantrasyonları ve / veya kafein ile yıkamaya yanıt olarak da değerlendirilebilir ve normal doz yanıt eğrileri oluşturulabilir.

Hücrelerin Fura-2 ile düzgün bir şekilde yüklendiğinden ve hem 340 hem de 380 nanometre dalga boylarının agonistin eklenmesine yanıt verdiğinden emin olmak önemlidir. Floresan kalsiyum göstergeleri ile hücre içi kalsiyum ölçümleri çoğu memeli hücresinde araştırılabilir ve farklı uyaranlara yanıt olarak hücre içi kalsiyum değişikliklerinin incelenmesine uygulanabilir.