Name: Metabolik Etiketleme ve İnce Tabaka Kromatografisi ile Saccharomyces serevizisinde Nötr Lipid Sentezinin Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Öğrenin, Saccharomyces cerevisiae'de nötr lipid sentezini metabolik etiketleme ve ince tabaka kromatografisi kullanarak analiz etme yöntemini. Bu protokol, lipid metabolizması ve enzim regülasyonunu çalışmak için sağlam bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, bu çalışmanın tamamlanmasında yardım ve kavramsal tavsiyeler için Henne laboratuvarı üyelerine teşekkür eder. W.M.H., Welch Vakfı (I-1873), NIH NIGMS (GM119768), Ara Paresghian Tıbbi Araştırma Fonu ve UT Southwestern Endowed Scholars Programı'ndan fonlarla desteklenmektedir. S.R, bir T32 programı hibesi (5T32GM008297) tarafından desteklenmiştir.

1. Maya hücrelerinin 14C-asetik asit ile büyümesi ve etiketlenerek etiketlenerek
<ol><li>Bir tabaktan bir koloni seçerek ve % 2 dekstroz içeren 20 mL sentetik komple (SC) ortama dağıtarak bir maya kültürünü aşılayın (BKZ. SC ortamı tarifi için Ek Dosya). 200 rpm'de sallanarak bir gece boyunca 30 °C'de kuluçkaya yaslanın. NOT: Büyüme durumu, örnek hacmi ve tedavi, ilgi çekici lipitlere göre farklılık gösterecektir. Tam deneyler yapmadan önce, optimal büyüme koşulları ve kültür hacimleri ampirik olarak belirlenmelidir. Bu protokol, sabit faza yetiştirilen maya kültürlerinin radyolabelingini, biyo-membran ve hücre büyümesinin yavaşladığında bir büyüme aşamasını ve NL sentezinin çok aktif olduğunu tartışır.</li>
	<li>Spektrofotometre kullanarak geceleme kültürünün OD600'ünü ölçün ve maya hücre kültürünü% 2 dekstroz içeren50 mL taze SC medyasında 0,2'nin son OD 600'üne seyreltin. Hücreleri 24 saat boyunca veya sabit faza ulaşana kadar büyütün (genellikle OD600 ölçümünü iki katına çıkaran hücrenin düz bir astarı ile tanımlanır).</li>
	<li>Hücreleri toplamadan önce, söndürme arabelleği yapın (ayrıntılar için Ek Dosya'ya bakın). Her numune için iki adet 20 mL'lik söndürme tamponu yapın (yani, her örnek için 40 mL söndürme tamponu) ve iki adet 50 mL konik tüpe eşit olarak bölün. Söndürme tampon aliquots'u ileride kullanmak üzere -80 °C'de saklayın.</li>
	<li>Kültürler istenen OD veya büyüme aşamasına ulaştıktan sonra, hücreleri 10 dakika boyunca 4.100 x g'da santrifüjleyarak toplayın. Numuneler santrifüjdeyken, dekstrozsuz SC ortamına 10 μCi/mL'lik son konsantrasyonda[1- 14C] asetik asit sodyum tuzu ekleyerek radyolabeling ortamı hazırlayın. DİkKAT: Radyoaktif malzemelerle çalışırken uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) her zaman giyilmelidir. Radyoaktif maddelerin uygun şekilde depolanmasını, kullanımını ve bertaraf edilmesini için her zaman yerel kurallara uyun. NOT: Hem etiketleme ortamındaki 14C-asetik asit konsantrasyonu hem de radyolabeling inkübasyon süresi ilgi çekici metabolitlere göre ayarlanmalıdır. Burada, NL türlerini bir dizi bollukla etiketlemek için yeterli olan 20 dakikalık bir radyolabeling darbe inkübasyonu kullanılır.</li>
	<li>Üstnatantı peletlenmiş hücrelerden çıkarın ve peletin pipetle yeniden canlanarak hücre peletini 20 mL dekstrozsuz SC ortamıyla bir kez yıkayın. 5 dakika boyunca 4.100 x g'da santrifüj yaparak hücreleri tekrar toplayın.</li>
	<li>Hücreleri 1 mL dekstroz içermeyen SC ortamına yeniden boşaltın ve hücreleri etiketli 2 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 2 dakika boyunca 4.100 x g'da santrifüj yaparak hücreleri tekrar toplayın.</li>
	<li>Hücreleri 500 μL dekstroz içermeyen SC medyasında bir kez daha yeniden biriktirin. 50 mL konik borular için donatılmış bir santrifüjü -10 °C'ye veya en düşük sıcaklık ayarına önceden soğutun.</li>
	<li>Her 500 μL hücre süspansiyonuna (son 14C-asetik asit konsantrasyonu = 5 μCi/mL) hızlı bir şekilde 500 μL radyolabeling ortamı ekleyerek radyolabeling dönemine başlayın. Etiketleme süresinin bitiminden 2 dakika önce 30 °C'de dönen bir inkübatörde tüpleri kuluçkaya yaslanın, -80 °C dondurucudan bir kova buz için her numune için bir adet 20 mL'lik söndürme tamponu aktarın</li>
	<li>Radyolabeling süresi sona erdiğinde, 1 mL örneğin tamamını 20 mL soğuk söndürme tamponuna daldırmak için bir pipet kullanın. Numunenin söndürme tamponu ile iyice karıştırıldığından emin olmak için 5-10 sn konik tüpleri vorteks edin. Numuneleri buz üzerinde 2 dakika boyunca söndürme tamponunda kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>-10 °C'ye ayarlanmış 3 dakika boyunca veya en düşük sıcaklık ayarında 5.000 x g'da bir santrifüjde dönerek hücre peletini toplayın. Numune tüpleri dönerken, -80 °C dondurucudan başka bir söndürme tamponu aliquot setini buzla dolu bir kovaya aktarın (yani, numune başına bir adet 20 mL'lik söndürme tamponu tüpü).</li>
	<li>Söndürme tamponu üstnatantı hücre peletlerinden çıkarın ve 20 mL taze, soğuk, söndürme tamponu ile değiştirin. Vorteks ve pelet konik tüpün dibinden yerinden çıkana ve söndürme tamponunda tamamen yeniden depolanana kadar örnekleri çalkalayın. Hücreleri toplamak için numuneleri -10 °C'de 3 dakika boyunca 5.000 x g'da tekrar santrifüjlayın.</li>
	<li>Hücreler peletlendikten sonra, üsttan dökerek ve fazlalıkları bir pipetle çıkararak tüm söndürme tamponunu numunelerden iyice çıkarın. Daha fazla işlem için tüpleri -80 °C'de saklayın.</li>
</ol>2. Toplam lipitlerin mayadan izolesi
NOT: Lipid izolasyonu için aşağıdaki protokol, çoğu nötr lipit türünü verimli bir şekilde ayıklayan köklü ve sık kullanılan bir yönteme dayanmaktadır17,18. DİkKAT: Organik çözücü kullanırken, her zaman uygun KKD giyin ve mümkün olduğunda bir duman davlumbazının içinde çalışın. Lipid ekstraksiyonu sırasında, organik çözücülerle uyumsuz plastikler kullanmaktan kaçının. Polipropilen tüpler aşağıdaki protokol için uygundur.
<ol><li>Her numune için 0,3 g asitle yıkanmış cam boncuk tartın ve bunları buz üzerinde 2 mL mikrosantrifüj tüplerinde saklayın. Hücre topaklarını -80 °C dondurucudan çıkarın ve buzda tutun. Her numuneye 350 μL metanol ve 700 μL kloroform ekleyin, yeniden ıslatın ve önceden tartılmış cam boncuklar içeren mikrosantrifüj tüplerine aktarın.</li>
	<li>Lyse hücreleri, bir girdap üzerindeki tüpleri 1 dakika boyunca 3x ile ajitasyonlar arasında buz üzerinde 30 s inkübasyon ile. Alternatif olarak, hücreler üç 1 dakikalık döngüler için mini boncuk çırpıcı kullanılarak yutlanabilir. Scintillation sayımı için ayrı bir tüpte 25-30 μL tüm hücre lisatını sakla. NOT: Kaydedilen lisat, darbe süresi boyunca her numune tarafından alınan ve TLC plakasına yüklenen her numunenin miktarını etkileyecek olan göreceli radyoizotop miktarını belirlemek için kullanılacaktır. Bu, 3.2 adımında daha fazla tartışılmıştır.</li>
	<li>2 mL mikrosantrifüj tüpünün tüm içeriğini 15 mL cam santrifüj tüpüne [Tüp A] dökün. 2 mL mikrosantrifüj tüplerini 1 mL metanol ekleyerek ve 10-15 sn boyunca girdaplayarak yıkayın. 1 mL metanol yıkamayı A tüpüne aktarın ve A tüpüne 2 mL kloroform ve ardından 4,45 mL'lik son numune hacmi için 400 μL su ekleyin.</li>
	<li>1 dakika boyunca Vortex örnekleri ve ardından 1.000 x g'da5 dakikalık bir santrifüjleme. Santrifüjlemeden sonra, sulu (üst) ve organik (alt) aşamalar, arayüzde yatan hücre kalıntıları ile açıkça görsel olarak ayrılmalıdır.</li>
	<li>Cam pastör pipet kullanarak, organik fazı A tüpünden toplayın ve yeni bir 15 mL cam santrifüj tüpüne (Tüp B) geçin. B tüpüne 1 mL 1M KCl ekleyin. A tüpüne 1 mL metanol ve 2 mL kloroform ve 200 μL MiliQ su ekleyin. A tüpündeki girdap ve santrifüj adımlarını tekrarlayın.</li>
	<li>Organik fazı bir kez daha A tüpünden toplayın ve B tüpüne ekleyin. Vortex tüp B 1 dakika boyunca 1.000 x g'da5 dk santrifüjleme.</li>
	<li>Üst sulu tabakayı B tüpünden çıkarın ve atın. B tüpüne 1 mL taze 1 M KCl ekleyin ve girdap/santrifüjleme adımını tekrarlayın. Katmanlar ayrıldıktan sonra, tüm alt organik tabakayı etiketli 4 mL cam şişeye dikkatlice toplayın. NOT: Bu adımda, lipid özleri -80 °C'de saklanabilir veya lipitlerin TLC ayrımı için protokole devam edilebilir.</li>
</ol>3. Radyoizotop etiketli NL'lerin ince tabaka kromatografisi ile ayrılması ve nicelleştirilmesi
<ol><li>Lipid özleri -80 ° C'ye yerleştirilmişse, yavaşça buzda ve daha sonra bir tezgahta inkübe ederek oda sıcaklığına getirin. Lipid özlerinden elde edilen çözücüyü vakumla kurutarak veya hafif bir inert gaz akışı (örneğin, argon veya azot) kullanarak tamamen buharlaştır. Bu arada, TLC plakasını ısıtmak için fırını 145 °C'ye ısıtın.</li>
	<li>Numuneler TLC plakasına yüklenmeden önce, hücreler tarafından alınan göreceli radyolabel miktarlarını belirleyin. Pipet 10 μL tüm hücrenin 2.2 adımından 6 mL cam scintillation şişesine dökülür, 6 mL scintillation sıvısı ekleyin ve şişeleri bir rafa yerleştirin. 1 dakika sayım süresine ayarlanmış sayım tek raf seçeneğini kullanarak her numunenin cpm veya dpm'sini ölçmek için bir scintillation sayacı kullanın. Her örnek için bir ortalama elde etmek için her hücrenin tamamını yinelenen olarak ölçün. Yükleme miktarını vahşi bir türe veya referans örneğine göre ayarlama NOT: TLC plakasına yüklenecek her numunenin miktarı aşağıdaki denklem kullanılarak belirlenebilir: (ortalama örnek sayıları)/(ortalama referans sayıları) x istenen yükleme hacmi. Örneğin, referans örneğinin 20 μL'si TLC plakasına yüklenecekse ve ortalama 1.000 sayısına sahipse, ortalama sayısı 2.000 olan deneysel bir numunenin TLC plakasına 10 μL'si yüklenecektir.</li>
	<li>Örnek lipitleri 40-50 μL 1:1 (v/v%) kloroform:methanol içinde 5 dakika boyunca girdapla yeniden inşa edin. Cam mezunu bir silindirde mobil faz çözücüsünü 101 mL hazırlayın (50:40:10:1 (v/v%) Hexane:Petrol eter:Dietil eter:Asetik asit çözücü) ile büyük NL türlerinin ayrılması örneği için Temsili Sonuçlar bölümüne bakın).</li>
	<li>Çözücüyü 20 x 20 TLC doygunluk pedi ve sıkı oturan bir kapak içeren bir cam TLC haznesine dökün. Bir kalem kullanarak plakanın altından 1,5 cm yukarıda bir çizgiyi hafifçe işaretleyerek kanallı 20 x 20 silika jel 60 G plaka hazırlayın. Hat, kökeni ve lipitlerin nereye yüklendiğini belirler. Çizginin altında, her şeride yüklenecek örneği hafifçe etiketle. TLC plakası hazırlandıktan sonra, plakayı önceden ısıtmak ve fazla nemi gidermek için plakayı 145 °C fırında en az 30 dakika kuluçkaya bırakın.</li>
	<li>Plaka yeterince ısıtıldıktan ve TLC doygunluk pedi çözücü ile doyurulursa, TLC plakasını fırından çıkarın ve hemen TLC plakasını yüklemeye devam edin. Plakanın sıcakken yüklenmesi hızlı çözücü buharlaşmasını sağlar. İlgi alan her lipit türü için, ayırmayı ve beklenen göç mesafesini izlemek için TLC plakasının bir şeridine 5-20 μg saflaştırılmış lipit standardı yükleyin. Bir pipet kullanarak, TLC plakasının altından 1,5 cm yukarıda bulunan her şeridin kökenine 5μL numuneyi noktalayın. Her şeride 20-40 μL numune yüklenene kadar 5 μL noktanın tekrar yüklenmesi. NOT: 5-20 μg etiketsiz saflaştırılmış lipitler, lipitlerin TLC ayrımından sonra boyanabilen ve görselleştirilebilen izleyiciler olarak her örnek şeride eklenebilir. Lekeli bir standardın varlığı, sonraki scintillation sayımı için radyolabeled lipid bantlarının kolay izlenmesini ve eksizyonunu sağlar. Plakaya hangi saflaştırılmış standartların yüklendiği NL ilgi gören türler tarafından belirlenecektir. Oleik asit (FFA), 1,2 dioleoyl-gliserol (DG), trilein (TG), kolesterol (Chol), kolesteril-linoleat (SE) ve örnek şeritlere bitişik şeritlerde squalene ayırma örnekleri için Temsili Sonuç bölümüne bakın.</li>
	<li>Standart ve deneysel numuneler yüklendikten sonra, plakayı gelişmekte olan odaya yerleştirin ve çözücü plakanın tepesine ulaşana kadar bekleyin (40-60 dk). Plaka tamamen geliştikten sonra, hazneden çıkarın ve duman kaputunda 20 dakika kurumasını bekleyin.</li>
	<li>Plaka kuruduktan sonra plastik filmle örtün ve otoradyografi ekranı ile gelişmekte olan bir kasete yerleştirin. Plakanın 24-48 saat boyunca ekranla gelişmesine izin verin.</li>
</ol>4. TLC ayrılmış lipitlerin görselleştirilmesi ve nicelleştirilmesi
<ol><li>Ekranı gelişmekte olan kasetten çıkarın ve fosfor görüntüleyicinin içine yerleştirin. Fosfor Görüntüleme seçeneğini seçin ve 800-1000 V'ta geliştirin. NOT: Fosfor görüntüleme, TLC plakasındaki radyolabelli lipitlerin nitel bir görünümünü verir. Bununla birlikte, radyolabelli lipitlerin nicelemesi en iyi daha sonra açıklanan scintillation sayımı ile gerçekleştirilir.</li>
	<li>100 mL p-anisaldehit reaktifini karıştırın (ek dosyayabakın) ve bir cam sprey şişesinde biriktirin. Silika doyurulana kadar TLC plakasını p-anisaldehit reaktifi ile püskürtün. Tabağı 145 °C fırında 5 dakika veya bantlar ortaya çıkana kadar pişirin.</li>
	<li>Radyolabel scintillation sayma kullanarak bireysel lipid türlerini ölçmek için, silika jelini cam TLC plakasından kazımak için bir jilet kullanın. Tek bir radyolabeled lipid türüne karşılık gelen her silika jel bandını bir cam scintillation şişesine aktarın ve 6 mL scintillation sıvısı ekleyin. Silika bandı küçük parçalara indirgenene kadar güçlü bir şekilde girdap.<ol>
<li>Alternatif olarak, lipitler bölüm 3'teki lipit ekstraksiyon protokolü kullanılarak silika jel bandından çıkarılabilir. Lipitler silika jelden çıkarılırsa, çözücüyü tamamen adım 3.1'deki gibi buharlaştırın ve kurutulmuş lipitlere 6 mL scintillation sıvısı ekleyin. Scintillation şişeleri içeren rafı bir scintillation sayacına yerleştirin. Tek rafı say seçeneğini belirleyin ve sayım süresini şişe başına 2 dakika olarak ayarlayın. Scintillation sayacından elde edilen sonuçlar yazdırılır ve çubuk grafik olarak görselleştirilebilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Konige, M., Wang, H., Sztalryd, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+adipose+specific+lipid+droplet+proteins+in+maintaining+whole+body+energy+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Role of adipose specific lipid droplet proteins in maintaining whole body energy homeostasis.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1842 (3), 393-401 (2014).</li>
<li>Arrese, E. L., Saudale, F. Z., Soulages, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+as+signaling+platforms+linking+metabolic+and+cellular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Lipid+Insights%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets as signaling platforms linking metabolic and cellular functions.</a> Lipid Insights. 7, 7-16 (2014).</li>
<li>Walther, T. C., Chung, J., Farese, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet biogenesis.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 491-510 (2017).</li>
<li>Olzmann, J. A., Carvalho, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+and+functions+of+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamics and functions of lipid droplets.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (3), 137-155 (2019).</li>
<li>Krahmer, N., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+the+fat%3A+lipid+droplets+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Balancing the fat: lipid droplets and human disease.</a> EMBO Molecular Medicine. 5 (7), 973-983 (2013).</li>
<li>Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenesis+of+atherosclerosis%3A+A+perspective+for+the+1990s%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The pathogenesis of atherosclerosis: A perspective for the 1990s.</a> Nature. 362 (6423), 801-809 (1993).</li>
<li>Zhang, C., Liu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+droplet%3A+A+conserved+cellular+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+%26+Cell%22%5BJournal%5D)">The lipid droplet: A conserved cellular organelle.</a> Protein & Cell. 8 (11), 796-800 (2017).</li>
<li>Wältermann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+lipid-body+formation+in+prokaryotes%3A+How+bacteria+fatten+up%3A+Lipid-body+formation+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of lipid-body formation in prokaryotes: How bacteria fatten up: Lipid-body formation in prokaryotes.</a> Molecular Microbiology. 55 (3), 750-763 (2004).</li>
<li>Borrull, A., López-Martínez, G., Poblet, M., Cordero-Otero, R., Rozès, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+separation+and+quantification+of+neutral+lipid+species+using+GC-MS%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Lipid+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">A simple method for the separation and quantification of neutral lipid species using GC-MS.</a> European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (3), 274-280 (2015).</li>
<li>Kotapati, H. K., Bates, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+phase+HPLC+method+for+combined+separation+of+both+polar+and+neutral+lipid+classes+with+application+to+lipid+metabolic+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+B%2C+Analytical+Technologies+in+the+Biomedical+and+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Normal phase HPLC method for combined separation of both polar and neutral lipid classes with application to lipid metabolic flux.</a> Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 1145, 122099(2020).</li>
<li>Knittelfelder, O. L., Weberhofer, B. P., Eichmann, T. O., Kohlwein, S. D., Rechberger, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+ultra-high+performance+LC-MS+method+for+lipid+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">A versatile ultra-high performance LC-MS method for lipid profiling.</a> Journal of Chromatography B. 951-952, 119-128 (2014).</li>
<li>Ruiz, J. I., Ochoa, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+in+the+subnanomolar+range+of+phospholipids+and+neutral+lipids+by+monodimensional+thin-layer+chromatography+and+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Quantification in the subnanomolar range of phospholipids and neutral lipids by monodimensional thin-layer chromatography and image analysis.</a> Journal of Lipid Research. 38 (7), 1482-1489 (1997).</li>
<li>Bui, Q., Sherma, J., Hines, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+high+performance+thin+layer+chromatography-densitometry+to+study+the+influence+of+the+prion+%5BRNQ%2B%5D+and+its+determinant+prion+protein+Rnq1+on+yeast+lipid+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Separations%22%5BJournal%5D)">Using high performance thin layer chromatography-densitometry to study the influence of the prion [RNQ+] and its determinant prion protein Rnq1 on yeast lipid profiles.</a> Separations. 5 (1), 5010006(2018).</li>
<li>Pronk, J. T., de Steensma, H., Van Dijken, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyruvate+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Pyruvate metabolism in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 12 (16), Chichester, England. 1607-1633 (1996).</li>
<li>Buttke, T. M., Pyle, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+unsaturated+fatty+acid+deprivation+on+neutral+lipid+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Effects of unsaturated fatty acid deprivation on neutral lipid synthesis in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Bacteriology. 152 (2), 747-756 (1982).</li>
<li>Touchstone, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-layer+chromatographic+procedures+for+lipid+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%3A+Biomedical+Sciences+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Thin-layer chromatographic procedures for lipid separation.</a> Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 671 (1-2), 169-195 (1995).</li>
<li>Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+the+isolation+and+purification+of+total+lipides+from+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues.</a> The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).</li>
<li>Breil, C., Abert Vian, M., Zemb, T., Kunz, W., Chemat, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Bligh+and+Dyer%22+and+Folch+methods+for+solid-liquid-liquid+extraction+of+lipids+from+microorganisms.+Comprehension+of+solvatation+mechanisms+and+towards+substitution+with+alternative+solvents%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">"Bligh and Dyer" and Folch methods for solid-liquid-liquid extraction of lipids from microorganisms. Comprehension of solvatation mechanisms and towards substitution with alternative solvents.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (4), 708(2017).</li>
<li>Fuchs, B., Süß, R., Teuber, K., Eibisch, M., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+analysis+by+thin-layer+chromatography-A+review+of+the+current+state%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Lipid analysis by thin-layer chromatography-A review of the current state.</a> Journal of Chromatography A. 1218 (19), 2754-2774 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar bu makalenin hazırlanmasında rakip bir çıkar olmadığını beyan eder.

Burada, mayadaki NL türlerinin sentezini nicel olarak izlemek için çok yönlü bir radyolabeling protokolü sunulmuştur. Bu protokol çok modülerdir, bu da prosedürün 3-6 gün içinde bitmesine izin verir. Ek olarak, kullanıcının TLC solvent sistemlerinin basit bir değişikliği ile ilgi çekici birkaç lipit türünü tespit etmesine izin vermeli olan lipit türlerini ve metabolitleri ayırmak için TLC kullanımı hakkında çok sayıda literatürvardır 16,19. Bu protokol radyolabel...

Asetil-CoA, membran oluşturmak, ATP üretmek ve hücre sinyalini düzenlemek için çok yönlü bir biyomoleküler para birimi olarak hizmet veren nötr lipitler (NL' ler) dahil olmak üzere çeşitli biyomoleküllerin temel yapı taşıdır1,2. Bu ilgili yollardan herhangi birine sokılacak NL'lerin kullanılabilirliği, kısmen depolamaları tarafından düzenlenir. Lipid damlacıkları (LD'ler), trigliseritlerin hidrofobik çekirdeklerinden (TG' ler) ve sterol esterlerinden (SE) oluşan sitoplazmik organeller, çoğu hücresel NCI'nın ana depolama bölmeleridir. Bu nedenle, LD'ler, biyokimyasal ve metabolik süreçler için bozulabilen ve daha sonra kullanılabilecekNL'leriinzal eder ve düzenler 3,4. NL ve LD ilişkili proteinlerin yanlış düzenlenmesinin lipodystrofi ve metabolik sendromlar5,6dahil olmak üzere patolojilerin başlangıcı ile ilişkili olduğu bilinmektedir. Bu nedenle, mevcut LD araştırmaları yoğun bir şekilde NL sentezinin mekansal, zamansal ve çok hücreli organizmaların farklı dokularında nasıl düzenlendiğine odaklanmıştır. NL'ler için her yerde bulunan hücresel roller nedeniyle, NL'lerin sentezi ve düzenlenmesinden sorumlu birçok enzim ökaryotlar boyunca korunur7. Gerçekten de, bazı prokaryotes bile LD'lerde NL'leri depolar8. Bu nedenle, Saccharomyces cerevisiae (tomurcuklanan maya) gibi genetik olarak çekilebilir model organizmalar NL sentezi ve regülasyonu için yararlı olmuştur.
NL'lerin hücre özlerinden ayrılması ve nicelleştirilmesi, gaz kromatografisi-kütle spektrometresi (GC-MS), yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ve ultra performanslı sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (UPLC-MS) 9,10,11dahil olmak üzere sayısız şekilde gerçekleştirilebilir. NL'leri ayırmak için belki de en basit yöntem, standart bir eğri12 , 13'ten sonraki densitometrik niceleme sağlayan ince tabaka kromatografisi (TLC) yoluyladır. TLC, NL'lerin yalnızca ders taneli bir ayrımını sağlasa da, ucuz olduğu için güçlü bir teknik olmaya devam eder ve AYNı anda birkaç örnekten NL'lerin hızlı bir şekilde ayrılmasına izin verir. TLC aracılığıyla NIS'lerin incelenmesinin karşılaştığı en önemli zorluklardan ikisi şunlardır: 1) NL türlerinin ve aralarının geniş hücresel bolluk yelpazesi ve 2) NL sentez yolları içindeki lipid aralarının hidrofililik / hidrofobikliği aralığı. Sonuç olarak, NL türlerinin TLC aracılığıyla nicelemesi tipik olarak en bol türlerle sınırlıdır; bununla birlikte, 14C-asetik asit radyolabelinin tanıtılması, NL yollarında düşük bolluklu ara maddelerin tespitini önemli ölçüde artırabilir. Asetik asit, asetil-CoA sentezi ACS214tarafından hızla asetil-CoA'ya dönüştürülür, bu da 14C-asetik asidi mayada uygun bir radyolabelingsubstratı yapar 15. Ek olarak, hem hidrofobik NCI'lerin hem de NL'lerin hidrofilik aralarının ayrılması, çoklu solvent sistemleri kullanılarak TLC tarafından elde edilebilir16. Burada, mayada 14C-asetik asit metabolik etiketleme kullanılarak NL'lerin ayrılması için bir yöntem sunulmuştur. Nabız döneminde etiketlenen lipitler daha sonra iyi kurulmuş bir toplam lipid izolasyon protokolü17, ardından NL türlerinin TLC ile ayrılması. Etiketli lipitleri görselleştirmek için hem otoradyografi hem de toplam lipitleri görselleştirmek için kimyasal bir sprey ile TLC plakalarının geliştirilmesi, birden fazla niceleme yöntemine izin sağlar. Bireysel lipid bantları da jilet kullanılarak TLC plakasından kolayca çıkarılabilir ve bant içindeki radyolabelli malzeme miktarını ölçmek için scintillation sayımı kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>[1-C14] Asetik asit sodyum tuzu spesifik aktivite: 45-60mCi</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC084H001MC</td><td></td></tr><tr><td>18: 1 1,2 dioleoil-sn-gliserol</td><td>Avanti</td><td>800811O</td><td></td></tr><tr><td>200 kanıt mutlak etanol</td><td>Sigma</td><td>459836</td><td></td></tr><tr><td>Asitle yıkanmış cam boncuklar 425-600um</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Pastuer pipetler için kehribar ampuller</td><td>Fisher</td><td>03-448-24</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum Sülfat >% 99</td> <td>Sigma</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>Beckman LS6500 sintilasyon sayacı</td><td>PerkinElmer</td><td>A481000</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform (HPLC sınıfı)</td> <td>Fisher</td><td>C607SK</td><td></td></tr><tr><td>Kolesterol >% 99</td> <td>Sigma</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>Kolesteril-linoleat >% 98</td> <td>Sigma</td><td>C0289</td><td></td></tr><tr><td>Konsantre sülfürik asit</td><td>Sigma</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>Corning 50mL konik borular, santrifüj kapaklı polipropilen</td><td>Sigma</td><td>CLS430829</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroz, susuz sınıf</td><td>Sigma</td><td>D9434</td><td></td></tr><tr><td>Dietil eter susuz sınıf</td><td>Sigma</td><td>296082</td><td></td></tr><tr><td>Kurutma fırını</td><td>Fisher</td><td>11-475-155</td><td></td></tr><tr><td>EcoLume sintilasyon sıvısı</td><td>VWR</td><td>IC88247001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5424R santrifüj</td><td>Fisher</td><td>05-401-205</td><td></td></tr><tr><td>GE Depolama fosfor ekranı</td><td>Sigma</td><td>GE28-9564-75</td><td></td></tr><tr><td>GE Typhoon FLA9500 görüntüleyici</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buzlu asetik asit, ACS sınıfı</td><td>Sigma</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Cam 6mL sintilasyon şişeleri</td><td>Sigma</td><td>M1901</td><td></td></tr><tr><td>Cam santrifüj tüp kapakları</td><td>Fisher</td><td>14-595-36A</td><td></td></tr><tr><td>Cam santrifüj tüpleri</td><td>Fisher</td><td>14-595-35A</td><td></td></tr><tr><td>Cam Pastör pipeti</td><td>Fisher</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>Hekzan, susuz sınıf</td><td>Sigma</td><td>296090</td><td></td></tr><tr><td>L-Adenin >%99</td> <td>Sigma</td><td>A8626</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanin %>98</td> <td>Sigma</td><td>A7627</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginin %>99</td> <td>Sigma</td><td>A1270000</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparagin %>98</td> <td>Sigma</td><td>A0884</td><td></td></tr><tr><td>L-Aspartat %>98</td> <td>Sigma</td><td>A9256</td><td></td></tr><tr><td>L-Sistein %>97</td> <td>Sigma</td><td>W326305</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamik asit monosodyum tuzu monohidrat %>98</td> <td>Sigma</td><td>49621</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin %</td><td>>99Sigma</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>L-Glisin %>99</td> <td>Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidin %>99</td> <td>Sigma</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>L-İzolösin %>98</td> <td>Sigma</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>L-Lösin %>98</td> <td>Sigma</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>L-Lizin %>98</td> <td>Sigma</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>L-Metionin, HPLC sınıfı</td><td>Sigma</td><td>M9625</td><td></td></tr><tr><td>L-Fenilalanin, reaktif sınıfı</td><td>Sigma</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>L-Prolin %>99</td> <td>Sigma</td><td>P0380</td><td></td></tr><tr><td>L-Serin >%99</td> <td>Sigma</td><td>S4500</td><td></td></tr><tr><td>L-Theronine, reaktif sınıfı</td><td>Sigma</td><td>T8625</td><td></td></tr><tr><td>L-Triptofan %>98</td> <td>Sigma</td><td>T0254</td><td></td></tr><tr><td>L-Tirozin %>98</td> <td>Sigma</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>L-Urasil %>99</td> <td>Sigma</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>L-Valin %>98</td> <td>Sigma</td><td>V0500</td><td></td></tr><tr><td>Metanol, ACS sınıfı</td><td>Fisher</td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td>Oleik asit >%99</td> <td>Sigma</td><td>O1008</td><td></td></tr><tr><td>p-anyaldehit</td><td>Sigma</td><td>A88107</td><td></td></tr><tr><td>Petrol eteri, ACS sınıfı</td><td>Sigma</td><td>184519</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatidilkolin, dipalmitoil >%99</td> <td>Sigma</td><td>P1652</td><td></td></tr><tr><td>Pipetler</td><td>Eppendorf</td><td>2231000713</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür, ACS sınıfı</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit peletleri, sertifikalı ACS</td><td>Fisher</td><td>S318-100</td><td></td></tr><tr><td>Skualen %>98</td> <td>Sigma</td><td>S3626</td><td></td></tr><tr><td>Süksinik Asit kristal/sertifikalı</td><td>Fisher</td><td>110-15-6</td><td></td></tr><tr><td>TLC doygunluk pedi</td><td>Sigma</td><td>Z265225</td><td></td></tr><tr><td>TLC silika jel 60G cam kanallı plaka</td><td>Fisher</td><td>NC9825743</td><td>Floresan gösterge yok</td></tr><tr><td>Şeffaf plastik film</td><td>Apollo</td><td>829903</td><td></td></tr><tr><td>Trisin</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Triolein >% 99</td> <td>Sigma</td><td>T7140</td><td></td></tr><tr><td>Vorteks karıştırıcı</td><td>Fisher</td><td>02-215-414</td><td></td></tr><tr><td>Whatman pozlama kaseti</td><td>Sigma</td><td>WHA29175523</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum sülfat ve amino asitler içermeyen maya azot bazı</td><td>Sigma</td><td>Y1251</td><td></td></tr></tbody></table>

metabolik etiketleme ve İnce tabaka kromatografisi ile saccharomyces serevizisinde nötr lipid sentezinin analizi

Analysis of Neutral Lipid Synthesis in Saccharomyces cerevisiae by Metabolic Labeling and Thin Layer Chromatography

Nötr lipitler (NL'ler), enerji ve lipid homeostazında kilit roller oynayan hidrofobik, şarjsız biyomoleküller sınıfıdır. NL'ler asetil-CoA'dan sentezlenir de novo ve öncelikle ökaryotlarda trigliseritler (TG' ler) ve sterol esterleri (SE' ler) şeklinde bulunur. NL'lerin sentezinden sorumlu enzimler, Saccharomyces cerevisiae'den (maya) insanlara yüksek oranda korunur ve mayayı NL metabolizma enzimlerinin işlevini ve düzenlemesini parçalamak için yararlı bir model organizma haline getirir. Asetil-CoA'nın çeşitli NL türlerine nasıl dönüştürüldüğü hakkında çok şey bilinmesine gerek varken, NL metabolizma enzimlerini düzenleme mekanizmaları ve yanlış düzenlemenin hücresel patolojilere nasıl katkıda bulunabileceği hala keşfedilmektedir. NL türlerinin izolasyonu ve karakterizasyonu için onlarca yıllık araştırmalar boyunca çok sayıda yöntem geliştirilmiş ve kullanılmıştır; bununla birlikte, büyük NL türlerinin kapsamlı karakterizasyonu için nicel ve basit bir protokol tartışılmamıştır. Burada, mayadaki büyük NL türlerinin de novo sentezini ölçmek için basit ve uyarlanabilir bir yöntem sunulmuştur. Fizyolojik açıdan önemli NL'lerin çeşitli aralıklarını ayırmak ve ölçmek için ince tabaka kromatografisi ile birleştirilmiş 14C-asetik asit metabolik etiketleme uyguluyoruz. Ayrıca, bu yöntem NL enzimlerinin in vivo reaksiyon oranlarını veya NL türlerinin zaman içinde bozulmasını incelemek için kolayca uygulanabilir.

Bu protokolde, NL türlerinin etiketlenmesi, tespiti ve niceliğinin 14C-asetik asit metabolik etiketleme ile gerçekleştirilebileceğini göstermiş olduk. Büyük NL türleri 50:40:10:1 (v/v/v%) Heksan:Petrol eter:Dietil eter:Asetik asit (Şekil 1A,B)çözücü sisteminde ayrılabilir. Fosfor görüntüleme, etiketli serbest yağ asidi (FFA), triyasilgliserol (TG), diacylglycerol (DG), kolesterol (Chol) ve squalene (SQ) görselleştirilmesine izin verir (Şekil 1...

Burada, nötr lipitlerin ayrılması için ince tabaka kromatografisi ile birleştirilen 14C-asetik asit ile mayanın metabolik etiketlemesi için bir protokol sunulmaktadır.

Metabolik Etiketleme ve İnce Tabaka Kromatografisi ile Saccharomyces serevizisinde Nötr Lipid Sentezinin Analizi

Neutral lipids (NLs) are a class of hydrophobic, chargeless biomolecules that play key roles in energy and lipid homeostasis. NLs are synthesized de ...

Bu teknik, çoğu laboratuvar ortamında yaygın olarak bulunan aletleri kullanır ve aynı anda birkaç numunenin analizini sağlar. Bu yöntem, lipid metabolizması enzimlerinin hücresel bağlamda ve farklı genetik arka planlarda nasıl düzenlendiği hakkında önemli içgörüler sağlayabilir. Bir koloniyi bir maya kültür plakasından% 2 dekstroz içeren 20 mililitre SC ortamına aşıla ve 200 rpm'de sallanarak bir gecede 30 santigrat derecede kuluçkaya yatır.Ertesi gün, kültürü 50 mililitre taze ortamda 0,2'lik son bir OD'ye seyreltin ve sabit faza ulaşılana kadar 24 saat boyunca büyütün. Her örnek için iki adet 20 mililitrelik söndürme tamponu hazırlayın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Aynı zamanda, mililitre başına 10 mikrokürie'lik son konsantrasyonda dekstroz içermeyen SC ortamına asetik asit sodyum tuzu ekleyerek radyolabeling ortamı hazırlayın.Hücreleri 10 dakika boyunca 4,100 x g'da santrifüjleyarak toplayın. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini 20 mililitre dekstroz içermeyen SC ortamıyla bir kez yıkayın. Hücreleri beş dakika boyunca 4, 100 x g'da santrifüjleyarak tekrar toplayın ve dekstroz içermeyen ortam kullanarak etiketli iki mililitre mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Hücreleri iki dakika daha santrifüjleyin. Hücreleri 500 mikrolitre dekstrozsuz SC ortamına yeniden boşaltın ve her hücre süspansiyonu için hızlı bir şekilde 500 mikrolitre radyolabeling ortamı ekleyerek radyolabeling dönemine başlayın. Tüpleri 30 santigrat derecede dönen bir inkübatörde 20 dakika kuluçkaya yatırın.Bu arada, 50 mililitre konik tüp için donatılmış santrifüjü eksi 10 santigrat dereceye kadar önceden soğutun ve bir adet 20 mililitrelik söndürme tamponu çözün. Radyolabeling süresi sona erdiğinde, bir mililitrelik numunenin tamamını buzdaki çözülmüş söndürme tamponuna daldırmak için bir pipet kullanın. Üç dakika boyunca 5.000 x g'da önceden soğutulmuş bir santrifüjde dönerek hücre peletini toplayın ve 20 mililitre taze soğuk söndürme tamponu ekleyin.Vortex ve söndürme tamponunda tamamen yeniden dirsinmek için örnekleri sallayın ve hücreleri toplamak için örnekleri tekrar santrifüj edin. Hücreler peletlendikten sonra, üsttan dökerek ve fazlalıkları bir pipetle çıkararak tüm söndürme tamponunu numunelerden iyice çıkarın. Daha fazla işlem için tüpleri eksi 80 santigrat derecede saklayın.Her örnek için 0,3 gram asitle yıkanmış cam boncukları tartın ve buz üzerinde iki mililitre mikrosantrifüj tüpünde saklayın. Hücre topaklarını eksi 80 derecelik dondurucudan çıkarın ve buza yerleştirin. Daha sonra, her numuneye 350 mikrolitre metanol ve 700 mikrolitre kloroform ekleyin ve hücreleri yeniden biriktirin.Bunları önceden tartılmış cam boncuklar içeren mikro santrifüj tüplerine aktarın. Hücreleri bir dakika boyunca üç kez girdaplayarak, ajitasyonlar arasındaki buzda 30 saniye inkübasyon ile lyse. Hücreleri 15 mililitrelik bir cam santrifüj tüpüne dökün ve tüpü A.Tüp A olarak etiketleyin Mikrosantrifüj tüpünü bir mililitre metanol ile yıkayın, vorteksleyin ve metanolünü A tüpüne dökün.Örnekleri bir dakika boyunca girdaplayın ve ardından 1000 x g'da beş dakikalık bir santrifüjleme ile sulu ve organik aşamaları arayüzde yatan hücre kalıntılarıyla net bir şekilde ayırın. Cam mera pipeti kullanarak, organik fazı B etiketli yeni bir cam santrifüj tüpüne toplayın ve bir mililitre azı dişi potasyum klorür ekleyin. A tüpüne bir mililitre metanol ve iki mililitre kloroform ekleyin ve girdap ve santrifüj adımlarını tekrarlayın.Sulu ve organik fazı ayırmak için girdap ve santrifüj tüpü B. Üst sulu tabakayı çıkarın ve tüm alt organik tabakayı dört mililitrelik bir cam şişeye toplayın. Lipid özlerindeki çözücüyü inert gaz altında kurutarak tamamen buharlaştırın ve TLC plakasını ısıtmak için fırını 145 santigrat dereceye kadar önceden ısıtın.Hücreleri TLC plakasına yüklemeden önce hücreler tarafından alınan göreceli radyolabel miktarlarını belirleyin. Örnek lipitleri 40 ila 50 mikrolitre kloroform ve metanolde beş dakika boyunca girdaplayarak bire bir oranında yeniden inşa edin. Cam mezunu bir silindirde 101 mililitre mobil faz çözücü hazırlayın.Ardından, çözücüyü 20 x 20 TLC doygunluk pedi ve sıkı bir montaj kapağı içeren bir cam TLC haznesine dökün. Kanallı bir 20'ye 20 silika jel 60G plaka hazırlayın ve bir kalem kullanarak plakanın altından 1,5 santimetre yukarıda bir çizgi işaretleyin. Plaka yeterince ısıtıldıktan ve TLC doygunluk pedi çözücü ile doyuruldıktan sonra, TLC plakasını fırından çıkarın ve hemen yüklemeye devam edin.Bir pipet kullanarak, TLC plakasının dibinden 1,5 santimetre yukarıda bulunan her şeridin kökenine beş mikrolitre numune tespit edin ve her şeride 20 ila 40 mikrolitre numune yüklenene kadar tekrar yüklemeyi tekrarlayın. Standart ve numuneler yüklendikten sonra, plakayı gelişmekte olan odaya yerleştirin ve çözücü plakanın tepesine ulaşana kadar bekleyin. Plaka tamamen geliştirildiğinde, hazneden çıkarın ve duman kaputunda 20 dakika kurumasını bekleyin.Plaka kuruduktan sonra plastik filmle örtün ve otoradyografi ekranı ile gelişmekte olan bir kasete yerleştirin. Ekranı gelişmekte olan kasetten çıkarın ve fosfor görüntüleyicinin içine yerleştirin. TLC plakasını silika doyurulana kadar p-Anisaldehit reaktifi ile püskürtün, ardından 145 derece fırında beş dakika veya bantlar ortaya çıkana kadar pişirin.Lipid türlerini ölçmek için, bireysel lipit türlerini içeren silika jelini kazıyın ve cam scintillation şişelerine aktarın. Silika bandı küçük parçalara indirgenene kadar altı mililitre scintillation sıvısı ve girdabı kuvvetlice ekleyin. Scintillation şişeleri ile rafı bir scintillation sayacına yerleştirin ve sayım süresini şişe başına iki dakikaya ayarlayarak sayın.Fosfor görüntüleme, etiketsiz yağ asidi, triacylglycerol, diacylglycerol, kolesterol ve squalane otoradyogramının görselleştirilmesine izin verir. Bu yöntemde saflaştırılmış lipit türlerinin ayrılabileceği ve daha sonra TLC plakasının p-Anisaldehit reaktifi ile püskürtülmesiyle görselleştirilebileceği gösterilmiştir. Görselleştirilmiş türler, steril esterlere ek olarak daha önce bahsedilen tüm lipitleri içerir.Nabzı takip eden radyolabel içermeyen medyada 10 dakikalık bir kovalama süresi uygulanarak, majör squalane havuzunda gözlendi ve toplam kolesterol yükseldi. Benzer şekilde, kovalama döneminde diacylglycerol görünümü serbest yağ asitleri sinyalinde bir azalma ile ilişkilidir. Tam protokolü gerçekleştirmeden önce, hücrelerin büyüme durumunda ve ilginin genetik arka planında asetik asit radyolabelini alıp almayacağını belirlemek önemlidir.

analysis-neutral-lipid-synthesis-saccharomyces-cerevisiae-metabolic

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Burada Saccharomyces cerevisiae protein kompleksleri tanımlamak için yeni bir nicel proteomik tekniği açıklar. Bu çalışmada, yüksek özgüllük ile bir ER protein, Scs2p bağlayıcı ortakları tanımlamak için tandem kütle spektrometresi tarafından takip yakınlık arıtma ile birlikte SILAC yöntemi kullandık.

S. cerevisiae, kantitatif proteomik protein kompleksleri tanımlanması

Biz maya kullanarak anket-tarama elektrosprey iyonizasyon kütle spektrometresi (ESI / MS) gibi çok sayıda lipid türlerinin belirlenmesi için yeni bir nicel lipidomics yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, şu anda, lipidler, hassasiyet ve hız çeşitli moleküler formları çözmek için yeteneği lipid tanımlanması ve ölçülmesi için kullanılabilir yöntemleri aşıyor.

Nicel Değerlendirme Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometresi kullanarak Maya Lipidome

Bağışıklık, organlar ve hücreler içinde glycosphingolipid antijenlerin ekspresyonu profili içgörü kazanmak için bir spesifik ve duyarlı bir yöntem açıklanmıştır. Yöntem, kimyasal olarak sentezlenmiş bir standartlarına göre yapısal analizi için glycosphingolipid moleküllerinin adım adım parçalanma sağlayan iyon tuzak kütle spektrometri avantajına sahiptir.

Glycosphingolipid Antijenler Kütle Spektrometrik Analizi

Biz eğitim için sağlam biyokimyasal ve mikroskobik yöntemler...

Fat Kütle Biyokimyasal ve Yüksek Verimli Mikroskobik Değerlendirme<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

Burada tam 15 N etiketli Arabidopsis thaliana hücre kültürleri etiketlenmemiş bir karışımına dayanan deterjan dayanıklı ve deterjan çözünür membran içine bitki plazma zarlarının parçalanması için ve in vivo güçlü bir yöntem açıklanmaktadır. Prosedür sinyal süreçleri anlamak için karşılaştırmalı proteomik çalışmalar için uygulanır.

Mukayeseli Proteomik Analizi Metabolik Etiketleme ve Membran Fraksiyonasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Süspansiyon Hücre Kültürleri

Burada, triacylglycerols hücrelerdeki yüksek üretilen iş deneylerde kültürlü dinamiklerini incelemek için lipid damlacık dizin (LD dizini) elde etmek için bir protokol açıklayın. LD dizin tahlil BODIPY 493/503 kullanır kolay ve güvenilir bir yöntemdir. Bu tahlil dispendious lipid çekme ya da mikroskobu analiz ihtiyacı yok.

Lipid dizin belirlenmesi mantar patojen Ustilago Maydis sıvı Floresans kurtarma tarafından

Burada, floresan mikroorganizma ve tomurcuklanan Maya hücrelerinin floresans mikroskopisi görüntülerinin otomatik algılama ve niceliksel tanımı ile ilgili bir MATLAB uygulaması sunuyoruz.

Otomatik görüntü Işleme kullanarak Fission ve budding yeasts lipid damlacık Içeriğinin Analizi

Saccharomyces cerevisiae'dekimajör hücresel lipitleri tanımlamak ve ölçmek için tandem kütle spektrometresi ile birleşen sıvı kromatografi kullanılarak bir protokol sayılmaktadır. Bir maya hücresi içindeki majör lipid sınıflarının nicel bir değerlendirme için açıklanan yöntem çok yönlü, sağlam ve duyarlıdır.

Tandem Kütle Spektrometresi Ile Birleşen Sıvı Kromatografi kullanarak Saccharomyces Cerevisiae'nin Hücresel Lipidomukan Analizi

Baker mayası mitokondriyal genom sekiz polipeptid kodlar. Mevcut protokolün amacı, hepsini etiketlemek ve daha sonra bunları ayrı bantlar olarak görselleştirmektir.

Fırıncı Maya saccharomyces cerevisiae Mitokondriyal Genom İfade Ürünlerinin Etiketlenmesi ve Görselleştirilmesi

Protokoller, karmaşık lisat bazlı hücre içermeyen sistemlerde metabolik reaksiyonları incelemek için kırma indeksi veya kütle spektrometrik tespiti ile birleştiğinde yüksek performanslı sıvı kromatografi yöntemlerini açıklar.

Sıvı Kromatografisi, Lysate Tabanlı Hücre içermeyen Sistemlerde Metabolit Profilleme için Kırılma İndeksi veya Kütle Spektrometrik Algılaması ile Birleştirilmiştir

Öğrenin, Saccharomyces cerevisiae'de nötr lipid sentezini metabolik etiketleme ve ince tabaka kromatografisi kullanarak analiz etme yöntemini. Bu protokol, lipid metabolizması ve enzim regülasyonunu çalışmak için sağlam bir yaklaşım sunar.

Metabolik Etiketleme ve İnce Tabaka Kromatografisi ile Saccharomyces serevizisinde Nötr Lipid Sentezinin Analizi

Daha fazla video keşfet