Diamond Light Source'da Sabit Hedef Seri Veri Toplama
26 Şubat 2021
Diamond beamline I24'te seri senkrotron kristalografisi için sabit hedef numune hazırlama, veri toplama ve veri işleme için kapsamlı bir kılavuz sunuyoruz.
Seri senkrotron kristalografisi veya SSX, MX'in nispeten yeni ve hızla gelişen bir alanıdır.Düşük doz ve oda sıcaklığı deneyleri için çok uygundur, ancak belki de en önemlisi, dinamikleri takip etmek için gerçekten uygundur. Bu, hareket halindeki proteinlerin stop-motion filmlerinin yapılmasını sağlar. I24'te birden fazla SSX modu mevcuttur.
Bu protokol, sınırlı miktarda örnek kullanarak çok çeşitli seri denemelere izin veren sabit hedefli SSX'e odaklanır. Silikon çipler, onları tanınamıyorsanız, yüklerken ve temizlerken zarar verebilir. Ayrıca, yonga hizalama protokolü birçok kristalografici için tamamen yenidir ve veri işleme standart döndürme verilerinizden biraz farklıdır.
Bir talaş tutucu hazırlamak için, iki yaprak polyester folyoyu yaklaşık 6'ya 6 santimetre kareler halinde kesin ve levhaları iki taban plakasının üzerine yerleştirin. Metal sızdırmazlık halkaları kullanarak, levhaları yerine sabitleyin, ardından kırışıklıkları gidermek için fazla folyoyu dikkatlice çekin. Ardından, analiz edilecek kristallerin boyutuna göre uygun boyutta diyaframlara sahip bir silikon çip seçin.
Işıma çipi 0.39 milibarda 25 saniye deşarj, 15 miliamper akım ile. Silikon çipi, yükseltilmiş çubuklar aşağı bakacak şekilde talaş yükleme aşamasına yerleştirmek için cımbız kullanın. Daha sonra, bir pipet kullanarak, çipin düz tarafına 200 mikrokristal bulamacı uygulayın ve bulamacı çipin tüm şehir bloklarını kapsayacak şekilde yayın.
Talaş hasar görürse, eşit bir vakum uygulanabilmesini sağlamak için herhangi bir deliği küçük bir polyester folyo parçasıyla kapatın. Daha sonra talaştan tüm fazla sıvıyı epire etmek için hafif bir vakum uygulayın. Çipi talaş yükleme aşamasından çıkarın ve fazla sıvıyı çıkarmak için çipin alt kısmını filtre kağıdı ile dikkatlice lekeleyin.
Yüklü çipi kılavuz işaretleri arasında talaş tutucusunun daha büyük yarısına yerleştirin, düz tarafı aşağı. Çip tutucunun küçük yarısını mühürlemek için çipin üzerine yerleştirin. Talaş tutucunun iki yarısı yerine yapışmalıdır.
Ardından, altıgen cıvatalar kullanarak çipi güvenli bir şekilde yerine sabitleyin. Çipi hizalamak için, montaja yaklaşırken talaş tutucuyu 30 derecelik bir açıyla tutun. Ardından, yüklü çipi kiriş hattındaki XYZ aşamasına yerleştirmek için kinematik montajları kullanın.
Mıknatıslar temas ettiğinde, talaş tutucunun akışa paralel dönmesine izin verin ve yerine tıklayın. Çip yerleştirildikten sonra, çipin sol üst fidücialini bulmak için eksendeki beamline görüntüleme sistemini ve yonga hizalama grafik kullanıcı arayüzünü kullanın. X, Y ve Z'deki fiducial 0'ı ortalamak için, Z'yi hizalamak için yukarı ve aşağı, X'i hizalamak için sola ve sağa hareket edin.Ardından Fiducial 0'ı ayarla"Fiducial 1 ve 2'yi X-ışını ışını ışını ile aynı şekilde hizaladıktan sonra, bir koordinat matrisi oluşturmak için "Eşgüdüm sistemi oluştur"u tıklatın.
Ardından, XYZ aşamasını her şehir bloğunun ilk kuyusuna taşımak için Blok Denetimi"ne tıklayın. X-ışını çapraz çizgisi diyaframlarla hizalanırsa, çip hizalanır. DIALS'tan gelen nokta bulma sonuçlarının bu grafiksel gösteriminde, güncellenen bir isabet hızı grafiği gözlemlenebilir.
Bir isabet tıklatılırsa, karşılık gelen kırınım görüntüsü DIALS görüntü görüntüleyicisinde görüntülenir. Bu tabloda, ziyaret sırasında veriler toplandıkça gerçek zamanlı olarak güncellenen geçerli dizin oluşturma ve tümleştirme oranları görselleştirilebilir. Birim hücre parametrelerinin görselleştirilmesi polimorfları ortaya çıkardı.
Yükleme veya dehidrasyon etkileri nedeniyle ortaya çıkan varyasyonları ortaya çıkarmak için yararlı parametrelerin iki boyutlu çizimleri de üretilebilir. Stereografik projeksiyonlar, yükleme protokolüne geri beslenebilecek tercih edilen yönelimlerin varlığını veya yokluğunu ortaya koyabilir. Örneğin, bu projeksiyonda, bir çipin lysozyme kristalleri ile aşırı yüklenmesinin etkileri gözlenebilir.
Çipi yüklerken pipeti yavaşça kullanın ve pipeti çipin üzerinde dinlendirmek için parmağınızı kullanın. Bu, çipe dokunmanızı ve silikondaki delikleri yanlışlıkla bıçaklamanızı önler. Verileri işlerken, kullanılabilir otomatik işlem hatlarından yararlanın.
Bu, denemenizin nasıl ilerlediklerine ve bir şeyi değiştirmeniz gerekip gerek olmadığına dair iyi bir fikir verecektir. Bu yöntem önemli miktarlarda kristalize edilebilen herhangi bir protein sistemine uygulanabilir. Ve reaksiyon ışık X ışınları veya hızlı karıştırma ile tetiklenebilir.
Bir dizi yapı üzerinde yapılan dinamik çalışmalar, proteinlerin nasıl çalıştığına dair fikir verebilir.
Genel Bakış
Bu makale, Diamond I24 demet hattında seri sinkrotron kristalografisi için sabit hedefli numune hazırlama, veri toplama ve veri işleme süreçlerine yönelik kapsamlı bir kılavuz sunmaktadır. Çip bütünlüğünü korurken, sınırlı numune miktarlarıyla deneylerin yürütülmesine yönelik metodolojiye vurgu yapmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Yapısal Biyoloji
- Kristalografi
- Protein Dinamiği
Arka Plan
- Seri sinkrotron kristalografisi (SSX), makromoleküler kristalografide gelişmekte olan bir alandır.
- Düşük dozlu ve oda sıcaklığındaki deneyler için uygundur.
- SSX, proteinlerin dinamik çalışmalarına olanak tanıyarak işlevlerinin görselleştirilmesini sağlar.
- Sabit hedefli SSX, sınırlı örnek miktarlarını etkili bir şekilde kullanabilir.
Çalışmanın Amacı
- Diamond ışın hattı I24'te sabit hedefli SSX için ayrıntılı bir protokol sağlamak.
- Optimal veri toplama için uygun çip hazırlama ve hizalamayı gerçekleştirmek.
- Standart rotasyon verilerine kıyasla veri işlemedeki farkları vurgulamak.
Kullanılan Yöntemler
- Polyester folyo ve sızdırmazlık teknikleri kullanılarak silikon çiplerin hazırlanması.
- Mikrokristal süspansiyonun çiplere uygulanması ve vakum aspirasyonu.
- Hüzme hattındaki bir grafik kullanıcı arayüzü kullanılarak çip hizalaması.
- Otomatik boru hatları kullanılarak gerçek zamanlı veri görselleştirme ve işleme.
Ana Sonuçlar
- Çiplerin başarılı şekilde hizalanması, doğru veri toplanmasını sağlar.
- Deneyler sırasında indeksleme ve entegrasyon oranlarının gerçek zamanlı izlenmesi.
- Birim hücre parametrelerinin görselleştirilmesi, polimorf ve yükleme etkilerini ortaya çıkarır.
- Dinamik çalışmalar, protein fonksiyonelliğine dair bilgiler sağlar.
Sonuçlar
- Bu protokol, sabit hedefli SSX deneylerinin verimliliğini artırır.
- Başarılı veri toplama için çipin doğru şekilde taşınması ve hizalanması kritik öneme sahiptir.
- SSX kullanılarak yapılan dinamik çalışmalar, protein davranışına ilişkin anlayışımızı önemli ölçüde geliştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Sabit hedefli seri sinkrotron kristalografisi, yapısal biyologların sınırlı örnek miktarları kullanarak proteinlerin dinamik çalışmalarını yürütmesine olanak tanır ve yüksek çözünürlüklü yapısal içgörüler aracılığıyla hedef doğrulamasını destekler. Bu yöntem, veri kalitesini korurken örnek tüketimini azaltır; bu durum, protein ekspresyonu ve saflaştırmanın darboğaz oluşturduğu erken evre keşif süreçleri için kritik öneme sahiptir. Oda sıcaklığında ve zamana bağlı deneyleri kolaylaştırarak, protein fonksiyonunun mekanistik olarak anlaşılmasını geliştirir, böylece preklinik geliştirmedeki öncü bileşik optimizasyonu ve risk azaltma çalışmalarına bilgi sağlar.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Protein konformasyonlarını etkileşim halindeyken yakalayarak terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır ve fonksiyonel hedef doğrulamasını destekler.
- Operasyonel Değer: Büyük kristal hacimlerine olan bağımlılığı azaltarak, sınırlı ekspresyon verimine sahip zorlu hedeflerin taranmasına imkan sağlar.
- Öngörü Güveni: Bağlanma bölgesi karakterizasyonu ve etki mekanizması hakkında bilgi veren yapısal veriler sağlayarak hedef seçim kararlarını iyileştirir.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Mikrokristallerden kantitatif elektron yoğunluğu haritaları oluşturarak hassas ligand bağlanma değerlendirmelerine olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Çip tabanlı sistemler aracılığıyla numune montajını ve hizalamasını standartlaştırarak tarama kampanyaları boyunca tekrarlanabilirliği artırır.
- Analiz Hazırlığı: Fragment veya bileşik taraması sırasında karar verme süreçlerini destekleyen gerçek zamanlı isabet oranı ve indeksleme metrikleri üretir.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: İlaç bağlanmasını veya stabilitesini etkileyebilecek polimorfik formları ve konformasyonel değişiklikleri ortaya çıkararak formülasyon stratejilerine bilgi sağlar.
- Operasyonel Değer: Fonksiyonel analizlerle ilişkilendirilebilen zaman çözünürlüklü yapısal verileri yakalayarak translasyonel biyobelirteç uyumunu güçlendirir.
- Risk Azaltma: Yüklemeye bağlı artefaktları veya dehidrasyon etkilerini erkenden tanımlayarak, sonraki optimizasyon aşamalarında yanlış yorumlama riskini azaltır.
İş Akışı ve Pipeline Entegrasyonu
Sabit hedefli SSX, hedef tanımlama ve analiz geliştirme aşamalarının ardından keşif iş akışına entegre edilerek, öncü bileşik tanımlama ve preklinik doğrulamaya rehberlik eden yapısal içgörüler sağlar. Bileşik bağlanması ve protein dinamiği hakkında hızlı yapısal geri bildirimler sunarak yinelemeli tasarım-üretim-test-analiz döngülerini destekler.
- Keşif Biyolojisi: Etki mekanizmasıyla ilgili ligand kaynaklı konformasyonel değişiklikleri ve protein dinamiklerini görselleştirerek hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Standartlaştırılmış çip hazırlama ve hizalama yoluyla analiz hazırlığına imkan tanıyarak, bileşik taramaları boyunca tutarlı veri kalitesi sağlar.
- Analitik: Birim hücre parametreleri, isabet oranları ve entegrasyon metrikleri dahil olmak üzere, deneysel koşulların objektif karşılaştırılmasına olanak tanıyan kantitatif çıktılar sunar.
- Translasyonel Araştırma: Biyoyararlanımı veya hedef etkileşimini etkileyebilecek dinamikleri ortaya çıkararak yapısal gözlemleri fonksiyonel sonuçlarla ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla hedef için yapısal tarama yapabilen yeniden kullanılabilir bir platform oluşturarak, çok projeli ortamlarda yeniden doğrulama çalışmalarını azaltır.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Fizyolojik koşullara yakın şartlarda yüksek çözünürlüklü ve zaman çözünürlüklü yapısal veriler sağlayarak hedef doğrulamadaki öngörü güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış çip kullanımı, hizalama protokolleri ve otomatik veri işleme hatları aracılığıyla tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: Örnek tüketimini minimize ederek ve yapısal optimizasyon kampanyalarında hızlı iterasyona olanak tanıyarak sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Hedef-ligand etkileşimlerindeki mekanistik belirsizliği azaltarak riskten arındırılmış ilerleme kararlarını destekler.
Uygulama Hususları
- Makromoleküler kristalografi konusunda uzmanlık ve sinkrotron tabanlı örnekleme tekniklerine aşinalık gerektirir.
- Kinematik montaj, eksen üzeri görüntüleme ve DIALS gibi otomatik veri hatlarına sahip ışın hattı altyapısına erişime bağlıdır.
- Veri tutarlılığını sağlamak için çip hazırlama, vakumlu aspirasyon ve hizalama prosedürlerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Farklı kristal boyutları ve uzay grupları için adaptasyon değerlendirmelerini içerir; bu durum diyafram seçiminin ve yayma tekniklerinin ayarlanmasını gerektirir.
- Yükleme ve temizleme sırasında çip kırılganlığı ve zamanla kristal kalitesini değiştirebilecek dehidrasyon etkilerine karşı hassasiyet gibi pratik sınırlamaları içerir.
