TGF-β aracılı Endotelden Mezenkimal Geçişe (EndMT) ve CRISPR/Cas9 Gen Düzenleme Kullanarak EndMT Efektörlerinin Fonksiyonel Değerlendirmesi

Endotelden mezenkimal geçişe, endotel hücrelerinin parke taşı morfolojisini fibroblast benzeri bir fenotipe dönüştürdükleri hücresel bir süreçtir. Ve sitokin TGF-beta, büyüme faktörü betayı dönüştüren, bu geçişin ana itici gücüdür. Hücre morfolojislerindeki değişikliklerin analizi ve endotel ve mezenkimal belirteçlerin ekspresyon düzeyleri, endotelden mezenkimal geçişe oluşumunu değerlendirmemizi sağlar.

Ortaya çıkan veriler endotel ile mezenkimal geçiş sürecini kanser, kardiyovasküler hastalık ve fibrozis gibi çeşitli hastalıklara bağlar. Ve veriler müdahalenin terapötik fayda sağlayabileceğini gösteriyor. Embriyogenez ve organ gelişimi sırasında ortaya çıkan mezenkimal geçiş sürecine endotel uyararak, kıkırdak, kemik ve kas gibi mezenkimal türevli dokuları yenileyebiliriz.

Hücre içi proteini immünfloürsans lekelenmesi ile tespit etmek için, antikorların hücre zarlarından geçmesi için % 0.1 Triton X-100 kullanarak hücre permeabilizasyonu gereklidir. Bu video gösterimi ile araştırmacılar, TGF-beta gibi sitokinlerin mezenkimal geçişe endoteldeki rolünü nasıl araştıracaklarını iyi kavrayacaklar. İlk olarak, DMEM'deki pankreas adacığı endotel MS1 hücrelerini yansıtan tohum 1 x 10^5, %10 FBS ve mililitre başına 100 birim penisilin ve streptomisin ile desteklenmiştir.

Hücre kültürü inkübatörde gece kuluçkadan sonra, hücreleri PBS ile yıkayın ve 37 santigrat derecede iki dakika boyunca iki mililitre% 0.25 tripsin, % 0.02 EDTA çözeltisi ile tedavi edin. Hücreler kopmaya başladığında, reaksiyonu beş mililitrelik tam kültür ortamı ile söndür ve elde eden hücre süspansiyonunu santrifüjleme için 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Peletin dört mililitre taze tam orta dereceli saymak için yeniden dirildi.

Ve tohum 1 X 10^3 hücre santimetreküp başına yeni bir hücre kültür kabına. Gece kültüründen sonra, beş mikromoler TGF-beta reseptör kinaz inhibitörü SB-431542 ve DMSO çözücü kontrolü ile iki kuyu ile iki kuyu tedavi edin. Ve hücreleri 30 dakika boyunca hücre kültürü inkübatöre yerleştirin.

Kuluçkanın sonunda, araç kontrolü ile iki kuyuyu ve TGF-beta 2 ile iki kuyuyu tedavi edin. Üç gün sonra, brightfield görüntüleme altında her hücre tedavi grubunun hücre morfolojisini incelemek için ters bir mikroskop kullanın. endMT ile ilgili belirteç değişikliklerini immünofluoresan boyama ile değerlendirmek için, hücreleri gösterildiği gibi uygun bir MS1 hücre kültüründen ayırın.

Ve hücreleri 1.9 X 10^3 hücre konsantrasyonunda% 0.1 jelatin kaplı 12 milimetre yuvarlak kapak gözlüklerine tohumlayın. Gece kültüründen sonra, hücreleri üç gün boyunca bir nanogram TGF-beta 2 mililitresi ile tedavi edin. Kuluçkanın sonunda, hücreleri PBS ile yıkayın ve tedavi edilen kültürleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca kuyu başına% 4 formaldehit 300 mikrolitre ile sabitleyin.

Fiksasyonun sonunda, hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca kuyu başına%0,1 Triton X-100 ve PBS'lik 300 mikrolitre ile geçirgenleştirmeden önce PBS ile üç kez yıkayın. Kuluçkanın sonunda, hücreleri PBS'de üç kez yıkayın ve PBS'de%3 BSA olan hücreleri engelleyin. Oda sıcaklığında 45 dakika sonra, hücreleri birincil PECAM-1 ve SM22-alfa antikorları ile oda sıcaklığında 45 dakika etiketleyin, ardından PBS'de üç yıkama yapın.

Son yıkamadan sonra, hücreleri oda sıcaklığında 45 dakika boyunca uygun ikincil antikorlarla kuluçkaya yatırın ve hücreleri DAPI takviyeli bir montaj ortamı ve bir kapak kayması ile monte etmeden önce PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra kapak kaymasının kenarlarını berrak oje ile kapatın ve standart görüntüleme protokollerine göre uygun filtreleri kullanarak floresan konfokal mikroskopi ile hücre işaretleyici ekspresyonunun görüntüsünü elde edin. TGF-beta 2 ile üç günlük tedaviden sonra endotel MS1 hücreleri parke taşı benzeri yapılarını kaybeder ve iğ şeklindeki mezenkimal hücrelere dönüşür.

Bu TGF-beta 2 indüklenen farklılaşma, hücreler TGF-beta reseptör kinaz inhibitörü SB-431542'ye maruz kaldığında bastırılır. Endotel proteini PECAM-1'in ekspresyonu TGF-beta 2 stimülasyonundan sonra sağlam bir şekilde azalırken mezenkimal faktör SM-22 alfa derinden yukarı yönlüdür. Buna ek olarak, Salyangoz, Sümüklüböcek ifadesi etkilenmezken TGF-beta 2 maruziyeti ile belirgin bir şekilde yukarı yönlüdür.

Gözlemlendiği gibi CRISPR-Cas9 gen düzenleme, salyangoz ekspresyonunu bozmak için Cas9 ifadeli MS1 hücrelerine iki bağımsız Salyangoz tek kılavuz RNA'sının girişini kolaylaştırmak için kullanılabilir. Salyangozun nakavtı, MS1 hücrelerinde TGF-beta 2 tarafından yönlendirilen fibroblast benzeri hücre morfolojisini inhibe etmek ve TGF-beta 2 aracılı PECAM-1 düşüşünü ve SM-22 alfa geliştirmesini engellemek için yeterlidir. Hücre morfolojislerindeki değişikliklerin değerlendirilmesi ve endotel ve mezenkimal belirteçlerin immünofluoresans ile ekspresyonu, batı blot analizinde nicel PCR üzerinde bu belirteçlerin ekspresyonu ölçülerek daha da doğrulanabilir.

Endotelden mezenkimal geçişe geçişi tespit etmek için kullanılan bu teknik, araştırmacıların birden fazla hastalıkta ortaya çıkan fizyolojik bir süreç olarak ortaya çıkan bu önemi araştırmalarını sağladı.