Name: In vivo Fare Kalitesiz Zeytinde Kalsiyum Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Keşfedin fare beyni sapının ventral erişimle cerrahi açılması ve GRIN lenslerle inferior olive nöronlarında kalsiyum görüntüleme yöntemini. Bu teknik motor koordinasyon çalışmaları için canlı nöron aktivitesini kaydetmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Video kaydı ve düzenleme konusundaki yardımları için OIST'in medya merkezinden Andrew Scott'a teşekkür ederiz. Ayrıca, Hugo Hoedemaker'a beyin sapının ortaya çıkarılması için ameliyatın geliştirilmesine ve Dr. Kevin Dorgans'a figürler için diyagramlar çizme konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. Buna ek olarak, salvatore Lacava'ya sesli anlatımı için ve covid-19'un zor zamanlarında refah için sürekli destek için tüm nRIM üyelerine ve evcil hayvanlarına çok teşekkür eder.

<ol><li>Russell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+signals+in+vivo%3A+A+powerful+tool+in+physiology+and+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium signals in vivo: A powerful tool in physiology and pharmacology.</a> British Journal of Pharmacology. , (2011).</li>
<li>Zhang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kilohertz+two-photon+brain+imaging+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Kilohertz two-photon brain imaging in awake mice.</a> Nature Methods. , (2019).</li>
<li>Lin, X., Zhao, T., Xiong, W., Wen, S., Jin, X., Xu, X. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+the+primary+somatosensory+cortex+using+Thy1-GCaMP6s+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in the primary somatosensory cortex using Thy1-GCaMP6s transgenic mice.</a> Journal of Visualized Experiments. 2019 (143), 1-8 (2019).</li>
<li>Lee, H. S., Han, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+In+vivo+Calcium+Imaging+with+a+Head-Mount+Miniaturized+Microscope+in+the+Amygdala+of+Freely+Behaving+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Behaving Mouse.</a> Journal of visualized experiments. (162), 1-19 (2020).</li>
<li>Aharoni, D., Khakh, B. S., Silva, A. J., Golshani, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+the+light+that+we+can+see%3A+a+new+era+in+miniaturized+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">All the light that we can see: a new era in miniaturized microscopy.</a> Nature Methods. 16 (1), 11-13 (2019).</li>
<li>Khosrovani, S., Van Der Giessen, R. S., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+mouse+inferior+olive+neurons+exhibit+heterogeneous+subthreshold+oscillations+and+spiking+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vivo mouse inferior olive neurons exhibit heterogeneous subthreshold oscillations and spiking patterns.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (40), 15911-15916 (2007).</li>
<li>Osten, P., Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2007).</li>
<li>Berg, L., Gerdey, J., Masseck, O. A. Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity to Modulate Behavior in Freely Moving Mice. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBerg%2C+L+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22">Journal of visualized experiments : JoVE</a>. , e61023(2020).</li>
<li>Green, C. J., Knight, J., Precious, S., Simpkin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ketamine+alone+and+combined+with+diazepam+or+xylazine+in+laboratory+animals%3A+A+10+year+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Ketamine alone and combined with diazepam or xylazine in laboratory animals: A 10 year experience.</a> Laboratory Animals. 15 (2), 163-170 (1981).</li>
<li>Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vital+signs+monitoring+during+injectable+andn+inhalant+anesthesia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Animals%22%5BJournal%5D)">Vital signs monitoring during injectable andn inhalant anesthesia in mice.</a> Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).</li>
<li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 6 (2), 174-178 (2011).</li>
<li>Vrieler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+and+directionality+of+inferior+olive+neuron+dendrites+revealed+by+detailed+3D+characterization+of+an+extensive+morphological+library%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">Variability and directionality of inferior olive neuron dendrites revealed by detailed 3D characterization of an extensive morphological library.</a> Brain Structure and Function. 0 (0), 1677-1695 (2019).</li>
<li>Esposito, M. S., Capelli, P., Arber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brainstem+nucleus+MdV+mediates+skilled+forelimb+motor+tasks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Brainstem nucleus MdV mediates skilled forelimb motor tasks.</a> Nature. , (2014).</li>
<li>Martin, E. M., Devidze, N., Shelley, D. N., Westberg, L., Fontaine, C., Pfaff, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+neuroanatomical+characterization+of+single+neurons+in+the+mouse+medullary+gigantocellular+reticular+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Molecular and neuroanatomical characterization of single neurons in the mouse medullary gigantocellular reticular nucleus.</a> Journal of Comparative Neurology. , (2011).</li>
<li>Cold Spring Harbor. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ketamine%2FXylazine%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Ketamine/Xylazine.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> eLife. 8, 1-45 (2019).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIN1PIPE%3A+A+Miniscope+1-Photon-Based+Calcium+Imaging+Signal+Extraction+Pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">MIN1PIPE: A Miniscope 1-Photon-Based Calcium Imaging Signal Extraction Pipeline.</a> Cell Reports. 23 (12), 3673-3684 (2018).</li>
<li>Sciences S.U. GitHub - PeyracheLab/miniscoPy: A package to analyse calcium imaging data recorded with the Miniscope. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/PeyracheLab/miniscoPy">https://github.com/PeyracheLab/miniscoPy</a> (2020).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. , (1998).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+accurate+extraction+of+in+vivo+calcium+signals+from+microendoscopic+video+data%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data.</a> eLife. 7, 1-37 (2018).</li>
<li>Zhou, P., et al. GitHub - zhoupc/CNMF_E: Constrained Nonnegative Matrix Factorization for microEndoscopic data. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/zhoupc/CNMF_E">https://github.com/zhoupc/CNMF_E</a> (2020).</li>
<li>De Gruijl, J. R., Bosman, L. W. J., De Zeeuw, C. I., De Jeu, M. T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferior+olive%3A+All+ins+and+outs%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+the+Cerebellum+and+Cerebellar+Disorders%22%5BJournal%5D)">Inferior olive: All ins and outs.</a> Handbook of the Cerebellum and Cerebellar Disorders. , (2013).</li>
<li>Dorgans, K., Kuhn, B., Uusisaari, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Subthreshold+Voltage+Oscillation+With+Cellular+Resolution+in+the+Inferior+Olive+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Imaging Subthreshold Voltage Oscillation With Cellular Resolution in the Inferior Olive in vitro.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. , (2020).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Cerrahi işlem boğaz bölgesinde çok sayıda hayati kritik yapıya (arterler, sinirler) yapılan operasyonları içerdiği için, üst düzey cerrahi becerilere sahip bir araştırmacı tarafından yürütülmesi esastır. Aşağıda, prosedürün birkaç önemli noktasını vurgular ve yorumlarız; ancak, hiçbir yazılı tavsiyenin araştırmacının deneyimini, becerisini ve sezgisini destekleyemeyeceği hatırlatılmalıdır.
Ameliyatın en kritik adımı trakeotomidir. Trakeanın kesilmesini, izofluranın burun konisinden entübasyon tüpüne geçmesini, trakeanın göğüs derisine sabitlenmesini ve trakea ile entübasyon tüpünün birbirine sabitlenmesini içerir. Anestezinin yetersizliği, nefes borusuna sıvı girişi veya entübasyon tüpü kayması gibi kazaları önlemek için tüm bu operasyonların sorunsuz ve hızlı bir şekilde tamamlanması gerekmektedir. Nefes borusu kesilmeden önce protokolün açık tutulması gerekir.
Kanama bu ameliyatta hayvan ölümlerinin en önemli nedenlerinden biridir. Boyun bölgesi kan damarları ile yoğun olduğundan, kesim sadece görünmeyen damarların ve arterlerin kesilmesini önlemek için görüş çizgisi açık olduğunda yapılmalıdır. Bu nedenle, görmeyi engelleyen kaslar ve bağ dokuları çıkarılmalı ve ilerlemeden önce kırık kılcal damarlardan gelen kan temizlenmelidir.
Hayvan, ameliyatın başlangıcından itibaren uzun süre (8 saatten fazla) canlı tutulabilir. Bununla birlikte, cerrahi prosedürü hızlı bir şekilde bitirmek önemlidir, böylece hayvan fizyolojik durumu iyi olduğunda beyin sapı nöronlarını incelemek için daha fazla zaman vardır. Yetenekli bir araştırmacı tüm prosedürü 70 dakikada tamamlayabilir.
Yöntem ventral beyin yüzeylerinin temiz bir görünümünü sağlarken, boğaz bölgesindeki önemli miktarda dokuyu çıkarmanın yanı sıra trakeotomi yapmadan bunu yapmak ne yazık ki mümkün değildir. Bu nedenle, hayvanın anesteziden uyanmasına izin verilemez. Ayrıca, anestezik doğumun dikkatli bir şekilde ayarlanması, vücut sıcaklığının ve hidrasyonun korunması ile hayvanı saatlerce canlı tutmak mümkün olsa da, uzun süreli deneylerin sonunda hayvan durumunun zayıflamasına yol açması kaçınılmazdır. Kararlı kayıtların maksimum süresini göz önünde bulundurmak araştırmacının uzmanlığına bırakılmıştır.
Burada açıklandığı gibi yöntemin bir başka potansiyel sınırlaması, GRIN lens beyin parenkimine yerleştirilmediği için, sadece nispeten yüzeysel nöronların (~150-200 μm) incelenebilmesidir. GRIN lensin cerrahi implantasyonu teknik olarak mümkün olsa da, akut cerrahi yöntem nöronların oksidatif stresten kurtulması için yeterli zaman sağlamaz ve implantasyondan sonra kan varlığı muhtemelen görüntü kalitesini kabul edilebilirin ötesinde düşürecektir.
Yukarıdaki endişelere rağmen, io nöronlarının in vivo görüntülemesi için ilk kez bir yöntem sunulduğuna inanıyoruz. Duyusal sistemlerden sağlam afferent girişlerin yanı sıra serebellar çekirdeklerden ve mezodiensefalik kavşak22'den gelen sinyallerin varlığında in vivo bağlamında IO nöronlarındaki mekansal aktivitenin incelenmesine izin verir . Bu yöntemle, GÇ'nin işlevi artık duyusal ve optogenetik stimülasyon kombinasyonu ile daha derinlemesine araştırılabilir. Özellikle, voltaj görüntülemenin evrimi ile (IO 23'tekivoltaj görüntüleme için son yöntemimiz gibi), sunulan cerrahi yöntemin, IO'nun serebellar kompleks ani artışların üretimine nasıl katkıda bulunduğunu araştırma zorluğunu üstlenmeleri için çok sayıda araştırmacıya ilham vereceğini umuyoruz.

Sistemlerin nörobiliminin temel amacı, nöronal ağların mekansal aktivite kalıplarının hayvan davranışlarının üretimine nasıl katkıda bulunduğunu anlamaktır. Bu nedenle, kalsiyuma duyarlı probları kullanan floresan görüntüleme metodolojisi, son on yılda canlı hayvanlarda nöronal ağ aktivitesini incelemek için ana bir araç haline gelmiştir1,2, çünkü bu tür dinamiklerin tek hücrelerden mezoscale devrelere kadar uzaysal ölçeklerde görselleştirilmesine izin verir. Son yıllarda yüzeysel beyin yapılarındaki (serebral veya serebellar kortikaller gibi) sinir devrelerinin şeffaf bir kranial pencere 3 ile görüntülendiği ortakyaklaşım, derin beyin yapılarındaki ağ dinamiklerinin incelenmesini sağlayan gradyan-kırılma indeksi (GRIN) lens4 kullanımı ile tamamlanmıştır. Şu anda mevcut olan GRIN lensler, fare amigdala, hipokampus ve bazal gangliyon5gibi birkaç milimetre derinliğindeki yapılara ulaşmaya izin verir. Bununla birlikte, ventral medulladaki çeşitli çekirdekler gibi birçok ilgi alanı önemli ölçüde daha derine uzanır ve onları GRIN lensin ulaşabileceği en uç noktaya yerleştirir.
Burada, beynin ventral yönüyle medullanın nispeten kolay erişilebilirliğinden yararlanarak bu zorluğun nasıl üstesinden gelindiğini anlatıyoruz. Ventral medulladaki bir çekirdek olan alt zeytinin (IO) bir kalsiyum sensörü GCaMP6s ile viral olarak trans enfekte olduğu yetişkin fareleri kullanarak, anestezi edilmiş bir farenin beyninin ventral yüzeyine bir GRIN lens yerleştirmek için cerrahi adımları (başlangıçta Khosrovani ve ark. 20076'daaçıklanan yöntemden değiştirilmiştir) açıklıyoruz. Minyatür bir mikroskop kullanarak, bu tür son derece ventral beyin bölgelerinde nöronal aktivite kaydetmenin fizibilitesini gösteriyoruz. İşlem mutlaka sağkalımsız bir ameliyat olsa da ve uyanık hayvanlarda deney yapılamasa da, yöntem duyusal veya diğer afferent yol stimülasyonu bağlamında sağlam ağ dinamiklerinin incelenmesine izin vererek akut dilim preparatları kullanmak gibi ex vivo yaklaşımlara göre net avantajlar sağlar.

<table><tbody><tr><td>AAV. ÇAĞ. GCaMP6s.WPRE.SV40</td><td>Addgene, ABD</td><td>100844-AAV9</td><td></td></tr><tr><td>6 mm yarım daire iğne ile emilebilir sütür</td><td>Natume, Japonya</td><td>L6-60N2</td><td>iplikli kanca iğnesi</td></tr><tr><td>Absorpsiyon üçgenleri</td><td>FST, Almanya</td><td>18105-03</td><td>Cerrahi süngerler</td></tr><tr><td>Stereo mikroskoplar</td><td>Leica, Almanya</td><td>M50</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo kilitli kavisli uçlu iğne tutucu</td><td>FST, Almanya</td><td>12061-01</td><td>Cerrahi alet</td></tr><tr><td>pamuklu çubuklar</td><td>Sanyo, Japonya</td><td>HUBY-340</td><td></td></tr><tr><td>Hassas sütür bağlama forseps</td><td>FST, Almanya</td><td>11063-07</td><td>Cerrahi alet</td></tr><tr><td>Hassas Sütür Bağlama Forseps</td><td>FST, Almanya</td><td>11063-07</td><td>Cerrahi alet</td></tr><tr><td>Dumont #5/45 forseps</td><td>FST, Almanya</td><td>11251-35</td><td>Cerrahi alet</td></tr><tr><td>İnce İris makas</td><td>FST, Almanya</td><td>14060-09</td><td>Cerrahi alet</td></tr><tr><td>Friedman-Pearson rongeur kavisli uç</td><td>FST, Almanya</td><td>16221-14</td><td>Cerrahi alet</td></tr><tr><td>Jelköpük emilebilir jelatin sünger</td><td>Pfizer, ABD</td><td>0315-08</td><td>Hemostatik jelatin sünger</td></tr><tr><td>Cam-Kılcal Nanoenjeksiyon</td><td>Neurostar, Almanya</td><td>n/a</td><td>Virüs vektör enjeksiyonu için</td></tr><tr><td>Tırtıklı uçlu Graefe Forseps</td><td>FST, Almanya</td><td>11052-10</td><td>Cerrahi alet</td></tr><tr><td>İmplantasyon çubuğu</td><td>Inscopix, ABD</td><td>n/a</td><td>nVoke2 sisteminin bir parçasıdır. nVoke2 minyatür mikroscpe için tasarlanmıştır ve üzerine GRIN lens monte edilebilir</td></tr><tr><td>IsoFlo</td><td>Zoetis, İngiltere</td><td>n/a</td><td>Isofluran</td></tr><tr><td>İNTRAMÜSKÜLER ENJEKSİYON İÇİN KETALAR</td><td>Daiichi Sankyo, Japonya</td><td>n/a</td><td>Ketamin</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark, ABD</td><td></td><td>Temizleme dokusu</td></tr><tr><td>Lazer Bazlı Mikropipet Çektirme</td><td>Sutter Aleti, ABD</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipet Beveler</td><td>Sutter Aleti, ABD</td><td>BV-10</td><td></td></tr><tr><td>Kopf tabanlı Motorlu Stereotaksik, Model 900</td><td>Neurostar, Almanya</td><td>n/a</td><td>Stereotaksik</td></tr><tr><td>çerçeveli mouseOxPlus, rektal sıcaklık sensörü ve uyluk kelepçesi nabız oksimetresi</td><td>Starr Life Sciences, PA, ABD</td><td>MouseOxPlus Hayvan</td><td>kalp atış hızını, arteriyel oksijen doygunluğunu (SpO2), nefes hızını ve sıcaklığı ölçer</td></tr><tr><td>nVoke2 entegre Kalsiyum görüntüleme mikro kamera sistemi</td><td>Inscopix, ABD</td><td>1000-003026</td><td>Minyatür mikroskop</td></tr><tr><td>Ohaus Kompakt Teraziler</td><td>Ohaus, ABD</td><td>CS 200</td> Hayvan Otsuka Normal <td>Salin'i ağırlıklandırmak için kullanılan ölçek</td></tr><tr><td></td><td>Otsuka İlaç Fabrikası, Japonya</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Fizyolojik-biyolojik sıcaklık kontrol sistemi</td><td>SuperTech Instruments, Macaristan</td><td>TMP-5b</td><td>Fare</td></tr><tr><td>ProView Lens Probu 1,0 mm çap, 9,0 mm uzunluk</td> için termal ped <td>Inscopix, ABD</td><td>1050-002214</td><td>Gradyan kırılma indisi (GRIN) lensi</td></tr><tr><td>Q114-53-10NP cam kılcal damarlar</td><td>Sutter Instrument, ABD</td><td>112017</td><td>Özelleştirilmiş ve nbsp; kuvars cam kılcal damarlar</td></tr><tr><td>Güvenlik IV Kateter 20G</td><td>B. Braun, Almanya</td><td>4251652-03</td><td>Entübasyon tüpünü hazırlamak için kullanılan 20 gauage kateter</td></tr><tr><td>Zımpara kağıdı</td><td>ESCO, Japonya</td><td>EA366MC</td><td>Kavisli ve künt iğne hazırlamak için 25G iğnenin ucunu parlatmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Neşter bıçağı</td><td>Muromachi Kikai, Japonya</td><td>10010-00</td><td>Kuvars cam pipetin ucunu kesmek için kullanılır</td></tr><tr><td>SomnoSuite düşük akışlı inhalasyon anestezi sistemi</td><td>Kent Scientific, ABD</td><td>SOMNO</td><td>İzofluran akışının hassas kontrolünü sağlar</td></tr><tr><td>Cerrahi XT Plus matkap</td><td>NSK</td><td>Y1002774</td><td>Virüs vektör enjeksiyonu için</td></tr><tr><td>Şırınga 1 ml</td><td>Terumo, Japonya</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga iğnesi 25G</td><td>Top, Japonya</td><td>00819</td><td>Künt ve bükülmüş iğne yapmak için kullanılır</td></tr><tr><td>Şırınga iğnesi 26G</td><td>Terumo, Japonya</td><td>NN-2613S</td><td></td></tr><tr><td>Thrive 2100 Profesyonel Düzeltici</td><td>Thrive, Japonya</td><td>n/a</td><td>Tıraş Makinesi</td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml; bingen yaylı makas</td><td>FST, Almanya</td><td>15004-08</td><td>Cerrahi alet</td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Hayashi Saf Kimyasal, Japonya</td><td>22000255</td><td></td></tr><tr><td>Veet hassas</td><td>ciltler Veet, Kanada</td><td>yok</td><td>Epilasyon kremi</td></tr><tr><td>Ksilokain Jöle %2 30ml</td><td>Aspen Japonya,&nbsp; Japonya</td><td>871214</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo fare kalitesiz zeytinde kalsiyum görüntüleme

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Ventral medulladaki bir çekirdek olan inferior zeytin (IO), beyinciklere giren iki giriş yolundan birini oluşturan tek tırmanma lifi kaynağıdır. IO'nun uzun zamandır motor kontrolü için çok önemli olduğu önerilmiştir ve aktivitesinin şu anda beyinciklerin hem motor hem de bilişsel işlevlerinin birçok hipotezinin merkezinde olduğu düşünülmektedir. Fizyolojisi ve işlevi nispeten iyi çalışılmış olsa da tek hücreli in vitro, şu anda canlı hayvanlarda GÇ ağı aktivitesinin organizasyonu hakkında hiçbir rapor yoktur. Bu, büyük ölçüde GÇ'nin son derece zorlu anatomik konumundan kaynaklanmaktadır ve tüm beyin boyunca ilgi çekici bölgeye dorsally olarak yerleştirilmiş bir optik yol oluşturulması gereken geleneksel floresan görüntüleme yöntemlerine tabi olmayı zorlaştırır.
Burada, GÇ ağından son teknoloji ürünü kalsiyum görüntüleme verileri elde etmek için alternatif bir yöntem açıklıyoruz. Yöntem, GÇ'nin aşırı ventral konumundan yararlanır ve uyuşturulmuş farelerde kalsiyum sensörü GCaMP6s eksprese eden GÇ'nin ventral yüzeyine temas etmek için boyun iç organlarından gradyan-kırılma indeksi (GRIN) lens takmak için cerrahi bir prosedür içerir. Temsili bir kalsiyum görüntüleme kaydının, ameliyattan sonra GÇ nöron aktivitesini kaydetme fizibilitesini gösterdiği gösterilmiştir. Bu sağkalımsız bir ameliyat olsa da ve kayıtların anestezi altında yapılması gerekirken, yaşam açısından kritik beyin sapı çekirdeklerinin zarar görmesini önler ve IO'daki mekansal aktivite kalıplarını ve giriş entegrasyonunu araştıran çok çeşitli deneylerin yapılmasına izin verir. Değişikliklerle yapılan bu prosedür, ventral beyin sapının diğer bitişik bölgelerindeki kayıtlar için kullanılabilir.

Burada, açıklandığı gibi yöntemle elde edilen temsili bir kayıt sunuyoruz. Şekil 6a, deneme sırasında görselleştirilen parlak etiketli GÇ hücrelerinin konumunu gösterir. Koyu diyagonal çizgiler kan damarlarıdır. Değişken transeksiyon etkinliğinden kaynaklanan tek tek hücrelerin değişken parlaklığına dikkat edin. PanelDe Şekil 6b panel a'da renk ve sayılarla belirtilen somatadan elde edilen ortalama normalleştirilmiş floresan yoğunluğu (deltaF/F) izlerini gösteriyoruz. Yukarı doğru sapmalar hücre içi kalsiyumda geçici artışları temsil eder. Farklı GCaMP6s ifade düzeyinin (panel a'daki hücre parlaklığına yansıyan) değişken sinyal-gürültü oranlarına (SNR) nasıl yol açtığını unutmayın.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62222/62222fig06.jpg"> Şekil 6: Uyuşturuldu farede GÇ nöronlarının aktivitesinin örnek kaydı. (a) Uzamsal filtrelemeden sonra bir kayıttan temsili örnek çerçeve. Parlak noktalar, bazıları ilgi alanları (ROI'ler, renkli sayılar) olarak belirtilen IO nöronal somata'dır. Koyu çizgiler kan damarlarıdır. (b)Panel a'da belirtilen ROI'lerden elde edilen deltaF/F izleri örneği. Yukarı sapmalar kalsiyum sinyaldeki artışları yansıtır. A=10 μm'de ölçekleme <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62222/62222fig06large.jpg" target="_blank">çubuğu.</a>

Yetişkin farenin beyin ata tarafından beyin atmasını ortaya çıkarmak için bir protokol sunuyoruz. Minyatür mikroskoplu gradyan-kırılma indeksi lens kullanılarak, in vivo zeytin nöral somata aktivitesini incelemek için kalsiyum görüntüleme kullanılabilir.

In vivo Fare Kalitesiz Zeytinde Kalsiyum Görüntüleme

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Alt zeytin medullanın en ventral kısmıdır ve bu nedenle canlı bir hayvanda ulaşmak son derece zordur. Burada, yetişkin fare beyninin ventral taraftan sapını ortaya çıkarmak için bir protokol sunuyoruz ve kalsiyum sensörlerini ifade eden alt zeytin nöronlarındaki nöronal aktiviteyi kaydetmek için GRIN lensleri kullanıyoruz. Bu yöntem, yaşam açısından kritik beyin sapının zarar görmesini önler ve uzamsal-zamansal aktivite kalıpları ve alt zeytinde girdi entegrasyonu üzerine incelemeler sağlar.Operasyon birçok hayati yapıya sahip kompleks boğaz bölgesinde yapıldığı için üst düzey cerrahi becerilere sahip bir araştırmacı tarafından yapılması esastır. 20 kalibrelik kateterin ucundan 5 ila 6 milimetre uzunluğunda ve 0,8 milimetre genişliğinde bir yarık keserek bir entübasyon tüpü hazırlayın. Ucunu keserek kör ve kavisli bir iğne hazırlayın, kırılma yüzeyini zımparalayın ve plier ile bükün.Bu trakeotomi sırasında bir trakeayı desteklemek için kullanılacaktır. Mililitre ketamin başına 15 miligramı salin ile seyreltin% 15 Ameliyat aletlerini ve sarf malzemelerini birleştirin. Isıtma yastığını 38 santigrat dereceye ayarlayın.Burun katını stereotaksik çerçevede yatay olarak 180 derece çevirin. Daha önce virüs taşıyan GCaMP6s tarafından trans enfekte olan fareyi tartın ve enjeksiyon için seyreltilmiş ketamin miktarını hesaplayın. İndüksiyon kutusunu % 5 izofluran ile önceden doldurun ve fareyi uyuşturun.Fareyi stereotaksik çerçeveye, ventral taraf yukarıya monte edin. Fare boğazını ve uyluk bölgesini tıraş edin. Artık saçları epilasyon kremi ile çıkarın.Boğaz derisine topik olarak ksylocaine jöle uygulayın. Fare sıcaklığını rektal termal sensörle izleyin. Önceden ısıtılmış bir mililitre salin intraperitoneally enjekte edin.Anestezinin derinliğini arka ayak parmaklarında güçlü bir tutamla değerlendirin. Algılanabilir yanıt çağrılmamalıdır. Orta hat boyunca boğaz derisinde dikey bir kesi yapın.Künt diseksiyon yöntemi ile boyun derisini altındaki visseradan ayırın ve cildi kesin. Tükürük bezlerini bağ dokusundan serbest bırak ve sternotiroid kas kaplı trakeayı ortaya çıkarmak için yanal olarak çevirin. Intraperitoneally hayvan ağırlığı kilogram başına beş mililitre seyreltilmiş ketamin ilk doz enjekte.Sternotiroid kası orta hat boyunca ince bir önps ucuyla dikkatlice bölerek nefes borusuna maruz kalabilirsiniz. Trakeayı kan damarlarından ve yemek borusundan künt diseksiyon yöntemi kullanarakps ile ayırın. Kilogram hayvan ağırlığı başına 2,5 mililitrede ikinci doz seyreltilmiş ketamin enjekte edin.Çapraz olarak nefes borusuna künt bir iğne yerleştirin. Künt iğne ile nefes borusu kaldırın. Dikiş ipliğinin üçüncü trakea halkasının etrafından dolandırılmasını, tiroid bezini yarım daire iğne ile kaudal hale getirin.Bu halkaya dört alet bağı yap. Göğüs derisini aynı yarım daire iğnesi ile delin ve ipliği cilde yönlendirin. Nefes ucsunu iplikle hafifçe kaldırın ve trakea kaudalini tiroid bezine kesin.Nefes nefesini göğüs derisine doğru çekin. Altına küçük bir parça cerrahi sünger ekleyerek nefes borusunun açılmasını kaldırın. Nefes borusunun açma ucunun içinde kalan sıvıyı ince bir temizleme dokusu şeridi ile çıkarın.izofluran akışını stereotaksik burunkondan entübasyon tüpüne geçirin. Entübasyon tüpünü nefes borusuna yerleştirin. Nefes almaya izin vermek için tüpteki yarığın bir kısmının nefes borusunun dışında kaldığından emin olun.Üç ila dört alet bağı yaparak nefes borusunun fare göğsü derisine sabitlenerek sabitlenin. Entübasyon tüpünü sabitlemek için nefes borusunu dikiş ipliğine bağlayın. Sternotiroid kası ince önps ile kas lifleri boyunca kesin.İzole edilmiş kısmı yay makası ile kesin. Kastaki kan damarlarındaki hasarı en aza indirmek için kastan arta kalan trakea ve larenksi dikkatlice serbest bırakın. Kalan trakea ve larenksi çıkarın.Yemofagusun, ekli dokudanps ile serbest bırakın ve yay makası ile kesin. Beyin sapı ve atlasın ventral kemerini kaplayan boyuna kası çıkarın. Atlas ventral kemerini ve ön tüberkülünü kaplayan kası çıkarın.Atlasın ventral kemerlerini rongeur ile kesin. Atlasın ön tüberkülünü çıkarın. Foramen magnum ve beyin sapını görüntülemek için kanı ve sıvıyı çıkarın.Rongeur ile oksipital kemiği çıkararak foramen magnum'unu genişletin. Kıkırdağı çıkarın ve ventral beyin sapının net bir görünümüne sahip olmak için dura mater'in periosteal tabakasını ince tokmaklarla dikkatlice soyun. Kalp atış hızı, oksijen doygunluğu ve nefes hızı gibi hayati belirtileri izlemek için SpO2 sensörünü farenin uyluğuna sıkıştırın.GRIN lensi implantasyon çubuğuna takın. Lensi %70 etanol batırılmış temizleme dokusu ile dikkatlice temizleyin. İmplantasyon çubuğunu stereotaksik çerçeveye sabitlenin ve minyatür mikroskobu implantasyon çubuğuna monte edin.GRIN lensin daldırılması için beyin sapı alanına birkaç damla salin ekleyin. GRIN lensle beyin sapına yaklaşın. Yüzeysel alanda alt zeytin nöronlarını ifade eden GCaMP6'lar dikdörtgen şeklindeki bir bölgede, kalan atlasa yaklaşık 0,5 ila 1,7 milimetre rostral ve orta çizgiye yaklaşık 2,6 ila 1,1 milimetre yanal olarak bulunabilir.GCaMP6s transfected inferior zeytin nöronlarını bulmak için minyatür mikroskoptaki heyecan mavisi LED'i açın. Nöronlar, çeşitli GCaMP6s ekspresyon seviyesi nedeniyle farklı taban çizgisi floresan yoğunluğu gösterir. Soldaki videoda daire içine alınmış alt zeytin nöron somatasının kalsiyum seviyesinin değişmesi, bize delta F'nin sağdaki F izleriyle bölündüğünü gösterecektir.Fare sıcak ve nemli tutulsa da, uzun süreli anestezi ve ameliyatla kaçınılmaz olarak zayıflayacaktır. Farenin fiziksel durumunun kayıt için iyi olması için ameliyat süresini kısa tutmak önemlidir. Yetenekli bir araştırmacı ameliyatı 70 dakikada bitirebilir.Bu yöntem, değişikliklerle, ventral beyin sapının diğer bitişik bölgelerini incelemek için kullanılabilir.

in-vivo-calcium-imaging-in-mouse-inferior-olive

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Neokorteks mikrodevreler ağ dinamiklerini anlamak için, aynı anda çok sayıda nöron aktivitesini kaydetmek için esastır. In vivo iki foton kalsiyum görüntüleme, bir tek hücre çözünürlük ile yoğun bir nöronal nüfusun faaliyet kaydetmenize olanak sağlayan tek yöntem.

Katman In Vivo 2-Foton Kalsiyum Görüntüleme Fare 2 / 3

Kaynak: Shannonhouse, J.,  et al. İn Vivo Sağlam dorsal kök gangliyonlarındaki primer duyusal nöron ağlarındaki nöronal toplulukların kalsiyum görüntülemesi. J. Vis. Uzm. (2023). Video, transgenik bir farenin dorsal kök gangliyonlarındaki (DRG) nöronal aktiviteyi izlemek için in vivo bir kalsiyum görüntüleme tekniğini göstermektedir. DRG nöronları, kalsiyuma bağlandıktan sonra floresan yoğunluğunu artıran bir kalsiyum indikatörünü ifade eder. Bir arka pençeye uygulanan mekanik veya termal...

Bir farenin sağlam dorsal kök gangliyonlarındaki nöronal toplulukların in vivo kalsiyum görüntülemesi

Kaynak: Lee, H. et. al., Serbestçe Davranan Farenin Amigdalasında Başa Monte Minyatür Mikroskopla Başarılı İn vivo Kalsiyum Görüntüleme. J. Vis. Uzm. (2020)Bu video, gradyan kırılma indisi veya GRIN lens ve minyatür bir mikroskop kullanılarak bir farede in vivo kalsiyum görüntülemeyi göstermektedir. Kurulum, sürtünmesiz bir mobil kafes sistemi içinde kafa sabitlemesini birleştirir, nöronları uyarır ve kalsiyum iyonu akışını tetikler. GRIN lens, beyindeki kalsiyum sinyalini yakalayarak nöronal...

Serbestçe Hareket Eden Bir Farede Gerçek Zamanlı Mikroendoskopik Kalsiyum Görüntüleme

Bu protokol, beyin ensheathing perisitlerinden floresan kalsiyum görüntülerini ve uyuşturulmış farelerde yakındaki kan damarlarından kan akışı verilerini elde etmek ve analiz etmek için adımlar sunar. Bu teknikler duvar hücresi fizyolojisi çalışmaları için yararlıdır ve herhangi bir hücre tipinde kalsiyum geçicilerini araştırmak için uyarlanabilir.

Vivo Transgenik Farelerde Beyin Perisit Kalsiyumu ve Hemodinamik Görüntüleme

Mevcut protokol, gıda sargısı, şeffaf silikon ve kapak camı kullanarak büyük (6 x 3 mm2) bir kafatası penceresi yapmayı açıklamaktadır. Bu kafatası penceresi, aynı farede in vivo geniş alan ve iki fotonlu kalsiyum görüntüleme deneylerine izin verir.

İn Vivo Büyük Bir Kraniyal Pencere Kullanarak Bir Fareden Geniş Alan ve İki Foton Kalsiyum Görüntüleme

Bu protokol, dorsal kök ganglionunun (DRG) cerrahi maruziyetini ve ardından GCaMP3'ü (genetik olarak kodlanmış Ca2+ göstergesi; Yeşil Floresan Protein-Kalmodulin-M13 Protein 3) İpsilateral arka pençeye çeşitli uyaranlar uygularken Pirt-GCaMP3 fareleri kullanılarak nöronal toplulukların Ca2+ görüntülenmesi.

İn Vivo Bozulmamış Dorsal Kök Ganglialarında Primer Duyusal Nöronların Ağlarında Nöronal Toplulukların Kalsiyum Görüntülenmesi

Mevcut yöntemler, kolayca bulunabilen genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini kullanarak Caenorhabditis elegans'ta in vivo olarak yüksek çözünürlüklü, sub-kompartmanlı kalsiyum görüntüleme için orantılı olmayan bir yaklaşımı tanımlamaktadır.

Nöronal Kalsiyum Kullanımının In Vivo Subsellüler Görüntülemesi

Bu protokol, vahşi tip farelerde korteksi bozulmadan bırakırken iki foton mikroskobu ile tek nöron aktivitesinin görüntülenmesi ve kısmi korteks mutant farelerde geniş alan mikroskobu ile tüm SC'nin görüntülenmesi dahil olmak üzere, uyanık farelerin superior colliculus'unda (SC) kalsiyum yanıtlarını görüntüleme prosedürünü detaylandırır.

Fare Superior Colliculus'ta Kalsiyum Görüntüleme

Hipokampusun dentat girusu, öğrenme ve hafızada temel ve farklı işlevleri yerine getirir. Bu protokol, serbestçe hareket eden farelerde dentat girustaki granül hücrelerinin in vivo kalsiyum görüntülemesi için bir dizi sağlam ve verimli prosedürü tanımlar.

Farelerde Hipokampusun Dentat Girusundaki Granül Hücrelerin İn Vivo Kalsiyum Görüntülenmesi 

Bu protokol, sosyal durum manipülasyonu (sosyal izolasyon ve sosyal birleşme) sırasında serbest davranan farelerde minyatürize mikroskop (miniskop) kullanılarak hipotalamik nöronların in vivo kalsiyum görüntülemesini detaylandırır. Bu yöntem, sosyal ihtiyaç ve sosyal doygunluğu temsil eden hipotalamik aktivitenin tek nöron çözünürlükte görüntülenmesini sağlar ve sosyal homeostazın mekanik çalışmalarını mümkün kılar.

In Vivo'da Farelerde Sosyal Davranışları Anlamak İçin Hipotalamus'ta Minyatürize Mikroskopla Kalsiyum Görüntüleme

Keşfedin fare beyni sapının ventral erişimle cerrahi açılması ve GRIN lenslerle inferior olive nöronlarında kalsiyum görüntüleme yöntemini. Bu teknik motor koordinasyon çalışmaları için canlı nöron aktivitesini kaydetmeyi sağlar.

In vivo Fare Kalitesiz Zeytinde Kalsiyum Görüntüleme

Daha fazla video keşfet