Helmholtz-Zentrum Berlin'de Kristalografik Parça Taraması için İş Akışı ve Araçlar
3 Mart 2021
Helmholtz-Zentrum Berlin'deki kristalografik parça taraması, özel bileşik kütüphaneler, kristal işleme araçları, hızlı veri toplama tesisleri ve büyük ölçüde otomatik veri analizi içeren bir iş akışı kullanılarak gerçekleştirilir. Sunulan protokol, aşağı akış yapısına dayalı ligand tasarımı için umut verici başlangıç noktaları sağlamak için bu tür deneylerin çıktısını en üst düzeye çıkarmayı amaçlamaktadır.
X-ışını kristalografisi kullanılarak parça adı verilen daha küçük organik bileşiklerin taranması, ilaç keşfi veya biyokimyasal takım bileşiği gelişimi için başlangıç noktaları olan molekülleri tanımlamak için etkili bir yöntemdir. Kristalografik parça taraması sadece kimliği değil, aynı zamanda incelenen proteinin yüzeyinde parçaların nereye ve nasıl bağlandığını da ortaya koydu. Bu teknik, uygun protein kristallerinin yetiştirilebileceği her biyokimyasal veya tıbbi olarak ilgili protein hedefinde kullanılabilir.
Sonuçların kalitesi, numune işleme kalitesine yakından bağlıdır. Aşağıdaki görsel gösterimin araştırmacıların yüksek kaliteli deneyler yapmalarına yardımcı olacağına inanıyoruz. Prosedürü gösteren tatjana Barthel, doktora araştırmacısı ve laboratuvarımda doktora öğrencisi.
Başlamak için, önceden ısıtılmış eleme plakasının torbasını oda sıcaklığına kadar kesin, ardından kapağı ve folyoyu eleme plakasından çıkarın. Beş mililitre ıslatma çözeltisini reaktif rezervuarında dekant. Daha sonra plakanın 96 rezervuarının her birini 12 kanallı pipet kullanarak 40 mikrolitre ıslatma çözeltisi ile doldurun.
Kolay erişim çerçevesini eleme plakasının üzerine yerleştirin ve cihazın sol ve sağ tarafına kaydırarak birlikte verilen kelepçelerle sabitleyin. Eleme plakasını ve kolay erişim çerçevesini mikroskop altına yerleştirin ve çerçevenin ilgili akrilik cam karoserini hareket ettirerek ilk kuyuyu açın. Taze bir pipet ucu kullanarak rezervuardan iyi içeren parçaya 0,4 mikrolitre ıslatma çözeltisi ekleyin.
Damlanın kurumuş parçayı kapladığından emin olun. En büyük kristalleri içeren kristalizasyon plakasını ikinci mikroskop altına yerleştirin ve kuyulardan birinde sızdırmazlık folyosunu kesin. Uygun büyüklükte bir döngü kullanarak, bir kristali ilk mikroskop altında tarama plakasının kuyusuna aktarın.
Halkayı hazırlanan cam spot plakada yıkayın, ardından dokuya hafifçe dokunarak kurulayın. Çapraz kontaminasyonu önlemek için her transferden sonra bunu yapın. Kristalin düzgün yerleştirildiğından emin olmak için mikroskobu kullanın.
İkinci kristalin prosedürünü tekrarlayın. Bir sonraki kuyuya geçin ve kalan tüm kuyular için prosedürü tekrarlayın. Kristaller eleme plakasındaki 96 kuyunun tümüne aktarıldıktan sonra, tarama plakasını mikroskop altından kolay erişim çerçevesiyle birlikte çıkarın ve tezgaha veya masaya yerleştirin.
Ardından, tarama plakasından kolay erişim çerçevesini çıkarın, eleme plakasını sızdırmazlık folyosu ile kapatın ve daha önce optimize edilmiş ıslatma süresi boyunca kuluçkaya yatmak için kristalizasyon inkübatörüne veya dolaba yerleştirin. İki saatlik kuluçka yeterlidir, ancak geceleme daha uygun olabilir. Unipuck köpük Dewar'ı üç Unipuck kapağı ile hazırlayın ve yarısı yerde tutarak sıvı nitrojenle doldurun.
Yarı dolu Dewar'ı yedek kulübesine taşıyın ve tamamen kenara doldurun. Tüm deney sırasında üst kenara dolu tutun ve sıvı nitrojeni sık sık değiştirin. Tarama plakasını inkübatörden alın ve folyosunu çıkarın.
Kolay erişim çerçevesini üste yerleştirin. İlk kuyuyu kaydırın. Damladan bir kristal hasat edin ve hızlı bir dikey hareketle daldırarak sıvı nitrojende soğutun.
Örneği uygun pak konumuna getirin ve örnek izleme sayfasında ilgili notları alın. İkinci kristalin prosedürünü tekrarlayın. Bir sonraki kuyuya gidin ve üç pak da dolana kadar diğer kristallerin konumunu tekrarlayın.
Unipuck tabanlarını sıvı nitrojende önceden soğutun ve kapakların üzerine ekleyin. Unipucks'ı bir nakliye dewar veya depolama Dewar depolama rafında saklayın. Ölçüme kadar kriyojenik sıcaklıklarda sıvı nitrojende tutun.
Tarama plakasında kalan numuneler için kristalleri Unipucks'ta toplama ve depolama prosedürünü tekrarlayın. Parça ıslatma ve kristal hasadı yapıldıktan sonra kristal morfolojilerinin değişkenliği burada gösterilmiştir. Biraz bozulmuş görünen kristaller bile dahil edildi, çünkü hala yararlı verilerle sonuçlandılar.
Veriler BESSY II senkrotron'daki 14.1 ve 14.2 kiriş hatlarında toplanmıştı. Her örnek için kırınım veri toplama gerçekleştirildi. Veriler FragMAXapp kullanılarak analiz edildi, işleme için XDSAPP, yapı iyileştirme için fspipeline ve isabet bulma için PenDA kombinasyonuna odaklandı.
Bu, DMSO serbest ıslatma koşulu kullanılarak AR protein kompleksinde 15 isabetle sonuçlandı. F2X giriş ekranının aynı hedefe karşı önceki bir kampanyasında, ıslatma durumundaki DMSO da dahil olmak üzere, 20 isabet bulundu. Bu, DMSO atlanırsa isabetlerin %75'inin tanımlanabileceği anlamına gelir.
Deneyin başarısı için, kristallerin prosedürün her adımı sırasında düzgün ve dikkatli bir şekilde ele alınması çok önemlidir. Kristalografik parça taraması, akademide ve ilaç endüstrisinde sıklıkla uygulanan yaygın olarak kullanılan bir tekniğe olgunlaşmıştır.
Genel Bakış
Bu makale, x-ışını kristalografisi yoluyla potansiyel ilaç adaylarını belirleme yöntemi olarak kristalografik fragman taramasını ele almaktadır. Protokol, otomatik veri analizi ve optimize edilmiş numune işleme süreçlerini kullanarak deneylerin verimliliğini artırmayı amaçlamaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kristalografi
- İlaç Keşfi
- Biyokimya
Arka Plan
- Fragman taraması, proteinlere bağlanabilen küçük organik bileşikleri tanımlamak için kullanılan bir tekniktir.
- Sonuçların kalitesi, örnek işleme ve kristalizasyon tekniklerine büyük ölçüde bağlıdır.
- Bu yöntem, biyokimyasal açıdan ilgili çeşitli protein hedeflere uygulanabilir.
- Başarılı veri toplama işlemi için kristallerin uygun şekilde işlenmesi kritik önem taşır.
Çalışmanın Amacı
- Kristalografik fragman taraması için ayrıntılı bir protokol göstermek.
- Fragmanların protein yüzeylerindeki bağlanma özellikleri hakkında içgörü sağlamak.
- Yapı tabanlı ligand tasarımı için gerçekleştirilen deneylerin verimini artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Süzme çözeltileri ile tarama plakalarının hazırlanması.
- Protein kristallerinin tarama kuyucuklarına aktarılması.
- Kristallerin optimize edilmiş koşullar altında inkübasyonu.
- Özel yazılımlar kullanılarak veri toplama ve analiz.
Ana Sonuçlar
- DMSO içermeyen koşullar altında AR protein kompleksinde 15 hit'in tanımlanması.
- Önceki deneylerle yapılan karşılaştırma, DMSO'nun dışlanmasının hala anlamlı hitler sağlayabileceğini göstermiştir.
- Kristal morfolojilerindeki değişkenlik ve bunların veri kalitesi üzerindeki etkisi kanıtlanmıştır.
Sonuçlar
- Kristalografik fragman taraması, ilaç keşfinde değerli bir tekniktir.
- Güvenilir veriler elde etmek için kristallerin dikkatli bir şekilde taşınması esastır.
- Bu protokol, akademi ve endüstrideki araştırmacılar için bir kılavuz görevi görebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Endüstriyel Uygulama Uygunluğu
Kristalografik fragman taraması, ligand-bağlanma modlarının atomik çözünürlükte erken aşamada tanımlanmasını sağlayarak, yapı tabanlı ilaç keşfinde hedef doğrulamayı ve öncü bileşik optimizasyonunu destekler. HZB'de sunulan iş akışı, fragman hit bulma sürecinde tekrarlanabilirliği ve verimliliği artırmak için otomatik veri işlemeyi ve standartlaştırılmış kristal yönetimini entegre eder. Bu yaklaşım, fragman-protein etkileşimlerine dair doğrudan yapısal öngörüler sunarak erken keşif aşamasındaki mekanistik belirsizliği azaltır ve sonraki tıbbi kimya çalışmaları için devam/dur kararlarına temel oluşturur.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Fragment bağlanma bölgelerinin doğrudan 3D görselleştirmesini sağlayarak hedef hipotezlerinin mekanistik olarak riskten arındırılmasına imkan tanır.
- Operasyonel Değer: Bağlanma bölgesi plastisitesini incelemek amacıyla 96 üyeli fragment kütüphanelerinin protein kristallerine karşı hızlı bir şekilde taranmasını destekler.
- Öngörücü Değer: Güçlü bağlayıcıların yapı tabanlı optimizasyonu için başlangıç noktaları olarak hizmet eden fragment hitlerini belirler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Fragman doluluğunu ve bağlanma konformasyonunu doğrulamak için kantitatif elektron yoğunluğu haritaları sunar.
- Operasyonel Değer: Yüzlerce kristal boyunca otomatik veri toplama işlemi için senkrotron ışın hatlarında robot montajlı numune değişimini kullanır.
- Analiz Hazırlığı: Tekrarlanabilir difraksiyon kalitesinde veriler sağlamak için standartlaştırılmış emdirme ve hızlı dondurma protokolleri uygular.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: CFS aracılığıyla tanımlanan fragman hitleri, preklinik değerlendirme için geliştirilmiş farmakolojik özelliklere sahip ön ilaç adaylarına (lead) dönüştürülebilir.
- Mekanistik Risk Azaltma: Fragman bağlanmasından elde edilen yapısal veriler, SAR geliştirmeye temel oluşturur ve ön ilaç optimizasyonundaki başarısızlık riskini azaltır.
- Preklinik Uygunluk: Geliştirilebilirlik potansiyeli yüksek olan kemotipleri önceliklendirmek için fragman etkinliği ve ligand etkinliği metriklerinin değerlendirilmesine olanak tanır.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
CFS iş akışı, yapısal karakterizasyon yoluyla hedef doğrulamasını destekleyerek ve fragman büyütme veya bağlama stratejileri aracılığıyla öncü bileşik tanımlamasını mümkün kılarak erken keşif sürekliliğine uyum sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Küçük moleküllerin ilgili protein hedeflere nerede ve nasıl bağlandığını ortaya çıkararak hipotez testlerini kolaylaştırır.
- Tarama: Otomatik kristal işleme ve sinkrotron tabanlı veri toplama yoluyla fragman kütüphanelerinin paralel olarak taranmasını sağlar.
- Analizler: Kırınım veri setlerinden otomatik işleme, rafine etme ve hit belirleme için XDSAPP, fspipeline ve PenDA'yı entegre eder.
- Translasyonel Araştırma: Fragman optimizasyonu için atomik düzeyde bağlanma modları sağlayarak yapı tabanlı ligand tasarımını destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Bir keşif portföyündeki birden fazla protein hedefi için fragman taramasına yönelik standartlaştırılmış, yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Bağlanma modunun doğrudan deneysel kanıtları aracılığıyla hedef-ligand etkileşimlerine olan güveni artırır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış kristal emdirme, toplama ve kriyojenik saklama prosedürleri yoluyla tekrarlanabilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: Tıbbi kimya için elverişli bağlanma etkileşimlerine sahip fragmanlara öncelik vererek hit-to-lead verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Fragman tarama sonuçlarına ve yapısal işlenebilirliğe dayalı olarak hedeflerin risk ayarlı önceliklendirmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Protein kristalizasyonu, kristal işleme ve sinkrotron tabanlı veri toplama konularında uzmanlık gerektirir.
- Yüksek verimli tarama için yüksek parlaklıktaki ışın hatlarına ve otomatik numune değiştiricilere erişime bağlıdır.
- Fragment kütüphanesi hazırlama, emdirme koşulları ve veri analizi boru hatları için standartlaştırılmış protokoller gerektirir.
- Yapısal biyoloji, tıbbi kimya ve veri analizi grupları arasında ekipler arası koordinasyon içerir.
- Yalnızca tarama koşulları altında tekrarlanabilir, yüksek kaliteli kristallerin elde edilebildiği ve korunabildiği hedeflerle sınırlıdır.
