Name: In vitro ve in vivo Çalışmalar için Fare Değişmez Doğal Öldürücü T Hücrelerinin Saflaştırılması ve Genişlemesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-15T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Öğrenin fare dalaklarından iNKT hücrelerinin saflaştırılması ve 30 kat genişletilmesi yöntemini. Bu protokol, immünoloji ve hücre biyolojisi araştırmalarında in vitro ve in vivo çalışmalar için yeterli hücre sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Paolo Dellabona ve Giulia Casorati'ye makalenin bilimsel desteği ve eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Nih Tetramer Çekirdek Tesisi'ne fare CD1d tetramer için de teşekkür ederiz. Çalışma Fondazione Cariplo Grant 2018-0366 (M.F.'ye) ve İtalyan Kanser Araştırmaları Derneği (AIRC) bursu 2019-22604 (G.D.'ye) tarafından finanse edildi.

Burada açıklanan prosedürler San Raffaele Bilim Enstitüsü'nde Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) (no. 1048) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
NOT: Tüm işlemler steril koşullarda yapılmalıdır. Kullanılan tüm reaktifler Malzeme Tablosundalistelenmiştir.
1. Dalak işleme
<ol><li>Kurumsal politikaya göre CO2'yi soluma yoluyla iVα14-Jα18 farelerini ötenazi edin. NOT: iVα14-Jα18 fareler 8 haftalık veya daha büyük olmalıdır. Hücrelerin in vivo transferinden reddedilmesini önlemek için, dişi farelerden izole edilen hücrelerin hem erkek hem de dişi alıcılarda benimsenebileceğini, erkek farelerden izole edilen hücrelerin ise sadece erkek alıcılarda aktarıldığını düşünün. Tüp bebek deneyleri için cinsiyet önyargısı düşünülmemelidir. Daha fazla hücre elde etmek için daha fazla fare birikebilir.</li>
	<li>%2 fetal sığır serumu (FBS) ile 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde tek hücreli süspansiyon elde etmek için fare dalağını parçalara ayırın ve 70 nm hücreli bir süzgeçten geçirin.</li>
	<li>5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj.</li>
	<li>Eritrosit liziz arabelleği ile inversiyon ve işlem yaparak üstnatant çıkarın. Hücre peletini 1 mL steril ACK (Amonyum-Klorür-Potasyum) Lysing Buffer ile yeniden depolayın, oda sıcaklığında 3 dakika kuluçkaya yatırın ve% 2 FBS ile 5 mL PBS ile bloklayın. 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj. NOT: ACK ticari olarak mevcuttur; bidistilled H 2 O, pH 7.2-7.4 çözünmüş 0.15 M NH4Cl,10mM KHCO3ve0.1mM Na 2 EDTA (etileniamintetraacetic asit) çözeltiden oluşur. Ev yapımıysa, 0,22 μm filtre ile filtrasyon ile sterilize edin.</li>
	<li>Ters çevrilerek üstnatant kaldırın. Hücre peletini %2 FBS ile 3 mL PBS'de yeniden dürt ve pipetleme ile yağ kalıntılarını giderin. Gerekirse, farklı farelerden gelen hücreleri bir kenara ayırın.</li>
	<li>Hücreleri sayın ve FACS analizi için 50 μL tutun.</li>
</ol>2. T hücre zenginleştirme
NOT: Zenginleştirme adımları için hızlı çalışın, hücreleri soğuk tutun ve çözeltileri gece boyunca 4 °C'de önceden soğutulup buzda bekletin
<ol><li>5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj.</li>
	<li>Tüm hücreleri% 2 FBS (10 7 hücre için 500 μL) ve Fc bloker (2,5μL x 107 hücre) ile uygun miktarda PBS'de yeniden kullanın; oda sıcaklığında (RT) 15 dakika kuluçkaya yatır.</li>
	<li>107 toplam hücre başına 1-2 mL MACS ayırma tamponu (MB) ve 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj ile yıkayın. NOT: MACS arabelleği ticari olarak kullanılabilir. PBS pH 7.2, %0.5 sığır serum albümini (BSA) ve 2 mM EDTA'dan oluşur. Ev yapımıysa, 0,22 μm filtre ile filtrasyon ile sterilize edin.</li>
	<li>Üst kısmı ters çevrilerek çıkarın ve hücreleri CD19-FITC ve H2(IAb)-FITC ile lekeleyin (100 μL MB'de 5 μL x10 7 hücre kullanın). İyice karıştırın ve 4-8 °C'de karanlıkta 15 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>107 hücre başına 1−2 mL MB ve 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj ekleyerek hücreleri yıkayın.</li>
	<li>Pipet tamamen üsttan kapalı ve toplam hücre başına 90 μL MB hücre pelet resuspend. Toplam 107 hücre başına 10 μL Anti-FITC MikroBead ekleyin. İyice karıştırın ve 4-8 °C'de karanlıkta 15 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>107 hücre başına 1−2 mL MB ve 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj ekleyerek hücreleri yıkayın.</li>
	<li>Pipet tamamen süpernatant kapalı ve MB 500 μL içinde 1.25 x10 8 hücre kadar resuspend.</li>
	<li>Tükenmeye devam etmek için MACS ayırıcısının manyetik alanına bir LD sütunu yerleştirin. Tıkanmasını önlemek için LD sütununa bir ön ayırma filtresi uygulayın ve 2 mL MB ile durulayın.</li>
	<li>Sütun haznesi boş olduğunda, hücre süspansiyonunu filtreye uygulayın. Sütundan geçen etiketsiz hücreleri toplayın.</li>
	<li>Sadece sütun rezervuarı boş olduğunda 1 mL MB ile 3 kez yıkayın. T hücrelerinde zenginleştirilecek toplam atıkyu toplayın ve hücreleri sayın. FACS analizi için her zaman 50 μL tutun.</li>
</ol>3. iNKT hücre zenginleştirme
<ol><li>5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj ve ters çevrilerek süpernatantı çıkarın.</li>
	<li>106 hücre başına 50 μL MB antikor titrasyona göre hücreleri CD1d-tetramer-PE (fare PBS57-CD1d-tetramer) ile lekeleyin. İyice karıştırın ve buz üzerinde karanlıkta 30 dakika kuluçkaya yatırın. NOT: Prosedür ayrıca APC etiketli mCD1d tetramerler ve anti-APC boncukları ile de gerçekleştirilebilir; aşağıdaki boyamada kullanılan florokromların buna göre ayarlanması. Mevcut protokolde NIH tarafından sağlanan fare PBS-57-CD1d-tetramers kullandık. αgalactosylceramide (αGal-Cer), iNKT hücreleri tarafından tanınan prototipik antijendir; PBS-57, gelişmiş çözünürlük9ile αGal-Cer'in bir analogudur; NIH Tetramer Tesisi, CD1d tetramerlere karmaşık PBS-57 ligand sağlar. Bununla birlikte, diğer CD1d dimerler / tetramerler / dektramerler ticari olarak mevcuttur ve αGal-Cer olarak lipidik bir antijen ile yüklenebilir. Protokolleri kullanımları için ayarlama imkanı öngörüyoruz.</li>
	<li>107 hücre başına 1−2 mL MB ve 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj ekleyerek hücreleri yıkayın.</li>
	<li>Pipet tamamen süpernatant kapalı ve hücre pelet 107 toplam hücre başına MB 80 μL yeniden. Toplam 107 hücre başına 20 μL Anti-PE MikroBead ekleyin. İyice karıştırın ve 4-8 °C'de karanlıkta 15 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>107 hücre başına 1−2 mL MB ve 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj ekleyerek hücreleri yıkayın.</li>
	<li>Pipet tamamen süpernatant kapalı ve MB 500 μL içinde10 8 hücreye kadar resuspend. Aksi takdirde, hücreler 108'iaşarsa, sesi buna göre ayarlayın.</li>
	<li>Hücre sayısına göre, MACS ayırıcısının manyetik alanına bir LS(10 8'ekadar) veya MS(10 7'yekadar) sütunu yerleştirin. Sütunu MB ile durulayın (LS için 3 mL, MS için 500 μL).</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu sütuna uygulayın.</li>
	<li>Geçen etiketsiz hücreleri toplayın. Yalnızca sütun rezervuarı boş olduğunda uygun miktarda MB (LS sütunu için 3 x 3 mL, MS sütunu için 3 x 500 μL) ekleyerek sütunu 3 kez yıkayın. Toplam atıklar negatif kesirdir.</li>
	<li>Sütunu manyetik alandan çıkarın ve yeni bir toplama tüpüne yerleştirin.</li>
	<li>Sütuna Pipet MB (LS sütunu için 5 mL veya MS sütunu için 1 mL); sağlanan pistonu sütuna itin ve pozitif fraksiyonu (iNKT hücrelerinde zenginleştirilmiş) boşaltın.</li>
	<li>iNKT hücre kurtarmayı daha da artırmak için, negatif kesiri 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve 3,6-3,7 adımlarını yeni bir LS veya MS sütunuyla yineleyin. Pozitif kesirleri bir kenara alıp hücre sayısını belirleyin. FACS analizi için hem pozitif hem de negatif fraksiyonlardan 50 μL tutun.</li>
	<li>PSS analizine göre Saflaştırma adımlarını kontrol edin. Örnekler şunlardır: dalak ex-vivo, T hücre zenginleştirilmiş fraksiyon, iNKT pozitif fraksiyon ve iNKT negatif fraksiyon. Hücreleri şu şekilde lekeleyin: CD19-FITC, IAb-FITC, CD1d-tetramer-PE, TCRβ-APC ve DAPI. NOT: Bir iVα14-Jα18 fareden beklenen kurtarma 2x106 iNKT hücreleridir.</li>
</ol>4. iNKT hücre aktivasyonu ve genişlemesi
<ol><li>Saflaştırılmış iNKT hücrelerini fare T aktivatör anti-CD3/CD28 manyetik boncuklarla 1:1 oranında etkinleştirin.<ol>
<li>5 dakika boyunca iNKT hücre pozitif fraksiyonunu 300 x g'da santrifüj edin.</li>
		<li>Bu arada, uygun miktarda anti-CD3/CD28 manyetik boncukları bir tüpe aktarın ve 5 saniye boyunca eşit miktarda PBS, girdap ekleyin. Tüpü 1 dakika boyunca bir mıknatısa yerleştirin ve üstnatant atın.</li>
		<li>Tüpü mıknatıstan çıkarın ve yıkanmış manyetik boncukları tam RPMI (RPMI 1640 ortamı) uygun hacimde yeniden kullanın, %10 ısı inaktive FCS, 1 mM sodyum piruvat, %1 esansiyel olmayan amino asitler, 10 U/ml penisillin ve streptomisin, 50 μM β-Mercaptoethanol) 1 mL'de 5 x10 5 iNKT hücreye sahip olmak. Santrifüjlenmiş iNKT pozitif fraksiyonunu yeniden kullanmak için bu süspansiyonu kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücre süspansiyonunun plaka 1 mL'si (5 x10 5 iNKT hücresi) ve 20 U/mL IL-2 ile 48 kuyu plakasında anti-CD3/CD28 manyetik boncuklar ve 37 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>5 gün sonra, 10 ng/mL IL-7 ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri % 80-90 birleştiğinde 1:2 bölün, her zaman 20U / mL IL-2 ve 10 ng / mL IL-7 ekleyin. Bu koşullarda, iNKT hücreleri 15 güne kadar genişletilebilir.</li>
</ol>

<ol><li>Bendelac, A., Savage, P. B., Teyton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+NKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The biology of NKT cells.</a> Annual Review of Immunology. 25, 297-336 (2007).</li>
<li>Brennan, P. J., Brigl, M., Brenner, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+natural+killer+T+cells%3A+an+innate+activation+scheme+linked+to+diverse+effector+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Immunology%22%5BJournal%5D)">Invariant natural killer T cells: an innate activation scheme linked to diverse effector functions.</a> Nature Reviews: Immunology. 13 (2), 101-117 (2013).</li>
<li>Pellicci, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+natural+killer+T+%28NKT%29+cell+developmental+pathway+iInvolving+a+thymus-dependent+NK1.1%28-%29CD4%28%2B%29+CD1d-dependent+precursor+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">A natural killer T (NKT) cell developmental pathway iInvolving a thymus-dependent NK1.1(-)CD4(+) CD1d-dependent precursor stage.</a> Journal of Experimental Medicine. 195 (7), 835-844 (2002).</li>
<li>Benlagha, K., Kyin, T., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thymic+precursor+to+the+NK+T+cell+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A thymic precursor to the NK T cell lineage.</a> Science. 296 (5567), 553-555 (2002).</li>
<li>Lee, Y. J., Holzapfel, K. L., Zhu, J., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steady-state+production+of+IL-4+modulates+immunity+in+mouse+strains+and+is+determined+by+lineage+diversity+of+iNKT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Steady-state production of IL-4 modulates immunity in mouse strains and is determined by lineage diversity of iNKT cells.</a> Nature Immunology. 14 (11), 1146-1154 (2013).</li>
<li>Griewank, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homotypic+interactions+mediated+by+Slamf1+and+Slamf6+receptors+control+NKT+cell+lineage+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Homotypic interactions mediated by Slamf1 and Slamf6 receptors control NKT cell lineage development.</a> Immunity. 27 (5), 751-762 (2007).</li>
<li>Cortesi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bimodal+CD40%2FFas-Dependent+Crosstalk+between+iNKT+Cells+and+Tumor-Associated+Macrophages+Impairs+Prostate+Cancer+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Bimodal CD40/Fas-Dependent Crosstalk between iNKT Cells and Tumor-Associated Macrophages Impairs Prostate Cancer Progression.</a> Cell Reports. 22 (11), 3006-3020 (2018).</li>
<li>Heczey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invariant+NKT+cells+with+chimeric+antigen+receptor+provide+a+novel+platform+for+safe+and+effective+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Invariant NKT cells with chimeric antigen receptor provide a novel platform for safe and effective cancer immunotherapy.</a> Blood. 124 (18), 2824-2833 (2014).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+alpha-galactosyl+ceramide+for+staining+and+stimulating+natural+killer+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A modified alpha-galactosyl ceramide for staining and stimulating natural killer T cells.</a> Journal of Immunological Methods. 312 (1-2), 34-39 (2006).</li>
<li>Chiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reliable+generation+of+invariant+natural+killer+T-cell+lines+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro.</a> Immunology. 128 (3), 324-333 (2009).</li>
<li>Crowe, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+antitumor+immunity+mediated+by+NKT+cell+subsets+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Differential antitumor immunity mediated by NKT cell subsets in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 202 (9), 1279-1288 (2005).</li>
<li>de Lalla, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+profibrotic+cytokines+by+invariant+NKT+cells+characterizes+cirrhosis+progression+in+chronic+viral+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Production of profibrotic cytokines by invariant NKT cells characterizes cirrhosis progression in chronic viral hepatitis.</a> Journal of Immunology. 173 (2), 1417-1425 (2004).</li>
<li>Tian, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD62L%2B+NKT+cells+have+prolonged+persistence+and+antitumor+activity+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">CD62L+ NKT cells have prolonged persistence and antitumor activity in vivo.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (6), 2341-2355 (2016).</li>
<li>Gaya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+Antiviral+B+Cell+Immunity+Relies+on+Innate+Signals+from+Spatially+Positioned+NKT+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Initiation of Antiviral B Cell Immunity Relies on Innate Signals from Spatially Positioned NKT Cells.</a> Cell. 172 (3), 517-533 (2018).</li>
<li>Rotolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Anti-lymphoma+Activity+of+CAR19-iNKT+Cells+Underpinned+by+Dual+CD19+and+CD1d+Targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhanced Anti-lymphoma Activity of CAR19-iNKT Cells Underpinned by Dual CD19 and CD1d Targeting.</a> Cancer Cell. 34 (4), 596-610 (2018).</li>
<li>Schneidawind, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Third-party+CD4%2B+invariant+natural+killer+T+cells+protect+from+murine+GVHD+lethality%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Third-party CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality.</a> Blood. 125 (22), 3491-3500 (2015).</li>
<li>Schneidawind, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+invariant+natural+killer+T+cells+protect+from+murine+GVHD+lethality+through+expansion+of+donor+CD4%2BCD25%2BFoxP3%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CD4+ invariant natural killer T cells protect from murine GVHD lethality through expansion of donor CD4+CD25+FoxP3+ regulatory T cells.</a> Blood. 124 (22), 3320-3328 (2014).</li>
<li>Schneidawind, D., Pierini, A., Negrin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+T+cells+and+natural+killer+T+cells+for+modulation+of+GVHD+following+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Regulatory T cells and natural killer T cells for modulation of GVHD following allogeneic hematopoietic cell transplantation.</a> Blood. 122 (18), 3116-3121 (2013).</li>
<li>Leveson-Gower, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+doses+of+natural+killer+T+cells+provide+protection+from+acute+graft-versus-host+disease+via+an+IL-4-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Low doses of natural killer T cells provide protection from acute graft-versus-host disease via an IL-4-dependent mechanism.</a> Blood. 117 (11), 3220-3229 (2011).</li>
<li>Coman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CD4-+invariant+NKT+lymphocytes+regulate+graft+versus+host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Human CD4- invariant NKT lymphocytes regulate graft versus host disease.</a> Oncoimmunology. 7 (11), 1470735(2018).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKT+Cells+Coexpressing+a+GD2-Specific+Chimeric+Antigen+Receptor+and+IL15+Show+Enhanced+In+vivo+Persistence+and+Antitumor+Activity+against+Neuroblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">NKT Cells Coexpressing a GD2-Specific Chimeric Antigen Receptor and IL15 Show Enhanced In vivo Persistence and Antitumor Activity against Neuroblastoma.</a> Clinical Cancer Research. 25 (23), 7126-7138 (2019).</li>
<li>Heczey, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-GD2+CAR-NKT+cells+in+patients+with+relapsed+or+refractory+neuroblastoma%3A+an+interim+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Anti-GD2 CAR-NKT cells in patients with relapsed or refractory neuroblastoma: an interim analysis.</a> Nature Medicine. 26 (11), 1686-1690 (2020).</li>
<li>Exley, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+Transfer+of+Invariant+NKT+Cells+as+Immunotherapy+for+Advanced+Melanoma%3A+A+Phase+I+Clinical+Trial%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Adoptive Transfer of Invariant NKT Cells as Immunotherapy for Advanced Melanoma: A Phase I Clinical Trial.</a> Clinical Cancer Research. 23 (14), 3510-3519 (2017).</li>
<li>Wolf, B. J., Choi, J. E., Exley, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Approaches+to+Exploiting+Invariant+NKT+Cells+in+Cancer+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Novel Approaches to Exploiting Invariant NKT Cells in Cancer Immunotherapy.</a> Frontiers in Immunology. 9, 384(2018).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada milyonlarca kullanıma hazır iNKT hücresi elde etmek için tekrarlanabilir ve uygulanabilir bir protokol gösteriyoruz. Bu hücrelerin vivo'nun azlığı nedeniyle, onları genişletmek için bir yönteme çok ihtiyaç vardı. Önerdiğimiz protokol ne belirli bir enstrümantasyon ne de yüksek sayıda fare gerektiriyor. İşlem için gerekli fare sayısını azaltmak için iVα14-Jα18 transgenik farelerden bilerek yararlandık.
iVα14-Jα18 transgenik farelerden iNKT hücre genişletme için başka bir başarılı protoko...

Değişmez Doğal öldürücü T hücreleri (iNKT hücreleri), MHC sınıfı I ile ilgili molekül CD1d2tarafından sunulan lipid antijenleri için özel olan sınırlı bir dizi farklı Vβ zinciri1ile eşleştirilmiş, farelerde yarı sabit bir αβ T hücre reseptörü (TCR) ifade eden doğuştan gelen T lenfositlerdir. iNKT hücreleri, bir CD4+ ve bir CD4- alt kümesi üreten birkaç olgunlaşma aşaması3,4, ile meydana gelen timusta zaten aktif / doğuştan gelen bir efektör fenotipinin alınmasıyla sonuçlanan bir agonist seçim programına tabidir. Bu program sayesinde, iNKT hücreleri sırasıyla T-bet, GATA3, PLZF ve RORφt transkripsiyon faktörlerinin ifadesiyle tanımlanabilen TH1 (iNKT1), TH2 (iNKT2) ve TH17 (iNKT17)olmaküzere farklı T yardımcı (TH)efektör fenotipleri edinir. iNKT hücreleri bir dizi mikrobiyal lipit tanır, ancak aynı zamanda kanser ve otoimmünite gibi hücre stresi ve doku hasarının patolojik durumları bağlamında güncellenmiş endojen lipitlere karşı kendi kendine reaktiftir2. Aktivasyon üzerine, iNKT hücreleri doğrudan temas ve sitokin üretimi ile diğer doğuştan gelen ve adaptif immün efektör hücrelerin işlevlerini modüleederek 2.
iNKT hücrelerinin araştırılması, CD1d eksikliği veya Jα18 eksikliği olan fareler de dahil olmak üzere fare modelleri ve antijen yüklü CD1d tetramerlerin üretimi ve insan yarı sabit TCR'ye özgü monoklonal antikorların (mAbs) üretimi ile kolaylaştırılmıştır. Ancak, birincil fare iNKT hücre hattının üretimi zor olmuştur. iNKT hücrelerinin antitümör işlevlerini daha iyi karakterize etmek ve bunları benimseyen hücre tedavisi için kullanmak için, iNKT hücrelerinin vahşi tip farelerden 30 kat daha sık olduğu iVα14-Jα18 transgenik farelerin (iVα14Tg)6'nındalak iNKT hücrelerini arındırmak ve genişletmek için bir protokol belirledik.
Genişletilmiş iNKT hücreleri in vitro tahliller için kullanılabilir ve farelere geri transfer edildikten sonra in vivo olarak kullanılabilir. Bu ortamda, örneğin, güçlü anti-tümör etkilerini gösterdik7. Ayrıca, in vitro genişletilmiş iNKT hücreleri, enjeksiyonlarından önce gen transferi veya düzenleme yoluyla fonksiyonel modifikasyonaelverişlidir invivo 8 Moleküler yolların içgörülü fonksiyonel analizine izin vermenin yanı sıra gelişmiş hücre tedavilerinin önünü açmak.

<table><tbody><tr><td>Evde</td><td></td> <td>Amonyum-Klorür-Potasyum (ACK) çözeltisi</td><td>0.15M NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1mM EDTA, pH 7.2-7.4</td></tr><tr><td>anti-FITC Mikro boncuklar</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-701</td><td></td></tr><tr><td>anti-PE Mikro boncuklar</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-801</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B6542</td><td></td></tr><tr><td>CD19 -FITC</td><td>Biolegend</td><td>115506</td><td>klon 6D5</td></tr><tr><td>CD1d-tetramer -PE</td><td>NIH tetramer çekirdek tesis</td><td></td><td>faresi PBS57-Cd1d-tetramerler</td></tr><tr><td>CD4 -PeCy7 Biolegend</td><td></td><td>100528</td><td>klonu RM4-5</td></tr><tr><td>Fc bloker</td><td>BD Bioscience</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>Euroclone</td><td>ECS0186L</td><td>ısıyla inaktive edilmiş ve filtrelenmiş .22</td></tr><tr><td>kullanmadan önce FOXP3 Transkripsiyon faktörü boyama tamponu</td><td>eBioscience</td><td>00-5523-00</td><td></td></tr><tr><td>H2 (IAb) -FITC</td><td>Biolegend</td><td>114406</td><td>klonu AF6-120.1</td></tr><tr><td>hrIL-2</td><td>Chiron Corp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İyonomisin</td><td></td><td>Sigma I0634</td><td></td></tr><tr><td>LD Sütunları</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-901</td><td></td></tr><tr><td>LS Sütunları</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS tamponu (MB)</td><td>evde</td><td></td><td>% 0.5 Sığır Serum Albümini (BSA; Sigma-Aldrich) ve 2Mm EDTA</td></tr><tr><td>MS Sütunları</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Esansiyel olmayan amino asitler</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin ve streptomisin (Pen-Strep)</td><td>Lonza</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PermWash</td><td>BD Bioscience</td><td>51-2091KZ</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS)</td><td>EuroClone</td><td>ECB4004L</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Ön Ayırma Filtreleri (30 & mikro; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Recombinat Fare IL-7</td><td>R& D Sistemi</td><td>407-ML-025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640, glutamax</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>sodyum piruvat</td><td>Gibco</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>TCR ve beta; -APC</td><td>Biolegend</td><td>109212</td><td>klonu H57-597</td></tr> <tr><td>ve alfa; CD3CD28 fare T aktivatörü Dynabeads</td><td>Gibco</td><td>11452D</td><td></td></tr> <tr><td>ve beta;-merkaptoetanol</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro ve in vivo Çalışmalar için fare değişmez doğal Öldürücü t hücrelerinin saflaştırılması ve genişlemesi

Purification and Expansion of Mouse Invariant Natural Killer T Cells for in vitro and in vivo Studies

Değişmez Doğal Öldürücü T (iNKT) hücreleri, polimorfik olmayan MHC sınıfı I ile ilişkili molekül CD1d. Preklinik ve klinik çalışmalar kanser, otoimmünite ve bulaşıcı hastalıklarda iNKT hücreleri için bir rolü desteklemektedir. iNKT hücreleri türler boyunca çok korunmuş ve cd1d eksikliği veya iNKT eksikliği olan fareler de dahil olmak üzere fare modelleri tarafından araştırılmıştır ve yarı sabit TCR'ye özgü CD1d tetramerleri veya mAb'leri olan farelerde ve erkeklerde bunları kesin olarak tespit etme imkanı. Bununla birlikte, iNKT hücreleri nadirdir ve herhangi bir çalışma için yönetilebilir sayılara ulaşmak için genişletilmeleri gerekir. Birincil fare iNKT hücre hattı in vitro'nun üretimi zor olduğu kanıtlandığı için, iNKT hücrelerinin 30 kat daha sık olduğu iVα14-Jα18 transgenik farelerden (iVα14Tg) dalak iNKT hücrelerini arındırmak ve genişletmek için sağlam bir protokol kurduk. Burada birincil dalak iVα14Tg iNKT hücrelerinin immünomanyetik bir ayırma işlemi ile zenginleştirilerek yaklaşık% 95-98 saf iNKT hücresi elde edilebileceğini gösteriyoruz. Saflaştırılmış iNKT hücreleri anti-CD3/CD28 boncuklar artı IL-2 ve IL-7 ile uyarılır ve bu da kültürün %85-99 saflığı ile +14 gün boyunca 30 kat genişlemeye neden olur. Genişletilmiş iNKT hücreleri kolayca genetik olarak manipüle edilebilir, aktivasyon ve fonksiyon in vitro mekanizmalarını parçalamak için paha biçilmez bir araç sağlar ve daha da önemlisi, in vivo olarak benimsenen transfer üzerine.

Bu yazıda açıklanan protokol, iVa14-Ja18 transgenik farelerin dalağının iNKT hücrelerini Şekil 1A'daözetlenen bir immünmanyetik ayırma işlemi ile zenginleştirmeyi sağlar. Toplam dalak T hücreleri önce B hücreleri ve monositler tükenerek negatif olarak seçilir, ardından PBS-57 lipid antijen yüklü CD1d tetramerler ile iNKT hücre pozitif immünomanyetik sıralama, özellikle sadece iNKT hücrelerini lekelemeyi sağlar. Bu protokol, tek bir iVa14-Ja18 Tg farenin dalağının dalağının yaklaşık 2 x 10<su...

Değişmez doğal öldürücü T (iNKT) hücrelerini fare dalağını zenginleştirmek ve in vitro ve in vivo çalışmalar için uygun sayılara genişletmek için hızlı ve sağlam bir protokol açıklıyoruz.

In vitro ve in vivo Çalışmalar için Fare Değişmez Doğal Öldürücü T Hücrelerinin Saflaştırılması ve Genişlemesi

Invariant Natural Killer T (iNKT) cells are innate-like T Lymphocytes expressing a conserved semi-invariant T cell receptor (TCR) specific for self or ...

Bu protokol, çok nadir görülen MÜREKKEP T hücrelerinin saflaştırılmasını sağlar ve sayılarında 30 kat genişlemeye izin verir. Saflaştırma bir günde yapılabilir ve iki hafta içinde in vivo ve in vitro çalışmalar için çok sayıda kullanıma hazır MÜREKKEP T hücresi üretebilir. Prosedürü gösteren gloria Delfanti olacak, laboratuvarda doktora sonrası.Fare dalağını inceledikten sonra, %2 FBS ile 10 mililitre PBS'de tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için 70 nanometre hücre süzgecinden geçirin. Beş dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj. Süpernatant çıkarın ve hücre peletini bir mililitre steril amonyum klorür potasyum lizin tamponu ile yeniden dürtün.Hücreleri oda sıcaklığında üç dakika kuluçkaya yaslayın, ardından%2 FBS ile beş mililitre PBS ile engelleyin. Beş dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj. Süpernatantı çıkardıktan sonra, hücre peletini %2 FBS ile üç mililitre PBS'de yeniden ıslatın ve pipetleme ile yağ kalıntılarını giderin.Zenginleştirme adımları için hücreleri soğuk tutun ve çözeltileri dört santigrat derecede önceden soğutun ve daha sonra buzda tutun. Beş dakika boyunca 300 kez G'de santrifüj. Tüm hücreleri %2 FPS ve Fc bloker ile uygun miktarda PBS'de yeniden depolayın ve

purification-expansion-mouse-invariant-natural-killer-t-cells-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Burada genişletmek ve verimli bir şekilde arındırmak çok sayıda insan NK hücre ve kendi fonksiyonunu değerlendirmek için bir metodu tanımlar.

Genişleme, Saflaştırılması, ve İnsan Periferik Kan NK Hücrelerinin Fonksiyonel Değerlendirme

Bu video, seçici genişleme için insan karaciğer dokusundan doğal öldürücü hücreler veya NK hücreleri de dahil olmak üzere lenfositlerin izolasyonunu göstermektedir. Enzimatik ve mekanik sindirim, ardından yoğunluk gradyan ayrımı, NK hücreleri de dahil olmak üzere lenfosit izolasyonunu destekler. Toplanan lenfositler, NK hücrelerinin seçici genişlemesi için daha fazla kullanılabilir.

Seçici Genişleme için Karaciğer Dokusundan Doğal Öldürücü Hücre İzolasyonu

Bu videoda, iNKT hücreleri olarak da bilinen değişmez doğal öldürücü T hücrelerinin izole edilmesi için bir yöntem gösterilmektedir. Prosedür, dalaktaki iNKT hücrelerinin aktivasyonunu ve çoğalmasını uyarmak için bir fareye sentetik bir glikolipid enjekte edilmesiyle başlar. Daha sonra, dalaktan tek hücreli süspansiyonlar hazırlanır ve floroforlarla etiketlenmiş iNKT hücre tanıyan komplekslerle inkübe edilir, ardından iNKT hücrelerini izole etmek için manyetik boncuk bazlı ayırma yapılır.

Bir Fare Modelinden Değişmez Doğal Öldürücü T Hücrelerinin İzole Edilmesi

Naif CD4+ T hücreleri, aktivasyon sırasındaki ortama bağlı olarak çeşitli alt kümelere polarize olur.  Naif CD4 + T hücrelerinin çeşitli efektör alt kümelerine farklılaşması, T hücresi reseptör uyaranlarının ve spesifik sitokin sinyallerinin eklenmesiyle in vitro olarak elde edilebilir.

Fare Naif CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Hücre İzolasyonu ve<em&gt; In vitro</em&gt; T hücre alt içine Farklılaşma

Burada, fare dalağından çok sayıda murin değişmez doğal öldürücü T hücresi oluşturmak için kullanılabilecek uyarlanmış bir protokol sunuyoruz. Protokol, splenik iNKT hücrelerinin sınırlı sayıda hayvan ve reaktif kullanılarak in vitro olarak zenginleştirilebileceği, izole edilebileceği ve genişletilebileceği bir yaklaşımı özetlemektedir.

Fare Dalak Değişmeyen Doğal Öldürücü T Hücreleri İzolasyon ve Yaygınlaştırılması için optimize Yöntemi

Farklı dendritik hücre alt kümeleri, lenfoid organlarda nadir popülasyonlar olarak bulunur ve bu nedenle immünolojik deneyler için yeterli sayıda ve saflıkta izole edilmesi zordur. Burada, fare splenik dendritik hücrelerinin şu anda bilinen tüm ana alt kümelerinin izolasyonu için yüksek verimli, yüksek verimli bir yöntem açıklıyoruz.

Fare Dendritik Hücre Alt Grupları İzolasyonunda bir Verimli ve Yüksek Verim Yöntem

Lenfositler, adaptif immün yanıtlarda ana oyunculardır. Burada, in vitro ve in vivo lenfosit aktivasyonunda istenen moleküllerin fizyolojik fonksiyonlarını belirlemek için bir lenfosit saflaştırma protokolü sunuyoruz. Açıklanan deneysel prosedürler, kontrol ve genetik olarak değiştirilmiş lenfositler arasındaki fonksiyonel kapasiteleri karşılaştırmak için uygundur.

İzolasyon ve murin lenfositlerin aktivasyonu

Burada, bir protokol saf CD4 T hücre (T hücre) etkinleştirme, yayılması ve GM-CSF kemik iliği (BM) tarafından indüklenen Th1 farklılaşma vivo içinde belirlenmesi için mevcut-dendritik hücreler (DC) türetilmiş. Ayrıca, bu iletişim kuralını BM ve T-hücre izolasyon, DC üretimi ve DC ve T hücreli evlat edinen transfer açıklar.

Vivo fare modeli ölçü saf CD4 T Hücre aktivasyonu, yayılması ve kemik iliği türevi dendritik hücreler tarafından indüklenen Th1 farklılaşma

Burada, sitotoksisik T lenfosit (CTL) yanıt olarak bir model tümör antijeni için immundominance muayene sağlayan bir akış sitometri tabanlı in vivo öldürme tahlil tarif. Biz bu zarif tahlil mekanik çalışmalar için ve ilaç etkinliği test için istihdam olabilir nasıl örnekler sunuyoruz.

Tümör-spesifik CD8+ T hücre tepkiler Immunodominance çalışması Için In vivo sitotoksisite assays terzilik

Bu, uterus lenfoid hücrelerini hem hamile hem de hamile olmayan farelerden izole etmek için bir yöntemdir. Bu yöntem, FACS fenotipleme, hücre sıralama, işlevsel tahliller, RNA-seq ve proteomik gibi birden çok aşağı akış uygulaması için kullanılabilir. Buradaki protokol, akış sitometrisi ile kandine doğuştan gelen lenfoid hücrelerin fenotip grup 1 rahiminin nasıl olduğunu göstermektedir.

Akış Sitometrisi ile Analiz için Uterus Doğuştan Gelen Lenfoid Hücrelerin İzolasyonu

Öğrenin fare dalaklarından iNKT hücrelerinin saflaştırılması ve 30 kat genişletilmesi yöntemini. Bu protokol, immünoloji ve hücre biyolojisi araştırmalarında in vitro ve in vivo çalışmalar için yeterli hücre sağlar.

In vitro ve in vivo Çalışmalar için Fare Değişmez Doğal Öldürücü T Hücrelerinin Saflaştırılması ve Genişlemesi

Daha fazla video keşfet