Önceden Biçimlendirilmiş Mikrobubbles'tan Membran Filtreli Faz KaydırmaLı Decafluorobutane Nanodroplets Üretimi

Bu protokol, biyomedikal uygulamalarda kullanılmak üzere düşük kaynama noktası buharlaştırılabilir damlacıkların polidispersitesini azaltmanın kolay bir yöntemidir. Bu teknik, önceden biçimlendirilmiş gaz mikrobubbles yoğunlaştırmak ve kontrol edilebilir, ölçeklenebilir ve nispeten uygun maliyetli bir şekilde boyuta göre elde sıvı damlacıkları filtreler. Bu yöntem, nihai damlacık boyutunu kontrol etmek için farklı filtreler kullanılarak farklı kabuk ve gaz malzemesine sahip çeşitli lipid mikrobubbles için uygulanabilir.

Prosedürü gösteren, Dr. Sirsi'nin laboratuvarından lisans araştırmacısı Darrah Merillat olacak. Sonicator için güç anahtarını açın ve genliği mikro uç ataşmanını kullanarak izin verilen maksimum değere ayarlayın ve sonikasyon süresinin 10 saniye olarak ayarlandığından emin olun. Sıcak hidratlı lipit çözeltisini yüzeyin hemen altındaki mikro uçlu ses muhafazasına yerleştirin.

DFB tank çıkışındaki gazı muhafazada tutulan sıcak lipit çözeltisine yönlendirmek için şişenin boynuna uygun bir boru uzunluğu takın. Gaz lipit çözeltisi üzerinde akarken görülene kadar tank vanasını yavaşça açın ve sıvının yüzeyinde hafif dalgalanmalara neden olun. Gaz akışı çok yüksekse, çözelti mikrobubble oluşumu sırasında taşacaktır.

Sonicator'ı başlatın ve mikrobubbles oluşturmak için sürekli olarak 10 saniye çalıştırın. Sonication bittikten sonra, hemen DFB tank vanasını kapatın. Mikrobubble çözeltisini hızla kaplayın ve numuneyi 55 santigrat derecenin altında soğutmak için şişeyi bir buz banyosuna batırın.

Yüksek basınçlı ekstrüderi kullanım kılavuzuna göre monte etmek için 200 nanometre seramik filtre kullanın ve numune çıkış borusunun yana bastırilmemesi veya kıvrışmaması için su geçirmez bir kabın ortasına yerleştirin. Ekstrüderi, üretici tarafından sağlanan adaptörü kullanarak azot gazı tankına birleştirir. Ekstrüde numuneyi toplamak için çıkış tüpünün ucunu bir scintillation şişesine yerleştirin, tüpü şişenin içinde kalmak için bantla kabın içine sabitleyin.

Ekstrüder içinde basınç olmadığından emin olmak için serbest bırakma vanasını açın ve kapatın. Odanın kapağını çıkarın. Ve ekstrüder odasına beş mililitre PBS ekleyin.

Kapağı değiştirin, güvenli bir şekilde yerine tıklamasını sağlayın. Azot gazı tankını açın, böylece basınç göstergesi 250 PSI okur ve basınç kontrol vanasının kapalı konumda olduğundan emin olun. Gaz tankını kapatın ve ekstrüder odası giriş vanasını açın, PBS çözeltisinin sistemden itilmesine ve numune çıkış tüpünün scintillation şişesine dışarı itilmesine neden olun.

Borudan sadece gaz çıkarken, serbest bırakma vanasını açın ve basıncın sıfır PSI'a düşmesine izin verin. Sonra scintillation şişesini çıkarın. Ekstrüder içinde basınç olmadığından emin olmak için serbest bırakma vanasını açıp kapatın ve çıkış tüpünün ucuna yeni bir scintillation şişesi yerleştirin.

Çelik bir kabı 2 metilbütan ile doldurun ve sıcaklığı eksi 18 santigrat dereceye düşürmek için kuru buz ekleyin. Mikrobubble çözeltisini soğutulmuş 2 metilbütan içine yerleştirin ve numuneyi iki dakika boyunca batırın. Kabarcıkları hafifçe karıştırmak için scintillation şişesini iki dakika boyunca hareket ettirin.

Eksi 15 ila eksi 18 santigrat derece arasındaki sıcaklığı korumak için gerektiği gibi kuru buz ekleyin. İki dakika sonra, mikrobubbles soğutulmuş 2-metilbütan çıkarın. Mikrobubbles karıştırmak için şişeyi hafifçe döndürün ve kabarcıkları soğutulmuş 10 mililitrelik bir şırıngaya aktarın.

Ekstrüder hazne kapağını çıkarın ve pistonu şırınganın üzerine yavaşça iterek mikrobubble çözeltisini hazneye ekleyin. Ekstrüder kapağını değiştirerek güvenli bir şekilde yerine tıklatığından emin olun. Basınç kontrol vanasının ve ekstrüderin serbest bırakma vanasının kapalı konumda olduğunu doğrulayın.

Basınç göstergesi 250 PSI okuyana kadar azot gazı tankını açın. Gaz tankını kapatın ve basınç kontrol vanasını açık konuma getirin. Çözelti çıkış borusundaki scintillation şişesini doldurduğunda ve tüpten sadece gaz çıktığında, basınç tahliye vanasını yavaşça açın ve basıncın sıfır PSI'a düşmesine izin verin.

Ekstrüde damlacık çözeltisinin 10 mililitresini 15 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın. Ekstrüde numuneyi 10 dakika boyunca 1.500 kez G'de 4 santigrat derecede santrifüjleyin. Süpernatantı ve çözeltinin üst kısmında görünen kendiliğinden buharlaşmış damlacıkları atın.

DFP nanodropletlerden oluşan peleti %20 gliserol ve %20 propilen glikol ile 10 mililitre PBS'de yeniden askıya alın. Yoğunlaştırılmış kabarcık çözeltilerinin ekstrüzyonlu ve ekstrüzyonsuz boyut dağılımı, yoğunlaştırılmış tek numunenin 400 nanometreye yakın ortalanmış çok daha geniş bir dağılıma sahip olduğunu, ekstrüde numunenin ise 200 nanometre merkezli daha dar bir dağılıma sahip olduğunu göstermektedir. Faz kayması damlacıklarını analiz etmek için kullanılan ayarlanabilir direnç darbe algılama analizi, fazla lipozomları gidermek için santrifüjleme ile yıkandıkları için damlacık boyutlarının 200 nanometreye yakın olduğunu göstermektedir.

Isıtıldığında nanodroplet buharlaşmasının mikroskopi verileri, ısınmadan önce görüş alanında bazı kendiliğinden buharlaşan mikrobubblelerin belirgin olduğunu ve ısıtıldıktan sonra daha fazla sayıda gaz mikrobubblesinin gözlendiğini göstermektedir. Ekstrüdere önceden soğumadan doğrudan yerleştirilen, sıfır santigrat derecede yoğunlaştırılmış ve eksi 18 santigrat derecede nanodropletlerin mikroskopi görüntüleri burada gösterilmiştir. Buharlaşma öncesi ve sonrası yoğunlaştırılmış octafluoropropane damlacıklarının temsili görüntüleri de DFB damlacıklarına benzer şekilde ısıtıldıktan sonra daha fazla sayıda gaz mikrobubbles göstermektedir.

Bu işlem sırasında hatırlanması gereken en önemli şey, damlacık veriminin yoğuşma sırasındaki sıcaklığa ve basınca oldukça bağlı olduğu ve hafif varyasyonların sonuçları etkileyeceğidir. Buharlaştırılabilir damlacıklar ürettikten sonra, ultrason kullanarak in vivo görüntüleme ve ilaç teslimini optimize etmek için ve diğer in vivo ve ex vivo uygulamalarını optimize etmek için kullanılabilirler. Bu tekniği geliştirdikten sonra, nanodroplet boyutunun ve gaz çekirdeği içeriğinin in vivo buharlaşma eşikleri üzerindeki etkileri, bu protokolde yapılan küçük değişiklikler kullanılarak araştırılmıştır.