Mikroakışkan Karıştırma Platformu Kullanarak Gen Teslimatı için Lipid Nanopartiküllerinin Formülei ve Karakterizasyonsu

Bu protokol, yüksek tekrarlanabilirlik ve hız ve düşük hacimli nükleik asit kapsüllenmiş lipid nanopartikülleri üretmek için kullanılabilir. Formülasyon parametreleri, klinik uygulamaya göre istenen biyo dağılımı elde etmek için ayarlanabilir. Mikroakışkan kartuşun standart balıksırtı tasarımı, karıştırma sırasında hızlı, hassas ve kontrollü bir laminar akış sağlar.

Yöntem ölçekleme için uygun ve düzgün, yüksek kapsüllenmiş parçacıklar üretir. Viral yöntemlere dayanan ticari olarak onaylanmış gen terapisi ürünlerinin çoğunda, bu prosedür gen iletimi hakkında fikir verebilir, çünkü viral olmayan yaklaşımı, tekrar dosingin gerekli olduğu uygulamalara izin verir. Aralıklı girdaplı bir cam şişeye her sıvı stok çözeltisinin uygun miktarını ekleyerek başlayın.

tabloda belirtildiği gibi, ardından 533 mikrolitrelik son hacme 200 prova etanol eklenmesi. Daha sonra uygun miktarda mRNA stoğu ekleyin ve istenen konsantrasyonda 1,5 mililitrelik son bir hacim elde etmek için sitrat tamponu ile seyreltin. Mikroakışkan kanalları astarlamak için, önce astar parametresini tabloda belirtildiği gibi enstrüman yazılımına girin.

Ardından, cihazın kapağını açın ve dönen bloğa bir mikroakışkan kartuş yerleştirin. Şırınga ucunda kabarcık veya hava boşluğu olmamasına dikkat ederek en az 500 mikrolitre etanol'ü 1 mililitrelik bir şırıngaya yükleyin ve şırıngayı kartuşun sağ girişine yerleştirin. Hava kabarcığı veya boşluk olmamasına dikkat ederek 1,5 mililitre sitrat tamponu ile beş mililitrelik bir şırınna yükleyin ve şırınnayı kartuşun sol girişine yerleştirin.

Atık konteyneri olarak hizmet vermek için klips tutuculara iki adet 15 mililitrelik konik tüp yerleştirin ve çözümleri karıştırmak için Git"i tıklayın. Cihaz, alt mavi ışığın kapanmasıyla belirtildiği gibi astarlamayı durdurduğunda, geç açın ve konik tüpleri ve şırıngları uygun şekilde atın. Lipid nanopartikül oluşumu için, tabloda belirtildiği gibi uygun formülasyon parametrelerini ayarlayın ve daha önce hazırlanmış bir lipit karışımı ile 1 mililitrelik bir şırınna yükleyin.

Şırınd ucundaki hava boşluklarını veya kabarcıkları çıkarın ve şırınnayı kartuşun sağ tarafına yerleştirin. Daha önce hazırlanmış nükleik asit çözeltisini 3 mililitrelik bir şırınna yükleyin, şırıngam ucunda kabarcık veya hava boşluğu olmamasına dikkat edin ve şırınnayı kartuşun sol girişine yerleştirin. Örnek adıyla etiketlenmiş 15 mililitre RNAase içermeyen konik bir tüpü sol tüp klipsine yerleştirin ve sağ tüp klipsine 15 mililitrelik bir atık konik yerleştirin.

Cihaz kapağını kapatın ve Go'yu tıklayın.Lipid ve mRNA çözeltileri mikroakışkan kartuştan akacak ve lipid nanopartikül çözeltisi konik tüplerde toplanacak. Formülasyon işleminin sonunda konik tüpü tutun, ardından lipid nanopartiküllerini 5 mililitre PBS ve biyolojik bir güvenlik kabini ile seyreltin. Tampon değişimi yapmak için, önce 100 kilodalton gözenek boyutunda ultracentrifuge filtresini 2 mililitre PBS, santrifüj ile önceden yıkayın ve ardından PBS'yi alt bölmeden boşaltın.

Seyreltilmiş lipid nanopartiküllerini üç santrifüj yıkama için önceden yıkanmış ultracentrifuge filtresinin üst bölmesine ekleyin, akıştan atın ve ilk iki yıkamadan sonra ultracentrifuge filtresine 5 mililitre PBS ekleyin. Son yıkamadan sonra, nanopartikül çözeltisini nükleaz içermeyen bir şişeye aktarmadan önce nanopartikül kaybını en aza indirmek için lipid nanopartikül çözeltisini ultracentrifuge filtresinin duvarlarına birkaç kez karşılayın. Ardından, nanopartikül süspansiyonu uygun deneysel konsantrasyona ve hacme getirmek için PBS ekleyin.

Lipid nanopartiküllerinin kapsülleme verimliliğini değerlendirmek için, önce pbs'de çalışan nükleik asit çözeltisinin iki kat seri seyreltmelerini hazırlaarak mililitre başına 500 nanogramdan başlayıp en az beş seyreltme yaparak standart bir eğri oluşturun. Daha sonra, standart eğrinin orta noktası etrafında yatan uygun bir teorik konsantrasyon elde etmek için PBS'deki nanopartikül örnek seyreltmelerini hazırlayın. Daha sonra uygun miktarda RNA reaktifi, Triton X100 ve PBS'yi karıştırarak lipid nanopartikül içinde ve dışında RNA varlığını tespit etmek için ribo yeşil RNA reaktifini hazırlayın.

Daha sonra, sıvı nanopartikül dışında RNA varlığını tespit etmek için, yalnızca uygun miktarda RNA reaktifini ve PBS'yi karıştırın. Nükleik asit standardının ve lipid nanopartikül çözeltilerinin siyah floresan özellikli 96 kuyu plakasına çoğaltılması, daha sonra standart ve numune kopyalarına Triton X100 ile ve triton X100 olmadan eşit miktarda RNA niceleme reaktifi ekleyin. Numunelerin kapsamlı bir şekilde karıştırılmasını sağlamak için plaka okuyucusunda plaka okuyucusunda beş dakika boyunca hafiften korunan plakayı sallayın, ardından 480 nanometrelik bir heyecan dalga boyunda ve 520 nanometre emisyon dalga boyunda bir mikro plaka okuyucusunda floresan ölçün.

Lipid nanopartiküllerinin hidrodinamik boyutunu ve poli dağılımını ölçmek için, önce nanopartikül çözeltisini PBS'de 40 kez seyreltin ve çözeltiyi yarı mikro bir cuvette ekleyin. Cuvette'i Zetasizer'a yükleyin ve nanopartikülleri malzeme, dağıtıcı, sıcaklık ve hücre tipine göre ölçecek cihazı ayarlamak için standart bir çalışma prosedürü seçin. Ardından lipid nanopartiküllerinin hidrodinamik boyutunu ve poli dağılımını ölçmek için Başlat"ı tıklayın.

Lipid nanopartiküllerinin Zeta potansiyelini ölçmek için, nanopartikül çözeltisini çekirdeksiz suda 40 kez seyreltin ve çözeltiyi dolgu hattına bir cuvette yükleyin. Cuvette'i bir Zeta potansiyel analizörüne yükleyin, elektrotların cihazla temas etmesine dikkat edin ve cihazı lipid nanopartiküllerinin spesifik makyajına göre Zeta potansiyelini ölçecek şekilde ayarlayın. Ardından Zeta lipid nanopartikül potansiyelini ölçmek için Başlat"ı tıklayın.

Bu analizde tekniğin tekrarlanabilirliğini göstermek için ayrı günlerde aynı lipit formülasyonu ve amin-fosfat oranına sahip birden fazla lipid nanopartikül grubu geliştirilmiştir. Gözlemlendiği gibi, bir ve iki parti, benzer bir poli dağılımına sahip üst üste binen boyut dağılımları sergiledi ve partiler arasındaki boyut veya kapsülleme verimliliğinde önemli bir fark gözlenmedi. Tipik olarak, formülasyon parametrelerindeki değişiklikler bazı küçük ama istatistiksel olarak anlamlı farklılıklara neden olabilir.

Örneğin, amin fosfat oranına düşürülmesi, kapsülleme verimliliğinde% 4'lük bir azalmaya ve nanopartiküllerin hidrodinamik çapında eşlik eden bir artışa neden olur. Farklı iyotlu lipitlerle formüle edilmiş ancak fosfat oranına aynı amin ile formüle edilen lipid nanopartikülleri, kapsülleme verimliliğinde önemli bir değişiklik ve parçacık çapında küçük farklılıklar sergiler. Plazmid DNA'nın kapsüllenmesi, mRA kapsülleyen lipid nanopartiküllerine kıyasla daha büyük parçacıklarla sonuçlanır, ancak her iki nanopartikül türü de benzer bir kapsülleme verimliliği gösterir.

Bununla birlikte, akış hızı proses parametreslerindeki değişiklikler lipid nanopartikül gelişimini etkilemez. Lipid nanopartikülleri harika uygulamalara sahiptir, mükemmel örnek yakın zamanda onaylanan COVID-19 aşılarıdır. Bu teknik harika bir takım seti görevi görür ve alt ektremite formülasyon taramasına izin vererek gelecekteki uygulamaların önünü lar.