In vitro ve in vivo Çalışmalar için Fare Değişmez Doğal Öldürücü T Hücrelerinin Saflaştırılması ve Genişlemesi

Değişmez doğal öldürücü T (iNKT) hücrelerini fare dalağını zenginleştirmek ve in vitro ve in vivo çalışmalar için uygun sayılara genişletmek için hızlı ve sağlam bir protokol açıklıyoruz.

Bu protokol, çok nadir görülen MÜREKKEP T hücrelerinin saflaştırılmasını sağlar ve sayılarında 30 kat genişlemeye izin verir. Saflaştırma bir günde yapılabilir ve iki hafta içinde in vivo ve in vitro çalışmalar için çok sayıda kullanıma hazır MÜREKKEP T hücresi üretebilir. Prosedürü gösteren gloria Delfanti olacak, laboratuvarda doktora sonrası.

Fare dalağını inceledikten sonra, %2 FBS ile 10 mililitre PBS'de tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için 70 nanometre hücre süzgecinden geçirin. Beş dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj. Süpernatant çıkarın ve hücre peletini bir mililitre steril amonyum klorür potasyum lizin tamponu ile yeniden dürtün.

Hücreleri oda sıcaklığında üç dakika kuluçkaya yaslayın, ardından%2 FBS ile beş mililitre PBS ile engelleyin. Beş dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj. Süpernatantı çıkardıktan sonra, hücre peletini %2 FBS ile üç mililitre PBS'de yeniden ıslatın ve pipetleme ile yağ kalıntılarını giderin.

Zenginleştirme adımları için hücreleri soğuk tutun ve çözeltileri dört santigrat derecede önceden soğutun ve daha sonra buzda tutun. Beş dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj. Tüm hücreleri %2 FPS ve Fc bloker ile uygun miktarda PBS'de yeniden depolayın ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.

10 milyon hücre başına bir ila iki mililitre MACS ayırma tamponu ve 10 dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj ile yıkayın. Süpernatant çıkarıldıktan sonra, hücreleri CD19-FITC ve H2-IAb-FITC ile lekeleyin ve karanlıkta dört ila sekiz santigrat derecede 15 dakika kuluçkaya yaslayın. 10 milyon hücre başına bir ila iki mililitre MACS tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın ve 10 dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj yapın.

Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini 10 milyon hücre başına 90 mikrolitre MACS tamponunda yeniden biriktirin. 10 milyon hücre başına 10 mikrolitre anti-FITC mikrobead ekleyin. İyice karıştırın ve dört ila sekiz santigrat derecede karanlıkta 15 dakika kuluçkaya yatırın.

10 milyon hücre başına bir ila iki mililitre MACS tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın ve 10 dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj yapın. Üstnatantı çıkarın ve 500 mikrolitre MACS tamponunda 125 milyona kadar hücreyi yeniden biriktirin. MACS ayırıcısının manyetik alanına bir LD sütunu yerleştirin.

Tıkanmasını önlemek için, LD sütununa bir ön ayırma filtresi uygulayın ve iki mililitre MACS arabelleğiyle durulayın. Hücre süspansiyonunu filtreye uygulayın ve sütundan geçen etiketsiz hücreleri toplayın. Boş sütun haznesini bir mililitre MACS tamponu ile üç kez yıkayın.

T hücreli zenginleştirilmiş atık suları toplayın ve FACS analizi için 50 mikrolitre tutarak hücreleri sayın. Beş dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj yaptıktan sonra, süpernatantı çıkarın ve hücreleri CD1d tetramer-PE ile lekeleyin. İyice karıştırın ve buz üzerinde karanlıkta 30 dakika kuluçkaya yatırın.

10 milyon hücre başına bir ila iki mililitre MACS arabelleği ekleyerek hücreleri yıkayın. 10 dakika boyunca 300 kez G'de santrifüjlemeden sonra, süpernatantı çıkarın ve hücre peletini 10 milyon hücre başına 80 mikrolitre MACS tamponunda yeniden biriktirin. 10 milyon hücre başına 20 mikrolitre anti-PE mikrobead ekleyin.

İyice karıştırın ve dört ila sekiz santigrat derecede karanlıkta 15 dakika kuluçkaya yatırın. 10 milyon hücre başına bir ila iki mililitre MACS tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın ve 10 dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj yapın. Üstnatantı çıkarın ve 500 mikrolitre MACS tamponunda 100 milyona kadar hücreyi yeniden biriktirin.

Hücre sayısına göre, LS veya MS sütununu MACS ayırıcısının manyetik alanına yerleştirin ve sütunu MACS arabelleğiyle durulayın. Hücre süspansiyonunu sütuna uygulayın, geçen etiketsiz hücreleri toplayın ve sütunu daha önce açıklandığı gibi üç kez yıkayın. Bu negatif kesir.

Sütunu manyetik alandan çıkarın ve yeni bir toplama tüpüne yerleştirin. Pipet MACS sütuna tampon ve MÜREKKEP T hücrelerinde zenginleştirilmiş pozitif fraksiyonu temizlemek için sağlanan pistonu sütuna itin. MÜREKKEP T hücresi kurtarmayı daha da artırmak için, negatif kesiri 10 dakika boyunca 300 kez G'de santrifüjleyin ve önceki adımları yeni bir LS veya MS sütunuyla yineleyin.

Pozitif kesirleri çekin ve hücre sayısını belirleyin. Saflığı kontrol etmek için FACS analizi için hem pozitif hem de negatif fraksiyonlardan 50 mikrolitre tutun. INK T hücrelerini bire bir oranında etkinleştirmek için, uygun miktarda anti-CD3 ve CD28 manyetik boncukları bir tüpe ve eşit miktarda PBS'ye aktarın, ardından beş saniye boyunca girdap.

Tüpü bir dakika boyunca bir mıknatısa yerleştirin ve üstnatant atın. Tüpü mıknatıstan çıkarın ve yıkanmış manyetik boncukları uygun RPMI hacminde yeniden diriltin. Santrifüj, BEŞ dakika boyunca 300 kez G'de MÜREKKEP T hücrelerini saflaştırdı ve fare T-aktivatör anti-CD3 veya CD28 manyetik boncuklarla karıştırın.

Hücre süspansiyonunun bir mililitresini plaka, anti-CD23 ve CD28 manyetik boncukları mililitre BAŞıNA 20 birim il-2 ile 48 kuyu plakasında, daha sonra 37 santigrat derecede kuluçkaya yatır. Beş gün sonra mililitre IL-7 başına 10 nanogram ekleyin. Hücreleri % 80 ila% 90 izdihama ulaştıklarında ikiye bölün, mililitre IL-2 başına her zaman 20 birim ve mililitre IL-7 başına 10 nanogram ekler.

Bu koşullar altında, MÜREKKEP T hücreleri 15 güne kadar genişletilebilir. Bu protokol kullanılarak, INK T hücreleri transgenik farelerin dalağını immünmanyetik bir ayırma işlemi ile zenginleştirir. Zenginleştirmeden sonra, hücreler anti-CD3 ve CD28 boncuklarla genişletilebilir ve kültürün 14.

Anti-CD3 ve anti-CD boncukları ile güçlü aktivasyon, hücre yüzeyindeki IMK T hücreli TCR ekspresyonunun küçültülmesine neden oldu ve çift negatif popülasyon ortaya çıktı. Genişletilmiş INK T hücrelerinin çoğunluğu CD4 negatiftir. Plzf ve ROR gama T soylara özgü transkripsiyon faktörlerinin karakterizasyonu, zenginleştirilmiş INK T hücrelerindeki NKT1, NKT2 ve NKT17 fenotiplerinin sıfır ve 14.

Zenginleştirilmiş MÜREKKEP T hücreleri, PMA ve iyonomisiyan stimülasyondan sonra hem interferon gama hem de IL-4 salgılanmasıyla doğrulanan 14 günlük genişlemeden sonra korunan T80 benzeri bir efektör fenotip gösterir. Arınma adımları sırasında önceden soğutulmuş solüsyonlarla hızlı çalışmayı ve pipetleme sırasında görülebilecek yağ artıklarından kurtulmayı unutmayın. Genişletilmiş MÜREKKEP T hücreleri, gen transferi veya düzenleme yoluyla fonksiyonel değişikliklerden sonra bile, in vitro tahliller ve in vivo transferler için farelere aktarılabilir.

INK T hücrelerinin in vitro genişlemesi, azlık tarafından verilen sınırlamanın üstesinden gelir ve onları tümör immün gözetim, bulaşıcı hastalıklar ve oto-bağışıklık alanlarındaki preklinik çalışmalarda sömürülebilir hale getirir.