Name: Diamond Light Sourceda Sabit Hedef Seri Veri Toplama (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Keşfedin sabit hedef seri senkrotron kristalografisi yöntemini Diamond I24 hattında protein dinamiklerini incelemek için. Bu protokol sınırlı örnek miktarlarıyla yüksek kaliteli veri toplama ve gerçek zamanlı analiz imkanı sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Avrupa Komisyonu'nun Horizon 2020 programı tarafından finanse edilen iNEXT-Discovery (Grant 871037) tarafından desteklendi.

1. Bir çip hazırlama ve yükleme
NOT: İşlem, protein kristallerinin kurumasını önlemek için genellikle% 80 ila% 90 veya daha yüksek bağıl nem arasında nem kontrollü bir ortamda gerçekleşir (Şekil 1). Yüklendikten ve kapatıldıktan sonra, kristaller 24 saat boyunca hayatta kalabilir. Ancak, bu kristal sistemler arasında büyük ölçüde değişebilir. Oda içinde bir silikon çip tutmak için bir yükleme aşamasına bağlı düşük güçlü bir vakum pompası (Şekil 1), bir silikon çip, polyester folyolu bir talaş tutucu (Şekil 2), bir p200 pipet, 200 μL pipet uçları, cımbız, filtre kağıdı ve protein kristal bulamacı gereklidir.
<ol><li>Bir çip tutucu hazırlayın.<ol>
<li>İki yaprak polyester folyoyu yaklaşık 6 cm x 6 cm kareler halinde kesin.</li>
		<li>Polyester levhaları iki taban plakasının (irili ufaklı) üzerine koyun.</li>
		<li>Polyester levhaları metal sızdırmazlık halkalarını kullanarak yerinde sabitleyin.</li>
		<li>Örneklerin daha sonra görselleştirilmesini ve ortalmasını kolaylaştırmak için kırışıklıkları gidermek için fazla polyester folyoyu dikkatlice çekin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kristallerin boyutuna göre uygun boyutta diyaframlara (7-30 μm) sahip bir silikon çip seçin.</li>
	<li>Işıma, çipi 0,39 mBar'da 25 saniye boyunca boşaltır ve çip üzerinde mikro kristallerin kolayca yayılmasını sağlamak için 15 mA'lık bir akım kullanarak.</li>
	<li>Silikon çipi, yükseltilmiş çubuklar aşağı bakacak şekilde cımbız kullanarak talaş yükleme aşamasına yerleştirin.</li>
	<li>Bir pipet kullanarak çipin düz tarafına 200 μL mikro kristal bulamacı uygulayın.</li>
	<li>Çipin tüm "şehir bloklarını" kapsayacak şekilde kristal bulamacı yayın.</li>
	<li>Talaş hasar görmüşse, eşit bir vakum uygulanabilmesini sağlamak için küçük bir polyester folyo parçası veya filtre pipet ucu ile delikleri kapatın.</li>
	<li>Tüm fazla sıvı talaştan emilene kadar hafif bir vakum uygulayın.</li>
	<li>Çipi cımbızla talaş yükleme aşamasından çıkarın.</li>
	<li>Fazla sıvıyı çıkarmak için çipin alt tarafını filtre kağıdı ile dikkatlice lekeleyin.</li>
	<li>Yüklü çipi, kılavuz işaretleri arasındaki talaş tutucusunun daha büyük yarısına yerleştirin.</li>
	<li>Talaş tutucusunun küçük yarısını üzerine yerleştirerek çipi kapatın.<ol>
<li>Talaş tutucunun iki yarısı yerine yapışır. İkinci yarı floş oturmazsa, mıknatısları düzgün bir şekilde hizalamak için tutucuyu 180 ° döndürün.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Çipi güvenli bir şekilde yerine sabitlemek için talaş tutucuyu altıgen cıvatalarla kapatın. NOT: Alternatif olarak, "çipsiz" bir çip benzer bir şekilde yüklenebilir, talaş tutucusunda iki polyester folyo tabakası arasına sıkışmış daha küçük bir kristal bulamaç (~15μL) ile veya daha küçük bir hacim, daha önce açıklandığı gibi doğrudan polyester folyoya uygulanan 50 μm kalınlığında çift taraflı yapışkan ara parça kullanılarak yüklenebilir. . Yapışkan aralayıcıların kullanımı, her çipsiz çipe birden fazla numunenin (veya ligand ıslatma gibi numunelerin varyantlarının) yüklenmesini de sağlar. Silikon çipleri yüklemek için akustik damla çıkarma (ADE) kullanan tamamlayıcı bir yükleme yaklaşımı da Diamond39'dakullanılabilir. ADE, pipet yüklemesinden daha küçük hacimlerde kristal bulamacı kullanılarak çiplerin yüklenmesini sağlar. Bulamacın kimyasal bileşimi ve viskozitesi göz önünde bulundurulmalıdır, ancak numuneler az olduğunda özellikle yararlı bir tekniktir.</li>
</ol>2. GUI ve kiriş hattında kurulum
<ol><li>Basit bir EPICS Display Manager (edm) grafik kullanıcı arabirimi (GUI)(Şekil 3a)aracılığıyla veri toplama için tüm yonga hizalamasını ve kurulumunu gerçekleştirin. Bu, beamline enstrümantasyonu için bir işaretle ve tıkla arabirimi sağlar ve Python tabanlı veri toplama için giriş parametreleri sağlar. Alt pencereler, örnek tutucunun alt bölgelerinden(Şekil 3b)veya lazer/LED pompa prob deneylerinden(Şekil 3c)toplamak için ek kontrol sağlar.</li>
</ol>3. Çipin hizalaması
<ol><li>Yüklü çipi, kinematik montajları kullanarak XYZ aşamasına kiriş çizgisine (Şekil 4a'dagösterilmiştir) yerleştirin.<ol>
<li>Yolculuk yönleri boyunca aşamaları çekmekten kaçınmaya özen edin. Kinematik yuvalardaki mıknatıslar oldukça güçlüdür, bu nedenle bu kazayla oldukça kolay bir şekilde yapılabilir.</li>
		<li>Montaja yaklaşırken, talaş tutucu hafif bir açıyla (±30 °) tutulmalıdır. Mıknatıslar temas ettiğinde, talaş tutucunun zemine paralel dönmesine izin verin (0°) ve talaş tutucu yerine tıklayacaktır (Şekil 4b).</li>
		<li>Bir çipi boşaltırken ters bir yol izleyin. Çip tutucuyu çekmeden önce çipi döndürün ve aşamalardan uzaklaştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beamline'ın eksendeki görüntüleme sistemini ve talaş hizalama GUI'sini kullanarak çipin sol üst fidücial'ini bulun. Fiducials, birbirine dik açılarla iki küçük ve bir büyük olmak üzere üç karedir (Şekil 5a). Çip tekrar aydınlatıldı, böylece çip beyaz kareler olarak diyafram açıklığı ile karanlık görünecek.</li>
	<li>X, Y ve Z'de fiducial sıfır üzerine ortala (Şekil 5b). X ve Y'yi sırasıyla sola/sağa ve yukarı/aşağı hareket ettirerek hizalayın. Çipi odak içine ve dışına taşıyarak Z'yi hizalayın.</li>
	<li>Fiducial Zero 'yu Ayarla 'ya tıklayın.</li>
	<li>Tüm fiducials X-ray ışın ile hizalamak için fiducial bir (sağ üst, Şekil 5c)ve fiducial iki (sol alt, Şekil 5d) için adım 3.2'yitekrarlayın.</li>
	<li>Make co-ordinate system tuşunabasarak bir koordinat matrisi oluşturun, bu, talaşın uzaklığını, perdesini, rulosunu ve esnemesini, talaş koordinasyon çerçevesinde sonraki tüm hareketlerin yapılmasına izin olan aşamalara göre hesaplar.</li>
	<li>Çipin iyi hizalanmış olduğunu görsel olarak onaylamak için XYZ aşamasını her şehir bloğunun ilk kuyusuna taşımak için Denetimi Engelle'yi tıklatın.</li>
	<li>X-ışını çapraz çizgisi diyaframlarla hizalanırsa çip hizalanır. Değilse, 3.2-3.3 adımlarını yineleyin. NOTLAR: Hizalamada zorluk (kırık fiducials) durumunda, "hizalama tipi" açılır menüsü kullanılarak hizalama için çip üzerindeki farklı diyafram açıklıkları kullanılabilir. Sabit hedef veri toplama için birçok farklı yonga türü mevcuttur. 'Çip tipi' açılır menü kullanılarak farklı talaş tipleri barındırır. I24'te en yaygın kullanılan çip türleri 'Oxford' ve 'özel' yongalardır. Çipteki diyaframların ve fiduciallerin sayısı ve aralıkları, açılır menü aracılığıyla tanımlanan bir yonga sözlüğünden okunur. Özel çip, diyafram aralığının anında tanımlanmasını sağlar, bu da özellikle kristallerin tutucu37boyunca rastgele bulunduğu ince film sayfası veya diğer 'yongasız' tip yongalar için yararlıdır. Tıklamayla hareket etme işlevselliği ve otomatik yonga hizalaması sunan yeni bir Python GUI şu anda geliştiriliyor, ancak bu makalenin yazıldığı sırada rutin kullanıma henüz hazır değil.</li>
</ol>4. Veri toplamayı ayarlama
NOT: Veri toplama kurulumu çalışılan sisteme ve gerçekleştirilecek denemeye bağlı olacaktır. Bu, en basit SSX deneyinden, düşük doz yapısı toplamaktan, lazerler kullanarak zaman çözümlenmiş bir deneye veya farklı zaman gecikmelerinde birden fazla tam veri kümesi gerektirecek bir reaksiyon başlatmak için hızlı karıştırmaya kadar değişebilir. Veri toplamayı ayarlamak için aşağıdaki parametrelerin tanımlanması gerekir.
<ol><li>Deneysel değişkenler: Klasörü, dosya adını, pozlama süresini, iletimi, dedektör mesafesini ve diyafram başına çekim sayısını uygun şekilde doldurun.</li>
	<li>Yonga türü: Yukarıda açıklandığı gibi, yonga türünü kullanımdaki çiple eşleştirin.<ol>
<li>İnce bir film veya 'çipsiz' çip kullanılıyorsa, yonga türünü Yokolarak ayarlayın.</li>
		<li>GUI'de hem x hem de y'deki adım sayısını ve adım boyutunu tanımlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Harita türünü ayarlayın: bu, veri toplama için bir yonganın alt kategorilerinin seçilmesine izin verir (Şekil 3b). 'Yok', bir çip üzerindeki her diyaframdan veri toplandığı anlamına gelir. 'Lite', çipteki seçili şehir bloklarından veri toplandığı anlamına gelir (Şekil 3b). Bu, örneğin, bir yonganın bir bölgesinin kötü yüklenmiş veya boş olduğu biliniyorsa yararlı olabilir. 'Full', veri toplama için tek tek diyaframların seçilmesini sağlar. Bu durumda, doğru biçimlendirilmiş bir metin dosyası sağlanmalıdır. Beamline personelinden detaylar ve şablon alınabilir.</li>
	<li>Pompa probu: Pompa probu deneyinin türünü ve istenen zaman gecikmesini seçin. Pompanın tetiklemesi (genellikle bir LED veya lazer) genellikle belirli bir deneye özgüdür, bu nedenle burada ayrıntılı olarak açıklanmayacaktır.<ol>
<li>'Kısa' gecikmeler, pompa ile prob arasındaki her diyaframda bir boşluk olduğunda deneylere atıfta bulunur (örneğin, pompa, prob, 'bir sonraki örneğe geçin.) Gecikmeler genellikle 1 saniye veya onlarca milisaniyelik sıradadır.</li>
		<li>Long' gecikmeleri, açıklıkların iki kez ziyaret edildiği, ziyaretler arasında tanımlanmış bir zaman gecikmesi (örneğin, pompa, taşıma, pompa, taşıma, prob, taşıma, prob vb.) ile tekrar heyecanlanma ve ziyaret etme (EAVA) stratejisini ifade eder. Zaman gecikmesi hesaplanır ve X-ışını maruz kalma süreleri (Şekil 3c) ve genellikle ~1 saniye veya daha fazladır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Ortak veri toplama yöntemleri
NOT: Aşağıdakiler, yürütülen deneme türünü tanımlayan anahtar parametrelerdir. Bu bölümde, protokol 3 "Veri Toplamayı Ayarlama" daki diğer ayarların tanımlandığı varsayılmalıdır.
<ol><li>
Senaryo 1: Düşük doz veri toplama. Örnek tutucudaki seçilen her diyaframdan tek bir kırınım görüntüsünün toplanması.<ol>
<li>Diyafram başına çekim sayısını 1 olarak ayarlayın.</li>
		<li>Pompa prob'larını Yok olarak ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Senaryo 2: Örnek tutucudaki seçilen her diyaframdan ardışık olarak n görüntü toplayan bir doz serisi. Her n görüntü kümesi toplanırken çip her diyafram açıklığında sabittir.<ol>
<li>Diyafram başına çekim sayısını'n' olarak ayarlayın. n =5,10, 20 veya 10'un başka bir katıysa işlemenin basitleştirilmiş olduğunu unutmayın. n 5 < eğilimler oluşturmak zordur. Bir çipi kapsamak için gereken toplam süreyi ve n artırıldığında üretilen görüntü dosyalarının sayısını göz önünde bulundurmak yararlıdır.</li>
		<li>Pompa prob'larını Yok olarak ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Senaryo 3: Pompa prob yöntemleri<ol>
<li>Lazer Ekscitasyon Kontrol Merkezi'ni açmak için Pompa Probu açılır menüsünden bir yöntem seçin.</li>
		<li>Bir pompa probu deneyi için lazer boşluğunu her diyafram seçeneğinde doldurun.</li>
		<li>EAVA için her diyafram açıklığında ve X-ışını pozlamasında Lazer Boşluğu'nu doldurun ve Hesapla 'yıtıklatın.</li>
		<li>İstenilen gecikme süresi için edm GUI pompa probu açılır menüsünde uygun Tekrar seçeneğini belirleyin.</li>
		<li>Deney ön aydınlatma gerektiriyorsa Lazer 2 Dwell bölümünde doldurun.</li>
		<li>Tüm deneysel değişkenler tanımlandıktan sonra Set parametrelerine basın ve kısa liste oluşturun. Bu, deneysel değişkenleri geobrick denetleyicisine yükler. Bu yapıldıktan sonra Başlat tuşuna basıldığında dedektör içeri, arka ışık dışarı taşınır ve veri toplamayı başlatır. Veri toplamayı ayarlamanın tüm noktalarında, adımların her birinin durumu ve sonucu hakkında geri bildirimin yazdırıldığı bir terminal penceresinin açık olması yararlıdır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Veri işleme
NOT: Genel olarak konuşan veri işleme, geri bildirimin gerekli olduğu aciliyete bağlı olarak üç gruba ayrılabilir. Kristallerin mevcut olup olmadığını ve dağınık olup olmadığını ve varsa hangi sayılarda olduğunu göstermek için hızlı geri bildirim gereklidir. Bu, veri toplamayı takip etmelidir. Veri toplama ile karşılaştırılabilir zaman ölçeklerinde daha yavaş olabilen ancak yine de gerçekleştirilmesi gereken veri dizin oluşturma ve tümleştirme gerçekleştirme. Yansıma yoğunluklarının yapı çözümü için bir mtz dosyasında birleştirilmesi ve ölçeklendirilmesi ve elektron yoğunluk haritalarının üretilmesi son adımı temsil eder ve daha yavaş olabilir. Burada, I24'te ilk iki aşama için boru hatlarının başlatılması, denemenize rehberlik etmek için gerçek zamanlı geri bildirim için gerekli olduğu için tartışılacaktır, ancak isabet oranları ve ölçekleme istatistikleri gibi ölçümlerin elektron yoğunluğunu incelemek için bir alternatif olmadığını unutmayın, bu da bir ligand'ın bağlandığını veya bir reaksiyon meydana geldiğinin tek onayını sağlayabilir, crystallo içinde.
<ol><li>Hızlı geri bildirim<ol>
<li>Veri işleme modüllerini yüklemek için herhangi bir beamline iş istasyonunda terminale i24-ssx modülü yükleyin.</li>
		<li>Terminale i24-ssx /path/to/visit/directory/ isabet bulma çözümleme türünü çalıştırmak için: i24-ssx /dls/i24/data/2020/mx12345-6/ NOT: Bu, üç terminal penceresi açar ve veriler diske yazıldıktan sonra, Gelişmiş Işık Kaynakları için Kırınım Entegrasyonundan (DIALS) elde edilen nokta bulma sonuçlarının grafiksel bir gösterimi 40,41(Şekil 6a).<ol>
<li>Varsayılan ayarlar her 10görüntüyü puanlar ve hesaplama yükünü en aza indirmek için birkaç saniyede bir yenilenir.</li>
			<li>Yukarıdaki komutun sonuna bir bağımsız değişken ekleyerek varsayılanı değiştirin. Örneğin, 'i24-ssx /dls/i24/data/2020/mx12345-6 2' i24-ssx diğer tüm görüntülerde isabet bulmayı çalıştırır. Ancak, bu kümeye (paylaşılan bir kaynak!) aşırı yük bindirebilir ve işlem sürelerini yavaşlatabilir. Grafik, başarılı indeksleme olasılığına göre renk kodludur, kırmızı en az 15 Bragg noktası bulundu (dizin oluşturma şansı yüksek), mavi çok az veya hiç yararlı kırınım göstermiyor.</li>
			<li>Spot bulucu arabirimindeki noktalara tıklayarak DIALS görüntü görüntüleyicisinde ilgi çekici kırınım görüntülerini görüntüleyin.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dizin oluşturma ve tümleştirme geri bildirimi NOT: Kırınım verilerinin dizin oluşturma ve tümleştirilmesi DIALS ile 40,41dials.still_process işlevi kullanılarak gerçekleştirilir. Bu nedenle, kristalinizle ilgili belirli bilgiler (beklenen kristal uzay grubu, birim hücre ve deneme geometrisi) bir .phil metin dosyasına konulmalıdır.<ol>
<li>Terminale modül yükleme kadranları yazarak DIALS modüllerini yükleyin.</li>
		<li>Veri kümesini işlemeye başlamak için dials.still_process /path/to/images/ /pathto/phil- file.philyazın. Tüm hala işleyen veri kümelerinin ilerlemesi, monitor_stills_process.py yazarak stills_monitor komut dosyası çalıştırılarak izlenebilir (modül yükleme i24-ssx gerçekleştirdikten ve dizini geçerli ziyarete değiştirdikten sonra) (Şekil 6b).</li>
		<li>Dizinlenmiş kırınım verilerinin birim hücre dağılımı (Şekil 7a) ctbx.xfel.plot_uc_cloud_from_experiments/path/to/dials/output/*refined.expt combine_all_input=true komutu kullanılarak izlenebilir Bu, daha önce açıklanmış olduğu gibi birim hücre polimorflarını tanımlamak ve çözmek için özellikle yararlıdır 42.</li>
		<li>'Visualzie' eğer ve nasıl, bu dağıtım sabit bir hedef arasında değişir 2B çizim üreterek (Şekil 7b) komut pitonunu kullanarak pacman.py /visit/processing/_hit_finding/chip.out.</li>
		<li>0,0,1 expand_to_P 1 =True /path/to/dials/output/*refined.expt dials.stereographic_projectionDIALS komutunu kullanarak tüm dizinlenmiş kırınım verilerinin(Şekil 7c)stereografik projeksiyonlarını üretin. NOT: Bravais kafes simetrisinin, birleştirilen verilerin mükemmel bir ikiz olarak görünen uzay grubu simetrisinden daha yüksek olduğu kristallerden gelen verileri işlerken yaygın bir patolojidir. Veri işleme algoritmaları bu patolojiyi çözmek için gelişti 43,44,45,46, ancak kullanıcılar verilerini işlerken buna dikkat etmelidir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Seri senkrotron veri toplama, MX beamlines'da nispeten yeni bir tekniktir ve şu anda XFEL'lerde gerçekleştirilen ultra hızlı veri koleksiyonları ile geleneksel senkrotron tabanlı MX arasındaki boşluğu kapatır. Bu makale, düşük doz, doz serileri ve zaman çözümlenmiş deneyler için Beamline I24, Diamond Light Source'da sabit hedef seri verilerinin nasıl başarıyla toplanabileceğine dair genel bir bakış sunmayı amaçlamaktadır. Standart kristalografide olduğu gibi, numune hazırlama yapı çözümünde önemli bir şişe boynudur. SSX de farklı değildir ve homojen bir kristal bulamacın yeterli miktarlarda hazırlanması, tek büyük protein kristallerinin büyümesi gibi onlarca yıllık çalışma ve arıtmadan henüz yararlanmamıştır. Ancak, bu bulamacın hazırlanması bu makalenin kapsamı dışındadır ve başka bir yerde özetlenmiştir36. Burada açıklanan yaklaşımdaki kritik adım, çip yüklemesini (adım 1) ve bir denemenin nasıl ilerlemesi gerektiğini bilgilendirmek için kullanımı kolay GUI arabirimleri (adım 3) ve otomatik veri işleme işlem hatları (adım 6) kullanılarak kullanılabilir örneğin dikkatli kullanımını içerir.
Hızlı geri bildirim ardışık düzeni, kullanıcıların başarılı veri toplama için sonraki yonga yükleme protokollerini bilgilendirmek için veri toplama sırasında ilk isabet oranlarını değerlendirmelerini sağlayan güçlü bir araçtır. Düşük isabet oranıyla (%<5) karşı karşıya kalan kullanıcılar, eksik veri toplama ve/veya ek koleksiyonlarla çalışma süresini boşa harcama riskiyle karşı karşıya kalır. Bu durumda, örnek havuza alabilir, nazik santrifüjleme ile konsantre edilebilir ve/veya daha büyük birimler adım 1.5'te yüklenebilir. Daha yüksek bir isabet oranı genellikle olumludur, ancak aşırı yüklemenin aynı kuyuda birden fazla kristale yol açtığı azalan bir geri dönüş noktası vardır. DIALS çok kafesli kırınım verileri ile başa çıkabilir50, ancak indeksleme ve entegrasyondan daha büyük bir endişe, kristal gruplandırmanın kristallerin lazer ışığı veya hızlı karıştırma ile eşit aktivasyonu üzerinde hassas zaman çözülmüş deneyler için sahip olabileceği zararlı etkidir. Bu nedenle, zaman çözümlenmiş denemeler için sabit hedeflerin aşırı yüklenmesini önlemek için özel bir özen gösterilmelidir.
Dizin oluşturma ve tümleştirme işleme adımı, her bir nokta tek tek kafeslerin hkl 001 yansımasının yönünü temsil eden orta çapraz ile bir arsa ve kiriş ekseninden 90 ° uzak bir dönüşü temsil eden dairenin dış halkasını üretir. Bu, kristallerinizin tercih edilen bir yönelime sahip olup olmadığını gösterir, bu da veri eksiksizliğini etkileyebilir ve daha fazla veri toplama veya yükleme protokolünü değiştirme ihtiyacını gösterebilir. Şekil 7c'ninsol panelinde, bir çipin HEWL kristalleri ile aşırı yüklenmesinin etkisi gösterilmiştir. Diyaframlar daha fazla kristalle doldukça, tabanda rastgele bir yönde kenar yerine diyaframların açılı duvarlarına yapışırlar. İki ortogonal elips, yonganın iç duvarlarında bulunan ve ışın yönüne ~35° olan kristallerin bir sonucudur. Bu, yüklenen kristallerin hacmini azaltır, isabet oranını azaltır ve bu tercih edilen düzlemlerde yatan kristallerin fraksiyonunu önemli ölçüde azaltır.
I24'te LCP ekstrüderleri ve mikroakışkan çipler gibi diğer seri yaklaşımların mevcut olduğu belirtilmelidir. Bunlar benzer Kİ'ler kullanır ve yukarıdakilerin çoğu farklı bir teknik kullanılsa bile geçerli kalır. Burada açıklanan sabit hedef yaklaşımının ötesinde hem SSX hem de SFX için bir dizi seri yaklaşım vardır, her biri gerçekleştirilecek deneye ve deney için kullanılan kiriş çizgisine bağlı olarak diğerine göre belirli avantajlara sahiptir. Seri yaklaşımlar hızla geliştikçe, son güncellemeler için beamline web sayfalarını (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/I24.html) kontrol etmeniz ve ışınlama süresini planlarken mümkün olduğunca erken bir aşamada beamline personeliyle konuşmanız önerilir. Standart ve seri denemeler için I24'e erişim kullanım noktasında ücretsizdir. İngiltere ve AB kullanıcıları için seyahat ve konaklama masrafları kısmen iNEXT Discovery aracılığıyla karşılanmaktadır.

Seri senkrotron kristalografisi (SSX), X-ışını içermeyen elektron lazerlerinden(XFEL) esinlenen yeni bir veri toplamayöntemidir. Bir XFEL'de, kristal son derece parlak X-ışını darbesi tarafından yok olmadan önce, genellikle çok küçük bir protein kristalinden tek bir kırınım deseni kaydedilir. Bu, tipik olarak, başka bir kırınım deseni elde etmek için X-ışını ışınına yeni bir kristalin girmesi gerektiği anlamınagelir 4. Kristalleri sürekli yenileme ihtiyacı, birçok seri numune teslim tekniğinin geliştirilmesini yönlendirmektedir5.
Senkrotronlarda, klasik (seri olmayan) rotasyon kristalografi yöntemleri yaygın olarak uygulanır ve yapı çözümü6için eksiksiz bir veri kümesi toplamak için bir goniometre kullanılarak bir X-ışını ışınında döndürülen tek bir büyük kristalden yararlanır. Kristallerin ömrünü artırmak için, böylece tam bir veri kümesi7,8toplanabilir ve ayrıca nakliye ve otomatik numune aktarımını kolaylaştırmak için, kristaller veri toplama için ~ 100 K'ya kriyosood edilir. Yoğun mikro odaklama kiriş hatlarında, radyasyon hasarı tek bir kristal 9,10,11'dentam bir veri kümesinin toplanmasını yasaklayabilir. Radyasyon hasarının getirdiği sınırlara rağmen, kullanılan kristallerin sayısı nispeten mütevazı kalır ve kullanılan yaklaşım esasen tek kristal deneyi ile aynıdır.
Öte yandan SSX, tam bir veri kümesi oluşturmak için rastgele yönlendirilmiş binlerce kristalden tek bir hareketsiz kırınım deseni elde etmek için seri numune teslimini kullanır. Kristal rotasyonu içeren seri tekniklerin geliştirilmekte olduğu belirtilmektedir12,13 ancak hala, sıfır dönüş, yaklaşımlara odaklanıyoruz. Farklı avantajlara ve dezavantajlara sahip çok çeşitli numune dağıtım sistemleri vardır14, akış odaklı / viskoz bir jette kristal akışı sunmaktan15 , 16,17,mikroakışkan çip18,19veya kazınmış silikon çip 20,21gibi sabit bir hedefte kristaller . Tipik olarak, kristaller oda sıcaklığında tutulur, daha fazla konformasyonel çeşitliliğin gözlenmesine izin verir ve fizyolojik olarak daha ilgili bir ortam sağlar22. SSX çok düşük doz veri kümelerinin toplanmasını sağlar23Veri kümesinin toplam dozu bir kristalin tek bir kısa X-ışını maruziyetine eşdeğer olduğundan. SSX'in sağladığı bir diğer büyük avantaj, lazer ışığı24 , 25 , 26,27'ye maruz kalma veya kristallerin ve ligand / substrat28,29'unkarıştırılmasıyla tetiklenen reaksiyonlarla protein dinamiklerinin zaman çözümlenmiş yöntemlerle incelenmesidir. Daha küçük kristaller kullanmak, lazer ışığının kristalin tamamına nüfuz edebileceği anlamına gelir, farklı zaman noktalarında alınan kırınım verileri için iyi tanımlanmış reaksiyon ara maddeleri sağlamak için çok foton emilimi olmadan reaksiyonun düzgün bir şekilde başlatılması27. Daha büyük kristallerin kullanımı ve rotasyon tabanlı veri toplama yöntemleri, veri taramalarında sınırlı lazer penetrasyon derinliği, nonuniform veya multifotoni aktivasyonu, radyasyon hasarı ve mekanik tepegöz süresinden muzdariptir ve bu da daha yüksek reaksiyon hızlarında yorumlanması zor veya imkansız olabilecek reaksiyon aralarının bir karışımına neden olur. Daha küçük kristaller karıştırma deneylerinde benzer bir avantaj sağlar, çünkü ligandlar kristal boyunca hızlı ve daha düzgün bir şekilde yayılabilir, yine tanımlanmış reaksiyon aralarının farklı zamanlarda kaydedilebilmesine izin verir30,31,32.
Diamond'ın mikro odaklama kiriş çizgisi I24'te hem geleneksel rotasyon hem de SSX deneyleri yapılabilir. Burada, I24'teki sabit hedefler kullanılarak SSX numune hazırlama ve veri toplama için kapsamlı bir protokol ve Diamond'daki seri verilerin veri analizi için protokoller sunulmaktadır. Makale ve beraberindeki videoların kullanıcıların I24'te başarılı bir SSX deneyi gerçekleştirmesine izin vermesi gerekirken, bunun hızla gelişen bir alan olduğu ve yaklaşımların sürekli geliştiği unutulmamalıdır. Ayrıca, Petra III (P14-TREXX), MAX IV (BioMAX)33, SLS (PXI ve PXII) 34 ve NSLS (FMX)35dahil ancakbunlarla sınırlı olmamak üzere diğer senkrotron kaynaklarında seri yöntemlerin mevcut olduğu belirtilmelidir. Seri veri toplama ve işleme özellikleri kaynaklar arasında farklılık gösterirken, temel ilkeler aynı kalacaktır. Aşağıdaki protokollerin, elde edilebileceklerin zirvesinden ziyade bir başlangıç noktasını ve ana kampa giden bir yolu temsil ettiği görülmelidir.
Bu protokol, kullanıcıların mL başına iyi bir mikrokristal yoğunluğuna sahip 0,5-2,0 mL'lik bir mikrokristal bulamacın üretildiği bir protein veya küçük molekül kristal sistemine sahip olduğunu varsayar. Kristal bulamacı elde etmek için protokoller daha önce açıklanmıştır 36. I24'te en yaygın olarak kullanılan ve hassas bir şekilde tanımlanmış bir silikon çip kullanan birçok farklı sabit hedef türü mevcuttur. Diğer yonga düzenlerinden ayırt etmek için, aşağıda ve kiriş çizgisi arayüzünde bu bir 'Oxford çipi' olarak adlandırılır. Daha önce açıklandığı gibi Oxford yonga düzeni, her biri toplam 25×.600 diyafram 20×21 diyafram için 20.20 diyafram içeren 8.8 'şehir bloğu' içerir.

<table><tbody><tr><td>Talaş Tutucular</td><td>Özel Yapı N</td><td>/A</td><td>2 manyetik taban plakası, 2 metal halka ve bir kinematik montajdan oluşan şirket içi özel yapım metalik talaş tutucular.</td></tr><tr><td>LCP modüler ürün yelpazesinin bir parçası olarak sunulan</td> <td>Talaşsız Talaş Ara Parçaları</td><td>SWISCII</td><td>N/A</td> LCP yapışkan levhalar</tr><tr><td>Geobrick LV-IMS-II</td><td>Delta Tau</td><td>N/A</td><td>A&nbsp; özel bir Elmas Işık Kaynağı donanım konfigürasyonuna sahip çok eksenli kontrolör/amplifikatör</td></tr><tr><td>Kinematik Montajlar</td><td>ThorLabs</td><td>KB25/M</td><td>Çip tutuculara yapıştırılmış bir üçgen şeklinde düzenlenmiş 3 mıknatıslı kare tabanlar.</td></tr><tr><td>KNF Laboport Vakum Pompası</td><td>Merck</td><td>Z262285-1EA</td><td>Katı PTFE vauum pompası, 10 l/dk pompalama hızı.</td></tr><tr><td>Mylar Levhalar 6 ve mikro; m</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>15360562 300 ft 6'lı rulo & SPEX SamplePrep</td></tr><tr><td>Mylar Sheets 3 & micro tarafından m kalınlığında mylar XRF filmi; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-675-4</td><td>300 ft 3'lü rulo ve mikro; SPEX SamplePrep Pelco tarafından m kalınlığında mylar XRF filmi</td></tr><tr><td>easiGlow Glow Deşarj Sistemi</td><td>Ted Pella, INC.</td><td>91000</td><td>Hidrofilik yüzeyler üretmek için kullanılan kompakt, bağımsız bir kızdırma deşarj sistemi</td></tr><tr><td>Silikon Çipler</td><td>Southampton Üniversitesi</td><td>N/A</td><td>Çeşitli boyutlarda mevcut olan 25.6000 açıklığa sahip özel kazınmış silikon çipler.</td></tr><tr><td>Çeviri Aşamaları</td><td>Smaract</td><td>N/</td><td>A XYZ numune aşamaları, Diamond Light Source ve SmarAct tarafından ortak bir tasarımdır ve SmarAct tarafından üç doğrusal öteleme 50 mm hareket aşaması, hassas çapraz makaralı kılavuzlar ve 1 nm çözünürlüğe kadar entegre bir sensör kullanılarak özel olarak üretilmiştir</td></tr><tr><td>1byOne Nemlendirici (701UK-0003)</td> <td>1byOne</td><td>B01DENO0EQ</td><td>Piyasada bulunan 1.3 Litre ultrasonik nemlendirici</td></tr></tbody></table>

diamond light source'da sabit hedef seri veri toplama

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Seri veri toplama, senkrotron kullanıcıları için nispeten yeni bir tekniktir. I24'te sabit hedef veri toplama için bir kullanım kılavuzu olan Diamond Light Source, sorunsuz veri toplama için ayrıntılı adım adım talimatlar, şekiller ve videolar sunar.

Düşük Doz Veri Toplama ve Seriler Düşük doz (Adım 5.1: Senaryo 1) ve doz serileri (Adım 5.2: Senaryo 2) I24'te bakır nitrit redüktaz mikro kristalleri hakkında veri toplanmış ve daha önce yayınlanmıştır 42. Tüm örnekler adım 1'de açıklandığı gibi hazırlandı, adımlar 3, 4 ve 5'e göre toplanan veriler ve adım 6'daki yöntemler kullanılarak işlendi. Bu çalışmada, yeni bir örneğe geçmeden önce her diyaframda çekilen 20 kırınım görüntüsü (yani, yukarıda gösterilen veri toplama GUI'sinde n=20) ile hızlı doz serisi toplanmıştır. Bu verilerden P21 3uzay grubundaki birim hücrelerin bimodal dağılımı tanımlanmıştır (a = b = c = 97.25 şve a = b = c = 96.38 Å). Bu birim hücreli polimorfların işlenmek üzere tanımlanması ve ayrılması, veri kalitesi göstergelerinde belirgin bir iyileşme gösterdi ve tüm veriler birlikte işlenirken gözlenen karışık durum yerine kalıntılar 189-193 arasındaki esnek bir döngüde iki farklı yapı ortaya çıkardı. Bu tür polimorfların tanımlanması, sadece küçük yapısal değişikliklerin beklendiği hassas bir zaman çözümlü yapısal çalışmada tüm farkı yaratabilir. Ayrıca, toplanan doz serisi kristalde bir doza bağımlı birim hücre değişikliği ortaya çıkardı ve artan doz popülasyonu daha büyük birim hücre lehine değiştirdi.
Benzer çalışma, Streptomyces lividans'tan (DtpAa) boya tipi heme peroksidazdan bir doz serisinin (Adım 5.2: Senaryo 2) toplandığı Ebrahim ve arke (2019)47tarafından, SSX'ten düşük doz yapılarını karşılaştırmak için gerçekleştirildi (Adım 5.1: Senaryo 1) SFX kullanılarak aynı sabit hedef sistemde ölçülenlerle. SACLA Beamline BL2 EH3'te 10 femtosaniye nabız uzunluğu ve 30 Hz tekrarlama oranı ile SFX verileri toplanılarak alındı. 10 femtosaniye nabız süresi, doz bağımlı etkilerin SFX verilerinde bulunmamasını sağlar. SFX verileri, her örnek pozisyonda 10 sıralı 10 milisaniyelik pozlamanın ölçüldüğü I24 beamline'da toplanan SSX verileriyle karşılaştırıldı (yani, n=10). Heme demiri koordineli bir su molekülünün demirden uzak doz bağımlı göçünün yanı sıra SSX doz serisindeki heme propiyonat gruplarından birinde konformasyonsal bir değişiklik gözlendi. SFX yapısı gibi hasarsız olmasa da, doz serisi sıfır doz veri kümesinin (ferrik heme) Fe-O bağ uzunluğunun tahmin edilmesine izin verdi ve bu SFX'ten elde edilen değerle deneysel hata içinde kabul etti.
Burada açıklanan seri kristalografi veri toplama yöntemleri, örneğin oda sıcaklığında anaerobik protein yapılarını incelemek için yeni örnek ortamlar sağlamak için kolayca uyarlanabilir. Rabe ve ark. 2020 48'sheet on-sheet' örneğinin veya 'yongasız çip'in anerobik bir haznede farklı sızdırmazlık filmleriyle yüklenmesi, dioksijene duyarlı numunelerden yapısal verilerin oda sıcaklığında toplanmasını sağlar.
Pompa Probu Diamond Beamline I24'te aşağıdaki temsili sonuçlar alınmamış olsa da, bu yöntemler seri kristalografi yöntemi geliştirmede standart yöntemlere yönelik çalışmak üzere iNEXT programındaki tesisler arasında yakın işbirliği içinde geliştirilmiştir. Beamline I24, yukarıdaki protokollerde açıklanan yöntemleri kullanarak bu tür deneyleri gerçekleştirmek için aşağıda açıklananlara eşdeğer toplama yöntemleri sunar veya yakında sunacaktır.
Pompa Probu: Hızlı Karıştırma Petra III'teki beamline T-REXX'te Mehrabi ve arkadaşları (2019) 28 tarafından sabit hedeflere reaksiyon başlatmak için piezo tahrikli damlacık enjektörü kullanılarak hızlı karıştırma SSX gerçekleştirildi. Bu çalışma, numuneye uygulanan 75 pL'lik bir düşüşün 50 ms'sinde meydana gelen bağlama ile GlcNac3'ülysozyme mikrokristallere bağlayan talaş karıştırma deneyi üzerine bir ilke kanıtı sunar. Bu çalışma, 15 ms içinde glikoz bağlamasını ve 60 saniyelik bir gecikmeden sonra glikoz molekülünde açık halka uyumu oluşumunu gösteren 7 yapılı bir zaman çözümlü ksilose isomerase aktivitesi serisi ile takip edildi. Damlacık enjeksiyonu için eşdeğer bir kurulum şu anda I24'te kullanılmak üzere geliştirilmektedir.
Pompa Probu: Işık Aktivasyonu Schulz ve ark (2018) 49'dahafif aktif bir pompa probu seri deneyi sunulmaktadır. Floroasetat dehidrogenaz fotokapanat ile ıslatıldı ve 4 zaman noktasında (t=0, 30, 752 ve 2.052 ms) yapılar üretmek için 320-360 nm lazer ışığı ile pompalandı. Dinlenme durumu yapısı (0 ms), birkaç su molekülü dışında boş bir etkin alan ve her iki protein alt birliğinin kapak etki alanları arasındaki eşdeğer yoğunluğu gösterir. Işık aktivasyonundan sonra 30 ms ve 752 ms alt birim B'nin A alt birliğinin kap etki alanında elektron yoğunluğunda önemli bir azalma gözlenebilir. B alt birliğinin kapak etki alanındaki elektron yoğunluğundaki azalma, A alt birliğinin aktif bölgesinde floroasetatın 752 ms'de ortaya çıkmasıyla çakışıyor. 2.052 ms'deki son veri kümesi, SN2 saldırısı için doğru geometriyi kolaylaştırdığından şüphelenilen ligandın daha fazla yapısal yeniden düzenlenmesini ve reaksiyonda bir ara durum oluşumunu göstermektedir. I24'te, ışık aktivasyonu için femtosaniye darbeler sağlayan 210-2500 nm arasında ayarlanabilir taşınabilir bir Pharos lazer sistemi kullanılabilir. İlk deneyler, serbest bırakılan ligandın gözlenen hedef proteine bağlanmasıyla 308 nm heyecanlanma kullanarak bir fotokapanın başarılı bir şekilde aktivasyonunu gösterdi. Beamline personel güvenlik sistemine entegrasyon yazılıyor ve 2021'in başlarında rutin kullanıcı deneyleri bekleniyor. Daha az yoğun ışık darbeleri gerektiğinde deneyler için, TTL kontrollü LED'lerle ışık aktivasyonu başarıyla gerçekleştirildi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig01.jpg"> Şekil 1: Diamond Light Source'da numune yükleme ekipmanı yerindedir. Kurulum bir vakum pompası (a), eldiven kutusu (b) ve nemlendiriciden (c) oluşur. Eldiven kutusu vakum basıncı içinde, bir Büchner şişesine(e, yeşil ok) bağlı bir örnek blokta(d)tutulan kristal bulamaç yüklü bir çip üzerinde, bir stopcock 'a(g, mavi ok) bağlı bir basınç regülatörü(f, sarı ok) aracılığıyla hareket etmek için kullanılır. Nemli hava, nemlendiriciye (h) bağlı plastik boru ile çadıra pompalanır ve bir higrometre (i) kullanılarak ölçülür. Bileşenler kelepçe standları (j)kullanılarak yerinde tutulur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig02.jpg"> Şekil 2: Örnek tutucular. Polyester filmi bir üste(b) ve alt (c) yarısına sıkıştırmak için, numune tutucuyu örnek aşamalara bağlamak için kullanılan alt yarı sportif manyetik montajlar (d) ile metal bir O-halkası ( a ) kullanırlar. Polyester film (6 μm (e) veya 3 μm (f) ve kauçuk O-halkaları (beyaz oklar), kristal yüklü bir çipin altıgen cıvatalarla(g)sıkıca kapatılan bir numune tutucuda hızla kurumasını önler. Cipsler, dH 2 O, 1 M HCl ve dH2O(h)dahil olmak üzere sıralı15dakikalık banyolar kullanılarak temizlenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig03.jpg"> Şekil 3: I24'te sabit hedef veri toplama için veri toplama GUI'si. (a) Yongaları hizalamak ve veri toplama parametrelerini tanımlamak için kullanılan ana arabirimi gösterir, (b) veri toplama için bir yonganın alt bölgelerini tanımlamak için kullanılan eşleme lite arabirimidir ve (c) lazer aydınlatma için parametreleri tanımlamak için bir arabirimdir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig04.jpg"> Şekil 4: Adım 3'te açıklandığı gibi bir talaş tutucuyu aşamalara monte etme işlemi, nokta 1. Bu <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig04large.jpg" target="_blank">şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig05.jpg"> Şekil 5: Talaş hizalaması. Bir çip,(a)olarak gösterilen çipteki üç fidücial işaretleyiciye tıklayarak hizalanır. Eksendeki beamline görüntüleme sistemi aracılığıyla 0, 1 ve 2 fiducials görünümleri (b), (c) ve (d) içinde gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig06.jpg"> Şekil 6: Otomatik işleme sonuçları, 6.1 adımında açıklandığı gibi başlatılan görüntüler. Güncellenen bir isabet hızı çizimi görüntülenir (a, inset). İlgili kırınım görüntüsüne bir 'isabet' tıklanırsa, kadran görüntüsü görüntüleyicide görüntülenir. Geçerli veri toplama için isabet oranı gösterilir (bu örnekte ),6). Panel (b), ziyaret sırasında şimdiye kadar toplanan ve gerçek zamanlı olarak güncelleyen veriler için geçerli dizin oluşturma ve tümleştirme oranlarını gösteren bir pencere örneği gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62200/62200fig07.jpg"> Şekil 7: Daha derinlemesine veri analizi. Birim hücre parametrelerinin görselleştirilmesi polimorfları (a) ortaya çıkardı. Ortalama birim hücre parametreleri hesaplanır; ancak, bu henüz polimorflar için bireysel ortalamalara uzanmaz. Küçük bir veri alt kümesinin görselleştirilmesi (gösterilen veriler, Ebrahim ve ark. 2019'da açıklanan verilerden elde edilen 793 bakır nitrit redüktaz kristalinin bir alt kümesidir) genellikle eğilimleri ortaya çıkarmak için yeterlidir. 2-B yararlı parametrelerin çizimleri, yaklaşan veri koleksiyonları için ele alınabilecek yükleme veya dehidrasyon etkileri nedeniyle ortaya çıkan varyasyonları ortaya çıkarmak için de üretilebilir (b). Stereografik projeksiyonlar, yükleme protokolüne (c)geri beslenen tercih edilen yönelimlerin varlığını veya yokluğunu ortaya koyabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62200/62200fig07large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Diamond beamline I24'te seri senkrotron kristalografisi için sabit hedef numune hazırlama, veri toplama ve veri işleme için kapsamlı bir kılavuz sunuyoruz.

Diamond Light Source'da Sabit Hedef Seri Veri Toplama

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Seri senkrotron kristalografisi veya SSX, MX'in nispeten yeni ve hızla gelişen bir alanıdır.Düşük doz ve oda sıcaklığı deneyleri için çok uygundur, ancak belki de en önemlisi, dinamikleri takip etmek için gerçekten uygundur. Bu, hareket halindeki proteinlerin stop-motion filmlerinin yapılmasını sağlar. I24'te birden fazla SSX modu mevcuttur.Bu protokol, sınırlı miktarda örnek kullanarak çok çeşitli seri denemelere izin veren sabit hedefli SSX'e odaklanır. Silikon çipler, onları tanınamıyorsanız, yüklerken ve temizlerken zarar verebilir. Ayrıca, yonga hizalama protokolü birçok kristalografici için tamamen yenidir ve veri işleme standart döndürme verilerinizden biraz farklıdır.Bir talaş tutucu hazırlamak için, iki yaprak polyester folyoyu yaklaşık 6'ya 6 santimetre kareler halinde kesin ve levhaları iki taban plakasının üzerine yerleştirin. Metal sızdırmazlık halkaları kullanarak, levhaları yerine sabitleyin, ardından kırışıklıkları gidermek için fazla folyoyu dikkatlice çekin. Ardından, analiz edilecek kristallerin boyutuna göre uygun boyutta diyaframlara sahip bir silikon çip seçin.Işıma çipi 0.39 milibarda 25 saniye deşarj, 15 miliamper akım ile. Silikon çipi, yükseltilmiş çubuklar aşağı bakacak şekilde talaş yükleme aşamasına yerleştirmek için cımbız kullanın. Daha sonra, bir pipet kullanarak, çipin düz tarafına 200 mikrokristal bulamacı uygulayın ve bulamacı çipin tüm şehir bloklarını kapsayacak şekilde yayın.Talaş hasar görürse, eşit bir vakum uygulanabilmesini sağlamak için herhangi bir deliği küçük bir polyester folyo parçasıyla kapatın. Daha sonra talaştan tüm fazla sıvıyı epire etmek için hafif bir vakum uygulayın. Çipi talaş yükleme aşamasından çıkarın ve fazla sıvıyı çıkarmak için çipin alt kısmını filtre kağıdı ile dikkatlice lekeleyin.Yüklü çipi kılavuz işaretleri arasında talaş tutucusunun daha büyük yarısına yerleştirin, düz tarafı aşağı. Çip tutucunun küçük yarısını mühürlemek için çipin üzerine yerleştirin. Talaş tutucunun iki yarısı yerine yapışmalıdır.Ardından, altıgen cıvatalar kullanarak çipi güvenli bir şekilde yerine sabitleyin. Çipi hizalamak için, montaja yaklaşırken talaş tutucuyu 30 derecelik bir açıyla tutun. Ardından, yüklü çipi kiriş hattındaki XYZ aşamasına yerleştirmek için kinematik montajları kullanın.Mıknatıslar temas ettiğinde, talaş tutucunun akışa paralel dönmesine izin verin ve yerine tıklayın. Çip yerleştirildikten sonra, çipin sol üst fidücialini bulmak için eksendeki beamline görüntüleme sistemini ve yonga hizalama grafik kullanıcı arayüzünü kullanın. X, Y ve Z'deki fiducial 0'ı ortalamak için, Z'yi hizalamak için yukarı ve aşağı, X'i hizalamak için sola ve sağa hareket edin.Ardından Fiducial 0'ı ayarla"Fiducial 1 ve 2'yi X-ışını ışını ışını ile aynı şekilde hizaladıktan sonra, bir koordinat matrisi oluşturmak için "Eşgüdüm sistemi oluştur"u tıklatın.Ardından, XYZ aşamasını her şehir bloğunun ilk kuyusuna taşımak için Blok Denetimi"ne tıklayın. X-ışını çapraz çizgisi diyaframlarla hizalanırsa, çip hizalanır. DIALS'tan gelen nokta bulma sonuçlarının bu grafiksel gösteriminde, güncellenen bir isabet hızı grafiği gözlemlenebilir.Bir isabet tıklatılırsa, karşılık gelen kırınım görüntüsü DIALS görüntü görüntüleyicisinde görüntülenir. Bu tabloda, ziyaret sırasında veriler toplandıkça gerçek zamanlı olarak güncellenen geçerli dizin oluşturma ve tümleştirme oranları görselleştirilebilir. Birim hücre parametrelerinin görselleştirilmesi polimorfları ortaya çıkardı.Yükleme veya dehidrasyon etkileri nedeniyle ortaya çıkan varyasyonları ortaya çıkarmak için yararlı parametrelerin iki boyutlu çizimleri de üretilebilir. Stereografik projeksiyonlar, yükleme protokolüne geri beslenebilecek tercih edilen yönelimlerin varlığını veya yokluğunu ortaya koyabilir. Örneğin, bu projeksiyonda, bir çipin lysozyme kristalleri ile aşırı yüklenmesinin etkileri gözlenebilir.Çipi yüklerken pipeti yavaşça kullanın ve pipeti çipin üzerinde dinlendirmek için parmağınızı kullanın. Bu, çipe dokunmanızı ve silikondaki delikleri yanlışlıkla bıçaklamanızı önler. Verileri işlerken, kullanılabilir otomatik işlem hatlarından yararlanın.Bu, denemenizin nasıl ilerlediklerine ve bir şeyi değiştirmeniz gerekip gerek olmadığına dair iyi bir fikir verecektir. Bu yöntem önemli miktarlarda kristalize edilebilen herhangi bir protein sistemine uygulanabilir. Ve reaksiyon ışık X ışınları veya hızlı karıştırma ile tetiklenebilir.Bir dizi yapı üzerinde yapılan dinamik çalışmalar, proteinlerin nasıl çalıştığına dair fikir verebilir.

fixed-target-serial-data-collection-at-diamond-light-source

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Dijital micromirror cihazları (DMD) nöronal eksitabilite kontrol etmek için zaman ve mekan karmaşık desenleri oluşturabilirsiniz. Tasarım, inşaat, ve DMD sistemlerinin işletilmesi ile ilgili konular görüşülüyor. Böyle bir sistem, distal dendritik dallanma noktaları arasında doğrusal olmayan entegrasyon gösteri sağladı.

Desenli Photostimulation Şube Noktaları Arasında Dendritik Entegrasyon Araştırma Digital Micromirror Cihazlar

&gt;Drosophila larvaları ışığa duyarlıdır ve çevredeki ışıktaki değişikliklere tepki verir. Bu videoda, ışık noktası tahlili adı verilen, ışıktan kaçınma yeteneklerini test eden bir tahlil açıklanmaktadır. Öne çıkan protokol, mavi ışıklı bir LED ile testin nasıl kurulacağını ve ışıkla karşılaşmaya yanıt olarak hayvanın davranışının nasıl kaydedileceğini gösterir.

Işık Noktası Deneyi: Drosophila Fototaktik Davranışını Araştırmak İçin Bir Yöntem

Bu yazıda Gelişmiş Foton Kaynak at GSECARS 13-BM-C beamline bir elmas örs hücre ile tek kristal X-ışını kırınım deneyleri yürütmek için ayrıntılı prosedürler açıklanmaktadır. ATREX ve RSV programları verileri analiz etmek için kullanılır.

Yüksek Basınçlı PX de Tek Kristal Kırınımı ^ 2

Bu protokol, Drosophila larva fototaktik davranışını araştırmak için ışık noktası bir test sunar. Bu testte, ışık stimülasyonu olarak bir ışık noktası oluşturulur ve larva ışıktan kaçınma işlemi kızılötesi ışık tabanlı görüntüleme sistemi tarafından kaydedilir.

Drosophila Larva Fototaksisanalizi için Hafif Nokta Tabanlı Tahlil

Yüksek yoğunluklu lazer darbeleri ile ince altın folyo otomatik ışınlama için bir protokol sunulmaktadır. Protokol, mikroişleme hedef üretim sürecinin adım adım tanımını ve hedeflerin lazerin odak noktasının 0,2 Hz hızında nasıl sunulduğuna yönelik ayrıntılı bir kılavuz içerir.

Yoğun Lazer Işınlama Deneyleri için Mikrofabrikasi Hedeflerin Otomatik Teslimi

Burada, uzun dalga boyu makromoleküler X-ışını kristalografi deneyleri için Diamond Light Source'daki I23 kiriş hattında kriyojenik numune hazırlama ve kristallerin vakum endstationına aktarılması için bir protokol sunuyoruz.

Diamond Light Source'daki Beamline I23'te Vakum İçi Uzun Dalga Boyu Kristalografisi için Örnek Hazırlama ve Transfer Protokolü

Harwell'deki Araştırma Kompleksi'ndeki kristalizasyon tesisini kullanarak proteinlerin kristalleştirilmesi için bir protokol sunuyoruz ve ardından Diamond'ın Çok Yönlü Makromoleküler Kristalografi in situ (VMXi) ışın hattındaki plakalar içindeki kristallerden yerinde X-ışını kristalografik veri topluyoruz. Numune gereksinimlerini, kristalizasyon protokollerini ve veri toplama yönergelerini açıklıyoruz.

Harwell ve Beamline VMXi'deki Kristalizasyon Tesisi Kullanılarak Kristalizasyon ve Yerinde Oda Sıcaklığı Veri Toplama, Elmas Işık Kaynağı

Protokol, kemirgen kalplerindeki karmaşık kardiyak yapıları araştırmak için uyarlanmış doku temizleme yöntemleriyle birlikte gelişmiş ışık tabakası mikroskobunu kullanır ve kardiyak morfogenezin anlaşılması ve yeniden şekillenmesi için büyük bir potansiyele sahiptir.

Kemirgen kalplerinde kalp yapısını ortaya çıkarmak için ışıklı tabaka görüntüleme

Bu makale, dinamik, tekne şeklinde fotoforetik bir tuzak kullanarak havada büyük metalik parçacıkların uzun süreli, stabil tuzaklanması ve hassas konumlandırılması için deneysel yöntemi tanımlar. Bu sistem, plazmonik etkileşim çalışmaları için uygun kontrollü manipülasyonu mümkün kılar.

Doğrudan çekilen yan duvarlara sahip bir &#39;tekne&#39; tuzağı kullanarak havada büyük metal parçacıkların optik olarak hapsedilmesi

X-ışını serbest elektron lazerlerinde ve senkrotron kaynaklarında seri kristalografi için lipidik kübik fazda membran protein mikro kristallerinin hazırlanması ve verilmesi için prosedürleri açıklıyoruz. Bu protokoller aynı zamanda çözünür protein mikro kristallerinin dahil edilmesi ve verilmesi için de uygulanabilir, bu da sıvı enjeksiyona kıyasla numune tüketiminin önemli ölçüde azalmasına yol açar.

Hazırlık ve Seri Femtosecond Kristalografi için lipidik Cubic Faz Protein mikro kristallerinin teslimi

Keşfedin sabit hedef seri senkrotron kristalografisi yöntemini Diamond I24 hattında protein dinamiklerini incelemek için. Bu protokol sınırlı örnek miktarlarıyla yüksek kaliteli veri toplama ve gerçek zamanlı analiz imkanı sunar.

Diamond Light Source'da Sabit Hedef Seri Veri Toplama

Daha fazla video keşfet