Name: Sinovyal Sıvı Mezenkimal Kök Hücre Kaynaklı Eksozomların 3D Biyoreaktör Kültürü ile Büyük Ölçekli Hazırlanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Keşfedin sinovyal sıvı mezenkimal kök hücrelerden GMP kaliteli eksozom üretimini 3D biyoreaktör kullanarak. Bu yöntem eksozom biyolojisi araştırmaları ve artrit tedavisi için klinik uygulamalarda araştırmacılara yüksek verimli bir protokol sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 81972116, No. 81972085, No. 81772394); Guangdong Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı Anahtar Programı (No.2018B0303110003); Guangdong Uluslararası İşbirliği Projesi (No.2021A0505030011); Shenzhen Bilim ve Teknoloji Projeleri (Hayır. GJHZ20200731095606019, No. JCYJ20170817172023838, No. JCYJ20170306092215436, No. JCYJ20170413161649437); Çin Doktora Sonrası Bilim Vakfı (No.2020M682907); Guangdong Temel ve Uygulamalı Temel Araştırma Vakfı (No.2021A1515010985); Shenzhen'de Sanming Tıp Projesi (SZSM201612079); Guangdong Eyaletinde Üst Düzey Hastanelerin İnşaatı için Özel Fonlar.

Bu çalışma Shenzhen İkinci Halk Hastanesi İnsan Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır. hSF-MSC'lerden izole edilen eksozomların şematik diyagramı in vitro protokolde Şekil 1'de gösterilmiştir.
1. İnsan SF-MSC'lerinin kültürü ve tanımlanması
<ol><li>Klinik OA hastalarından bir şırınga ve iğne kullanarak 20 mL SF hasat edin.<ol><li>OA hastasının diz eklemini dezenfekte edin. Kuadriseps femoris tendonundan patellanın dışından 7 # iğne ile eklem boşluğuna delinme.</li>
		<li>Eklem sıvısının 10 mL'sini çıkarın. Delinme bölgesini transfüzyon çubuğu ile örtün ve 5 dakika boyunca bastırın.</li>
	</ol></li>
	<li>SF süpernatantını 1.500 x g'de santrifüjlemeden sonra 4 °C'de 10 dakika boyunca atın.</li>
	<li>Hücre peletini 10 mL 1x fosfat tampon salin (PBS) ile yeniden askıya alın, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1.500 x g'de santrifüj yapın ve PBS'yi atın.</li>
	<li>Peleti 10 mL insan MSC kültür ortamı ile 5 x 104 hücre/mL hücre yoğunluğunda yeniden askıya alın (bkz. Malzeme Tablosu) ve ardından süspansiyonu 100 mm'lik bir tabakta plakalayın.</li>
	<li>Çanağı% 5 CO 2 içeren bir atmosferde 37 ° C'deinkübe edin.</li>
	<li>48 saat sonra, ortamı değiştirerek yapışkan olmayan hücreleri çıkarın ve 1x PBS ile yıkayın. Ortamı 2 hafta boyunca her 3 günde bir değiştirin.</li>
	<li>Hücre kültürü süpernatantlarını toplayın.</li>
	<li>Akış sitometrisini kullanarak SF-MSC'leri tanımlayın.<ol><li>SF-MSC'lerin üçüncü neslini (P3) sindirin, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve hücre peletini toplayın. NOT: Bir pasaj, hücrelerin başka bir kültür kabına alt kültürü olarak kabul edilir. SF'den izole edilen ve bulaşıklara tohumlanan birincil hücreler geçiş sıfırı (P0) olarak etiketlenir. Yaklaşık% 75 birleşmede, hücreler sindirilir ve bulaşıklardan ayrılır, diğer yemeklere ekilir ve P1 olarak etiketlenir.</li>
		<li>Hücre peletine (5 x 104) 400 μL bloke tampon (1x PBS'de% 1 BSA) ekleyin ve oda sıcaklığında (RT) 15 dakika bekletin.</li>
		<li>4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.000 x g'de santrifüj yapın, süpernatanı atın ve peleti 100 μL 1x PBS'de yeniden askıya alın.</li>
		<li>Tüp başına 1 μL CD105, CD73, CD90, CD45, CD34, HLA-DR monoklonal floresan antikoru (seyreltme oranı 1:100) ekleyin ( bakınız Malzeme Tablosu) ve RT'de 30 dakika inkübe edin.</li>
		<li>1x PBS ile iki kez yıkayın ve süpernatanı atın. Hücre peletini toplayın ve 100 μL 1x PBS'de yeniden askıya alın.</li>
		<li>Floroforları tespit etmek için 525/50 ve 585/40 filtrelerini kullanarak bir akış sitometresinde 10.000 hücreye kadar tespit edin.</li>
	</ol></li>
</ol>2.3D biyoreaktör hücre kültürü
<ol><li>Mikrotaşıyıcı hazırlama<ol><li>Kuru 0.75 g mikrotaşıyıcıyı şişirin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve RT'de en az 3 saat boyunca 1x Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salini (DPBS) (50 mL / g mikrotaşıyıcı) içinde nemlendirin.</li>
		<li>Süpernatantı boşaltın ve mikro taşıyıcıları taze DPBS'de (50 mL / g mikro taşıyıcılar) 5 dakika boyunca yıkayın. PBS'yi atın ve yeni 1x DPBS (50 mL/g mikro taşıyıcı) ile değiştirin.</li>
		<li>Mikrotaşıyıcıları otoklavlama ile sterilize edin (121 °C, 15 dk, 15 psi). Sterilize edilmiş mikro taşıyıcıların yerleşmesine izin verin, süpernatanı boşaltın.</li>
		<li>Mikro taşıyıcıları RT'de kültür ortamında (50 mL / g mikro taşıyıcılar) kısaca durulayın. mikro taşıyıcıların yerleşmesine izin verin, süpernatanı atın.</li>
	</ol></li>
	<li>Perfüzyon biyoreaktörü<ol><li>Biyoreaktörü otoklavlama ile sterilize edin (121 °C, 15 dk, 15 psi).</li>
		<li>SF-MSC'lerin sayısını sayın ve GMP sınıfı MSC kültür ortamı (250 mL) ile perfüze edilen biyoreaktöre 2,5 x 107 SF-MSC ve mikro taşıyıcı tahsis edin.</li>
		<li>Biyoreaktörü 37 °C'de %5 CO2 olan bir inkübatöre koyun. Biyoreaktörü 15 rpm hızında döndürün. Kültür ortamını her 6 günde bir değiştirin.</li>
		<li>14 gün boyunca kültürden sonra daha fazla analiz için hücre kültürü süpernatantlarını ve mikro taşıyıcılarını toplayın.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Eksozom tanımlama ve güvenlik tespiti
<ol><li>Ultrasantrifüjleme<ol><li>Hücre kültürü süpernatantını 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin ve süpernatanı toplayın; hücresel kalıntıları atın.</li>
		<li>Süpernatantları 4 ° C'de 10 dakika boyunca 2.000 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı toplayın; daha büyük vezikülleri (apoptotik cisimler ve bazı daha büyük mikro-parçacıklar) atın.</li>
		<li>Daha büyük vezikülleri çıkarmak için süpernatantı 4 ° C'de 30 dakika boyunca 10.000 x g'de tekrar santrifüj yapın; peletleri toplayın ve 40 mL 1x PBS'de askıya alın.</li>
		<li>Askıya alınmış peletleri 4 ° C'de 70 dakika boyunca 120.000 x g'de santrifüj edin, süpernatanı atın ve eksozom içeren peletleri 500 μL 1x PBS'de yeniden askıya alın.</li>
	</ol></li>
	<li>Nanopartikül izleme analizi (NTA) NOT: Her çalıştırma için, numunenin 500 μL'si odaya 30 μL/dak akış hızında enjekte edildi. Analizi 24,4 °C-24,5 °C'de gerçekleştirin.<ol><li>Yeni izole edilmiş eksozom numunelerini, 107-10 9 / mL parçacık içeren steril 1x PBS ila 1 mL ile seyreltin ve bunları nanopartikül izleme analiz sistemine enjekte edin (bkz.</li>
		<li>Yakalama ve analiz sistemini üreticinin protokolüne göre manuel olarak ayarlayın. Lazer ışık saçılmasıyla parçacıkları görselleştirin ve dijital videoda Brownian hareketlerini yakalayın.</li>
		<li>Kaydedilen video kasetleri, çalışma başına en az 200 ayrı parçacığı izlemeye dayalı olarak yazılım kullanarak analiz edin (bkz.</li>
	</ol></li>
	<li>Transmisyon elektron mikroskobu<ol><li>Eksozomları 5 dakika boyunca% 4 paraformaldehit (soğuk 1x DPBS içinde) içinde sabitleyin.</li>
		<li>Eksozomların 5 μL'sini bakır ızgaralara monte edin. Bu deneyde, eksozomların konsantrasyonu bir protein tahlil kiti tarafından ölçülen 1 mg / mL'dir (bakınız Malzeme Tablosu).</li>
		<li>Eksozomları buz üzerinde 10 dakika boyunca% 3 fosfotungstik asit içine yerleştirin. Fazla asidi çıkarın ve numuneleri RT'de kurutun.</li>
		<li>Eksozom örneklerini 100 kV'luk bir hızlanma voltajında bir TEM ile görüntüleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Batı lekelenmesi<ol><li>Eksozomlara 300 μL lizis tamponu (%1 Triton X-100, %0,1 SDS, 0,1 M Tris HCl, pH 7) ve proteaz inhibitörleri kokteyli (bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin.</li>
		<li>Lizis tamponundaki eksozomları yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın ve 20 dakika boyunca buz üzerinde durmasına izin verin.</li>
		<li>Karışımı 4 ° C'de 10 dakika boyunca 9.391 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı toplayın. Bir protein tahlil kiti kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün (bakınız Malzeme Tablosu).</li>
		<li>100 μL 4x protein yükleme tamponu ekleyin ve 10 dakika boyunca 100 ° C'de ısıtın.</li>
		<li>10 mg / mL'lik bir konsantrasyonda 15 μL protein yükleyin ve jel elektroforezi (120 V, 70 dakika) ve 100 V'da elektroblotlama ile çalıştırın, 4 ° C'de 60 dakika.</li>
		<li>Eksozom-spesifik olmayan belirteçleri (kalneksin) ve ekzozomal biyobelirteçleri (CD9, CD63 ve CD81) floresan batı lekelemesi ile tespit edin (bkz.</li>
	</ol></li>
	<li>Güvenlik testi<ol><li>Bakteri, mantar ve Mycobacterium tuberculosis tespiti için 3.5.2-3.5.5 adımlarını izleyin.</li>
		<li>Bir kan agar kültür plakası üzerinde eksozom çözeltisinin (1 mg / mL) 100 μL'sini tohumlayın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve kültür plakasını 24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
		<li>Bir sabouraud agar orta plaka üzerinde eksozom çözeltisinin (1 mg / mL) 100 μL'sini tohumlayın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 48 saat boyunca 35 ° C'de inkübe edin.</li>
		<li>Bir Lowenstein-Jensen kültürü orta plakası üzerinde eksozom çözeltisinin (1 mg / mL) 100 μL'sini tohumlayın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 3 hafta boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
		<li>Makroskopik gözlem ile bakteri, mantar ve Mycobacterium tuberculosis kolonilerinin görünümünü tespit edin. NOT: Eksozomların güvenliğini değerlendirme kriterleri, kültür plakasında mikroorganizmaların bulunmamasıdır.</li>
		<li>Mikoplazma algılaması için 3.5.7-3.5.9 arasındaki adımları izleyin.</li>
		<li>Eksozomları kitte bulunan 50 μL tampon çözeltisinde yeniden askıya alın ve 3 dakika boyunca 95 ° C'de ısıtın.</li>
		<li>Bir PCR Mycoplasma tespit kiti kullanarak eksozom çözeltisindeki Mycoplasma'yı yükseltin (bakınız Malzeme Tablosu).</li>
		<li>PCR ürünlerini %1,5 agaroz jel elektroforezinde (30 dk, 120 V) tespit edin.</li>
	</ol></li>
</ol>4. In vitro eksozom fonksiyon tespiti
<ol><li>Eksozom etiketleme<ol><li>100 μL eksozomları (1 mg/mL) 1 mM Dil (1000x) ile etiketleyin ( bakınız Malzeme Tablosu) ve RT'de 30 dakika boyunca inkübe edin.</li>
		<li>Eksozomları 70 dakika boyunca 100.000 x g'de ultrasantrifüjleme ile geri kazanın. Peleti 500 μL 1x PBS'de yeniden askıya alın.</li>
	</ol></li>
	<li>Cy3-miR-140 taklitlerinin eksozomlara yüklenmesi<ol><li>1 μg/μL ekzozomal protein ve 5 μmol/mL Cy3-miR-140'ı 400 μL elektroporasyon tamponunun (1.15 mM potasyum fosfat (pH 7.2), 25 mM potasyum klorür ve% 21'inin (v/v) son hacminde karıştırın (bkz.</li>
		<li>Karışımı soğuk 0,4 cm elektroporasyon küvetlerine ve bir gen transfeksiyon sistemi kullanarak 300 V / 100 μF kapasitansta elektroporata aktarın (bkz.</li>
		<li>Elektroporasyondan hemen sonra, eksozom membranının tamamen restore edildiğinden emin olmak için karışımı RT'de 30 dakika tutun.</li>
		<li>Eksozomların dışındaki miRNA taklitlerini ortadan kaldırmak için karışımları bir birim RNaz A ile ( Malzeme Tablosuna bakınız) 20 dakika boyunca tedavi edin.</li>
		<li>Eksozom karışımını 90 dakika boyunca 120.000 x g'de ultracentrifugate, süpernatantı atın ve eksozomları 500 μL 1x PBS'de yeniden askıya alın.</li>
	</ol></li>
	<li>Eksozom alım testi<ol><li>Kondrositleri (1 x 107) 35 mm konfokal kaplarda% 10 FBS içeren 1 mL DMEM / F12 ile tohumlayın.</li>
		<li>24 saatten sonra, kondrositleri 1 saat boyunca DiI etiketli eksozomlarla (100 ng / mL) veya cy3-miR-140 yüklü eksozomlarla (100 ng / mL) tedavi edin.</li>
		<li>1x PBS ile üç kez yıkayın ve ardından RT'de 10 dakika boyunca DAPI (10 ng/mL) ile etiketleyin.</li>
		<li>Floresan sinyalini uygun filtreleri kullanarak konfokal lazer taramalı floresan mikroskobuna (CLSM) kaydedin (bkz.</li>
	</ol></li>
</ol>5. İstatistiksel analiz
<ol><li>Uygun istatistiksel yazılımı kullanarak istatistiksel analiz yapın. NOT: Her bir şekildeki temsili veriler, SD ± ortalaması olarak ifade edilmiştir. İstatistik yazılımı kullanılarak iki grubun karşılaştırılmasında Student t-testi kullanılmıştır. Birden fazla grup arasında karşılaştırma yapılması durumunda Tukey'in multiplini takip eden tek yönlü bir ANOVA gerçekleştirildi. P değerleri <0,05 (*), <0,01 (**) veya <0,001 (***).</li>
</ol>

<ol><li>Cross, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+burden+of+hip+and+knee+osteoarthritis%3A+estimates+from+the+global+burden+of+disease+2010+study%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">The global burden of hip and knee osteoarthritis: estimates from the global burden of disease 2010 study.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 73 (7), 1323-1330 (2014).</li>
<li>Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoarthritis%3A+a+disease+of+the+joint+as+an+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ.</a> Arthritis & Rheumatology. 64 (6), 1697-1707 (2012).</li>
<li>Huey, D. J., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlike+bone%2C+cartilage+regeneration+remains+elusive%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Unlike bone, cartilage regeneration remains elusive.</a> Science. 338 (6109), 917-921 (2012).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+recruitment+of+endogenous+stem+cells+and+chondrogenic+differentiation+by+a+composite+scaffold+containing+bone+marrow+homing+peptide+for+cartilage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Increased recruitment of endogenous stem cells and chondrogenic differentiation by a composite scaffold containing bone marrow homing peptide for cartilage regeneration.</a> Theranostics. 8 (18), 5039-5058 (2018).</li>
<li>Ogura, T., Bryant, T., Merkely, G., Mosier, B. A., Minas, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+analysis+of+revision+autologous+chondrocyte+implantation+for+failed+ACI%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Survival analysis of revision autologous chondrocyte implantation for failed ACI.</a> American Journal of Sports Medicine. 47 (13), 3212-3220 (2019).</li>
<li>Welch, T., Mandelbaum, B., Tom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+chondrocyte+implantation%3A+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Sports+Medicine+and+Arthroscopy+Review%22%5BJournal%5D)">Autologous chondrocyte implantation: past, present, and future.</a> Sports Medicine and Arthroscopy Review. 24 (2), 85-91 (2016).</li>
<li>McGonagle, D., Baboolal, T. G., Jones, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+joint-resident+mesenchymal+stem+cells+for+cartilage+repair+in+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Native joint-resident mesenchymal stem cells for cartilage repair in osteoarthritis.</a> Nature Reviews Rheumatology. 13 (12), 719-730 (2017).</li>
<li>Jo, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-articular+injection+of+mesenchymal+stem+cells+for+the+treatment+of+osteoarthritis+of+the+knee%3A+a+proof-of-concept+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Intra-articular injection of mesenchymal stem cells for the treatment of osteoarthritis of the knee: a proof-of-concept clinical trial.</a> Stem Cells. 32 (5), 1254-1266 (2014).</li>
<li>Pers, Y. M., Ruiz, M., Noël, D., Jorgensen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+for+the+management+of+inflammation+in+osteoarthritis%3A+state+of+the+art+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells for the management of inflammation in osteoarthritis: state of the art and perspectives.</a> Osteoarthritis Cartilage. 23 (11), 2027-2035 (2015).</li>
<li>Neybecker, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+potentialities+for+cartilage+repair+from+human+advanced+knee+osteoarthritis+synovial+fluid-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo potentialities for cartilage repair from human advanced knee osteoarthritis synovial fluid-derived mesenchymal stem cells.</a> Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 329(2018).</li>
<li>Jia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic-activated+cell+sorting+strategies+to+isolate+and+purify+synovial+fluid-derived+mesenchymal+stem+cells+from+a+rabbit+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Magnetic-activated cell sorting strategies to isolate and purify synovial fluid-derived mesenchymal stem cells from a rabbit model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), (2018).</li>
<li>Phinney, D. G., Pittenger, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+MSC-derived+exosomes+for+cell-free+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: MSC-derived exosomes for cell-free therapy.</a> Stem Cells. 35 (4), 851-858 (2017).</li>
<li>Phan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+mesenchymal+stem+cells+to+improve+their+exosome+efficacy+and+yield+for+cell-free+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Engineering mesenchymal stem cells to improve their exosome efficacy and yield for cell-free therapy.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1522236(2018).</li>
<li>Dominici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+criteria+for+defining+multipotent+mesenchymal+stromal+cells.+The+international+society+for+cellular+therapy+position+statement%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement.</a> Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).</li>
<li>Lv, F. -J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+the+surface+markers+and+identity+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: the surface markers and identity of human mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells. 32 (6), 1408-1419 (2014).</li>
<li>Samsonraj, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+Multifaceted+characterization+of+human+mesenchymal+stem+cells+for+use+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (12), 2173-2185 (2017).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells for regenerative medicine.</a> Cells. 8 (8), (2019).</li>
<li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+derived+from+human+neural+stem+cells+stimulated+by+interferon+gamma+improve+therapeutic+ability+in+ischemic+stroke+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Advanced+Research%22%5BJournal%5D)">Exosomes derived from human neural stem cells stimulated by interferon gamma improve therapeutic ability in ischemic stroke model.</a> Journal of Advanced Research. 24, 435-445 (2020).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+ability+and+Toll-like+receptor+expression+of+human+mesenchymal+stem+cells+improves+significantly+after+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Migration ability and Toll-like receptor expression of human mesenchymal stem cells improves significantly after three-dimensional culture.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 491 (2), 323-328 (2017).</li>
<li>Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+spheroid+formation+of+human+adipose-derived+stem+cells+on+chitosan+films+on+stemness+and+differentiation+capabilities%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities.</a> Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).</li>
<li>Guo, L., Zhou, Y., Wang, S., Wu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+changes+of+mesenchymal+stem+cells+in+three-dimensional+%283D%29+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Epigenetic changes of mesenchymal stem cells in three-dimensional (3D) spheroids.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (10), 2009-2019 (2014).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+administration+of+cell-free+exosomes+generated+by+human+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells+cultured+under+2D+and+3D+conditions+improves+functional+recovery+in+rats+after+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Systemic administration of cell-free exosomes generated by human bone marrow derived mesenchymal stem cells cultured under 2D and 3D conditions improves functional recovery in rats after traumatic brain injury.</a> Neurochemistry International. 111, 69-81 (2017).</li>
<li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+of+MSCs+produces+exosomes+with+improved+yield+and+enhanced+therapeutic+efficacy+for+cisplatin-induced+acute+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture of MSCs produces exosomes with improved yield and enhanced therapeutic efficacy for cisplatin-induced acute kidney injury.</a> Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 206(2020).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Mezenkimal kök hücreler, kendini yenilemeleri, özel fonksiyonlara sahip doku hücrelerine farklılaşmaları ve parakrin etkileri nedeniyle rejeneratif tıpta yaygın olarak kullanılmaktadır16,17. Özellikle, eksozomlar tarafından uygulanan parakrin etkiler çok dikkat çekmiştir18. Eksozomlar, MSC'lerin biyo-bilgilerini taşır ve biyolojik işlevlerini yerine getirir ve zahmetli depolama ve sevkiyat gibi MSC eksikliklerinin üstesinden gelir. Bu nede...

Eklem kıkırdağı ve altta yatan kemik parçalanmasından kaynaklanan osteoartrit (OA), sakatlığa yol açan ciddi bir zorluk olmaya devam etmektedir 1,2. Kan ve sinir kaynağı olmadan, kıkırdak kendi kendini iyileştirme yeteneği bir kez yaralandığında minimumdur 3,4. Son yıllarda, otolog kondrosit implantasyonuna (ACI) dayalı tedaviler OA tedavisinde bazı ilerlemeler kaydetmiştir5. Kondrosit izolasyonu ve genişlemesi için, OA ekleminin ağırlık taşımayan alanından küçük kıkırdak toplanması gereklidir ve bu da kıkırdakta yaralanmalara neden olur. Ayrıca, prosedür genişletilmiş kondrositleri implante etmek için ikinci bir operasyon gerektirecektir6. Bu nedenle, kıkırdak yaralanmaları olmadan OA tedavisi için tek aşamalı tedaviler kapsamlı bir şekilde araştırılmaktadır.
Mezenkimal kök hücreler (MSC) OA tedavisinde umut verici alternatifler olarak önerilmiştir 7,8. Birden fazla dokudan kaynaklanan MSC'ler, spesifik stimülasyonla kondrositlere farklılaşabilir. Önemli olarak, MSC'ler anti-inflamasyon9 yoluyla bağışıklık tepkilerini modüle edebilir. Bu nedenle MSC'ler OA tedavisinde kıkırdak defektlerini onararak ve özellikle inflamasyon ortamında immün yanıtı modüle ederek önemli avantajlar sağlamaktadır. OA tedavisi için, sinovyal sıvıdan (SF-MSC'ler) MSC'ler, diğer MSC kaynaklarından daha güçlü kondrosit farklılaşma yetenekleri nedeniyle son zamanlarda çok dikkat çekmiştir10,11. Özellikle, ortopedik klinikte, eklem boşluğundan enflamatuar SF'nin çıkarılması, OA hastalarının ağrı semptomunu hafifletmek için rutin bir tedavidir. Ekstrakte edilen inflamatuar SF genellikle tıbbi atık olarak bertaraf edilir. Hem hastalar hem de doktorlar, inflamatuar SF'den izole edilen otolog MSC'leri çok az etik çatışma ile OA tedavisi olarak düşünmeye hazırdır. Bununla birlikte, SF-MSC tedavisi tümörojenik riskler, uzun süreli depolama ve uzak sevkiyat engelleri nedeniyle tehlikeye girmektedir.
MSC'ler de dahil olmak üzere birçok hücre tipi tarafından salgılanan eksozomlar, ana hücre biyo-bilgisinin çoğunu taşır. Hücresiz tedavi olarak derinlemesine araştırılmıştır12,13. Klinik araştırma hükümeti (ClinicalTrials.gov) web sitesinde bulunan güncellenmiş kaynaklara göre, kanser, hipertansiyon ve nöro-dejeneratif hastalıkların araştırma alanlarında daha kapsamlı eksozom klinik çalışmaları başlatılmakta ve üstlenilmektedir. SF-MSC eksozom tedavisi, OA ile başa çıkmak için heyecan verici ve zorlu bir çalışma olabilir. İyi üretim uygulamaları (GMP) sınıfı ve büyük ölçekli eksozom üretimi klinik çeviri için gereklidir. Küçük ölçekli eksozom izolasyonu, iki boyutlu (2D) hücre kültürüne dayanarak yaygın olarak gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, büyük ölçekli eksozom üretim stratejilerinin optimizasyona ihtiyacı vardır. Bu çalışmada, ksenosuz koşullarda masif SF-MSC kültürüne dayanan büyük ölçekli bir eksozom üretim yöntemi geliştirilmiştir. Hücre kültürü süpernatantlarından ultrasantrifüjlemeden sonra, eksozom güvenliği ve fonksiyonu doğrulandı.

<table><tbody><tr><td>BCA tahlil kiti</td><td>ThermoFisher</td><td>23227</td><td>Protein konsantrasyonu tahlili</td></tr><tr><td>Kan agar plakası</td><td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.</td><td>P0903</td><td>Bakteri kültürü</td></tr><tr><td>CD105 antikoru</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1243C</td><td>Akış sitometrisi</td></tr><tr><td>CD34 antikoru</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1143C</td><td>Akış sitometrisi</td></tr><tr><td>CD45 antikoru</td><td>BD Bioscience</td><td>555483</td><td>Akış sitometrisi</td></tr><tr><td>CD63 antikoru</td><td>Abklonal</td><td>&nbsp; A5271</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>CD73 antikoru</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1242C</td><td>Flow sitometrisi</td></tr><tr><td>CD81 antikoru</td><td>ABklonal</td><td>&nbsp; A5270</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>CD9 antikoru</td><td>Abklonal</td><td>&nbsp; A1703</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>CD90 antikoru</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1167C</td><td>Akış sitometrisi</td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>Santrifüj 5810R</td><td></td></tr><tr><td>CO2 inkübatörü</td><td>Termo</td><td></td><td>Hücre kültürü</td></tr><tr><td>Konfokal lazer taramalı floresan mikroskobu</td><td>ZEISS</td><td>LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>Cytodex</td><td>GE Sağlık Mikro Taşıyıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dil</td><td>ThermoFisher</td><td>D1556</td><td>Eksozom etiketi</td></tr><tr><td>EZ-PCR Mikoplazma tespit kiti</td><td>BI</td><td>20-700-20</td><td>Mikoplazma tespiti</td></tr><tr><td>Flowsitometri</td><td>Beckman</td><td></td><td>MSC tanımlama</td></tr><tr><td>Gen Pulser II Sistemi</td><td>Bio-Rad Laboratuvarları</td><td>1652660</td><td>Gen transfeksiyonu</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8.0.2</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td>Sürüm 8.0.2</td><td></td></tr><tr><td>HLA-DR antikoru</td><td>Elabscience</td><td>E-AB-F1111C</td><td>Akış sitometrisi</td></tr><tr><td>Lowenstein-Jensen kültür ortamı</td><td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.</td><td>T0573</td><td>Mycobacterium tuberculosis kültürü</td></tr><tr><td>MesenGro</td><td>StemRD</td><td>MGro-500</td><td>MSC kültürü</td></tr><tr><td>Nanosight NS300</td><td>Malvern</td><td>Nanosight NS300</td><td>Nanopartikül izleme analizi</td></tr><tr><td>NTA 2.3 yazılımı</td><td>Malvern</td><td></td><td>Veri analizi</td></tr><tr><td>Odyssey FC</td><td>Gene Company Limited</td><td></td><td>Floresan batı blotting</td></tr><tr><td>OptiPrep elektroporasyon tamponu</td><td>Sigma</td><td>D3911</td><td>Gen transfeksiyonu</td></tr><tr><td>Proteaz inhibitörleri kokteyli</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td>Proteinaz inhibitörü</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Qiagen</td><td>158924</td><td>RNA'nın çıkarılması</td></tr><tr><td>Sabouraud agar plakası</td><td>Nanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.</td><td>P0919</td><td>Mantar kültürü</td></tr><tr><td>TEM</td><td></td><td>JEM-1200EX</td><td></td></tr><tr><td>Döner Hücre Kültürü Sistemi (RCCS)</td><td>Synthecon</td><td>RCCS-4HD</td><td>3D kültür</td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj</td><td>Beckman</td><td>Optima XPN-100</td><td>Eksozom santrifüjü</td></tr></tbody></table>

sinovyal sıvı mezenkimal kök hücre kaynaklı eksozomların 3d biyoreaktör kültürü ile büyük Ölçekli hazırlanması

Large-Scale Preparation of Synovial Fluid Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes by 3D Bioreactor Culture

Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler) tarafından salgılanan eksozomlar, kıkırdak yaralanmaları ve osteoartrit tedavisi için umut verici adaylar olarak önerilmiştir. Klinik uygulama için eksozomlar büyük ölçekli üretim gerektirir. Bu amaçla, insan sinovyal sıvı MSC'leri (hSF-MSC'ler) mikro taşıyıcı boncuklar üzerinde yetiştirildi ve daha sonra dinamik üç boyutlu (3D) bir kültür sisteminde kültürlendi. 3D dinamik kültürü kullanarak, bu protokol SF-MSC kültür süpernatantlarından büyük ölçekli eksozomları başarıyla elde etti. Eksozomlar ultrasantrifüjleme ile toplandı ve bir iletim elektron mikroskobu, nanopartikül iletim testi ve batı lekelenmesi ile doğrulandı. Ayrıca, eksozomların mikrobiyolojik güvenliği tespit edildi. Eksozom tespitinin sonuçları, bu yaklaşımın çok sayıda iyi üretim uygulamaları (GMP) sınıfı eksozom üretebileceğini düşündürmektedir. Bu eksozomlar ekzozom biyolojisi araştırmalarında ve klinik osteoartrit tedavisinde kullanılabilir.

SF-MSC'lerin yüzey belirteçlerini tanımlamak için akım sitometrisi, Uluslararası Hücresel Terapi Derneği14,15</st...

Burada, bir 3D biyoreaktör kullanarak sinovyal sıvı mezenkimal kök hücrelerden çok sayıda GMP sınıfı eksozom üretmek için bir protokol sunuyoruz.

Sinovyal Sıvı Mezenkimal Kök Hücre Kaynaklı Eksozomların 3D Biyoreaktör Kültürü ile Büyük Ölçekli Hazırlanması

Exosomes secreted by mesenchymal stem cells (MSCs) have been suggested as promising candidates for cartilage injuries and osteoarthritis treatment. ...

3D biyoreaktörümüzü kullanarak sinovyal sıvı mezenkimal kök hücrelerden çok sayıda GMP sınıfı eksozom üretmek için bir protokol sunuyoruz. Bu eksozomlar ekzozom biyolojisi araştırmalarında ve klinik artrit tedavisinde kullanılabilir. Prosedürü gösteren Dr. Yujie Liang olacak.İnsan mezenkimal hücrelerini veya MSC'leri, sinovyal sıvıyı dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 1.500 kez G'de santrifüj ederek toplamaya başlayın. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı atın ve hücre peletini 10 mililitre PBS ile yeniden askıya alın. Yeniden askıya alınan hücreleri dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 1.500 kez G'de santrifüj yapın ve peleti 10 mililitre insan MSC kültür ortamı ile beş kez 10 hücre yoğunluğunda mililitre başına dördüncü hücrelere yeniden askıya almadan önce PBS'yi atın ve ardından süspansiyonu 100 milimetrelik bir kapta tabaklayın.Yemeği% 5 karbondioksit içeren bir atmosferde 37 santigrat derecede inkübe edin. İki hafta sonra, akış sitometrisini kullanarak sinovyal sıvı mezenkimal kök hücrelerini veya SF-MSC'leri tanımlamak için hücre kültürü süpernatantını toplayın. Bunu yapmak için, SF-MSC'lerin üçüncü nesil geçişini, dört santigrat derecede beş dakika boyunca 1.000

large-scale-preparation-synovial-fluid-mesenchymal-stem-cell-derived

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Sinovyal sıvıda yüksek düzeyde insan eklem kondrosit kültür 3D sistemi açıklanmıştır. Sinovyal sıvı eklem kıkırdağı için en doğal mikroçevresinin yansıtır ve kolayca elde ve saklanabilir. Bu sistem, böylece kıkırdak rejenerasyon eğitim ve artrit tedavisi için tarama terapötikler için kullanılabilir.

Sinovya Sıvısı Kültürleme İnsan Eklem kondrosit 3D Sistemi

Minipiglerin sinovyal sıvısı ve kemik iliğinden izole edilen ve şırınga aspirasyonu kullanılarak noninvaziv olarak toplanan mezenkimal kök hücreleri (MSC'ler) kuran bir protokol sunulmuştur. Hücresel fenotipleme, hücre izolasyonu ve MSC'lerden türetilen kemik iliği ve sinovyal sıvıların in vitro kültivasyonu sonrası akış sitometrisi kullanılarak gerçekleştirildi.

Mini-domuzlarda sinovyal sıvı ve Kemik İliği Elde Edilen Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu ve Hücresel Fenotiplendirme

Mezenkimal kök/stromal hücrelerin (MSC'ler) terapötik potansiyeli iyi belgelenmiştir, ancak hücreleri hastalar için hazırlamanın en iyi yöntemi tartışmalıdır. Burada, deneysel ve klinik uygulamalar için kseno içermeyen koşullar altında hazırlanmış MSC'lerin terapötik küresel agregalarını veya 'sferoidlerini' verimli bir şekilde oluşturmak ve yönetmek için protokoller iletiyoruz.

Xeno-ücretsiz Koşullarda 3-D Kültürler Üretim ve Tedavi Mezenkimal Kök Yönetim / Stromal Cell (MSC) küremsi Astarlı

Kök hücrelerden kondrogenezis kültür koşulları ince ayar gerektirir. Burada, hücreleri yoğunlaştırmak için bir manyetik yaklaşım sunmak, önemli bir adım kondorjenez başlatmak için. Buna ek olarak, bir biyo-reaktör içinde dinamik olgunlaşma hücresel yapıların mekanik uyarma uygulanır ve kıkırdak hücre dışı matris üretimini artırdığını göstermektedir.

Kıkırdak Yenileme için 3D Manyetik Kök Hücre Toplama ve Biyoreaktör Olgunlaşma

Bu yazı basit yalıtım ve Yeni Zelanda beyaz tavşan synovial sıvı mezenkimal kök hücre arınma için basit ve ekonomik Protokolü sunar.

Manyetik aktif hücre stratejileri yalıtmak ve Sinovyal sıvı elde edilen mezenkimal kök hücre bir tavşan modelinden arındırmak için sıralama

Bir eksozom ilaç teslim taşıyıcıları yeni nesil olduğunu. Bir eksozom yalıtım protokolü ile yüksek verim ve saflık siRNA teslimat için kurduk. Biz de fluorescently etiketli non-spesifik siRNA exosomes kapsüllenir ve siRNA yüklü exosomes kanser hücreleri hücresel alımını araştırıldı.

SiRNA kanser hücrelerinin teslim için Exosomes hazırlanması

Bu protokol, insan yağ kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin (ADSC'ler) kültürlenmesinden ve süpernatantın toplanmasından ultrasantrifüjleme kullanılarak hücre dışı veziküllerin (EV'ler) çıkarılmasına kadar tüm prosedürleri açıklar.

İnsan Adipoz Kaynaklı Mezenkimal Kök Hücrelerden Hücre Dışı Veziküllerin Saflaştırılması ve Karakterizasyonu

Bu çalışma, kronik yara iyileşmesi için çekirdek kılıflı 3D-biyo-baskılı iskelelerin imalatı için bir protokol sunmaktadır. Hücre dışı veziküller mezenkimal kök hücrelerden izole edilir ve karboksimetil selüloz ve aljinat liyazdan yapılan kılıf ile çekirdeğe (aljinat) yüklenir. Bu tasarım, kontrollü iskele bozulmasına ve verimli EV'lerin serbest bırakılmasına izin verir.

Kronik yara yönetimi için çekirdek kılıflı 3D biyobaskılı iskele kullanarak hücre dışı vezikül dağıtımını optimize etme

MSC ve diğer hücre tiplerinden ekstrahücre vezikül üretimi için 3D perfüzyon içi boş fiber biyoreaktörün kurulumu ve kullanımı için talimatlar verilmektedir. Bu protokol, içi boş lifli biyoreaktörlerde hücre yoğunluğunu kontrol ederken, yüksek konsantrasyonlarda sürekli olarak hücre dışı veziküller üretmeyi tanımlar.

İçi Lif Perfüzyon Biyoreaktörlerinde Yüksek Yoğunluklu 3D Hücre Kültürlerinden Büyük Ölçekli Ekstraselüler Vezikül Üretimi

Metagenomic Kütüphaneler Büyük Ölçekli Ekranlar

Keşfedin sinovyal sıvı mezenkimal kök hücrelerden GMP kaliteli eksozom üretimini 3D biyoreaktör kullanarak. Bu yöntem eksozom biyolojisi araştırmaları ve artrit tedavisi için klinik uygulamalarda araştırmacılara yüksek verimli bir protokol sunar.

Sinovyal Sıvı Mezenkimal Kök Hücre Kaynaklı Eksozomların 3D Biyoreaktör Kültürü ile Büyük Ölçekli Hazırlanması

Daha fazla video keşfet