Name: Mikroakışkan Karıştırma Platformu Kullanarak Gen Teslimatı için Lipid Nanopartiküllerinin Formülei ve Karakterizasyonsu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Öğrenin, mikroakışkan karıştırma platformu kullanarak gen teslimatı için lipid nanopartiküllerinin formülasyonunu ve karakterizasyonunu. Bu yöntem, tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir üretim sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Atul Saluja, Yatin Gokarn, Maria-Teresa Peracchia, Walter Schwenger ve Philip Zakas'a LNP gelişimine yönelik rehberlikleri ve katkıları için teşekkür ederiz.

Şekil 1 'de genel işlemin şeması verilmiştir.
1. Tamponların hazırlanması
NOT: Tamponların steril filtrelanması, nükleik asit ve LNP kalitesini etkileyebilecek partikülleri çıkarmak için burada şiddetle tavsiye edilir.
<ol><li>Fosfat Tamponlu Tuzlu (PBS)<ol>
<li>Nükleaz içermeyen suda 8 mM Na2HPO4,2 mM KH2PO4, 137 mM NaCl ve 2,7 mM KCl kullanarak 1x PBS hazırlayın ve pH'ı 7,4'e ayarlayın.</li>
		<li>0,22 μm gözenek boyutunda bir filtre kullanarak vakum filtrasyonu ile sterilize edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sitrat Arabelleği<ol>
<li>Nükleoz içermeyen suda 5 mM sodyum sitrat, 5 mM sitrik asit ve 150 mM sodyum klorür kullanarak sitrat tamponu hazırlayın ve pH 4.5'e ayarlayın.</li>
		<li>0,22 μm gözenek boyutunda bir filtre kullanarak vakum filtrasyonu ile sterilize edin. NOT: Sitrat tamponun sadece mRNA LNP'de kapsüllenecek nükleik asit ise hazırlanması gerekir. DNA kapsüllenecekse 1.2'yi atla ve 1.3'e geç.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Malic Asit Tamponu<ol>
<li>Çekirdeksiz suda 20 mM malik asit ve 30 mM sodyum klorür kullanarak malik asit tamponu hazırlayın ve pH 3.0'a ayarlayın.</li>
		<li>0,22 μm gözenek boyutunda bir filtre kullanarak vakum filtrasyonu ile sterilize edin. NOT: Malik asit tamponu sadece DNA LNP'de kapsüllenecek nükleik asit ise hazırlanması gerekir. mRNA kapsüllenecekse 1.3'i atlayın. Citrate tampon mRNA kapsülleme için kullanılır, çünkü malik asit tamponu ile 3.0'ın alt pH'ı mRNA bozulması olasılığının artmasına neden olabilir. Protokol burada duraklatılabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Lipit karışımının hazırlanması
<ol><li>Stok lipitler toz halindeyse, saf 200 kanıt etanolde çözün.</li>
	<li>İstenilen azı dişi oranına göre lipid bileşenlerinin gerekli karışımını hesaplayın. Burada 10 mM'lik toplam lipit konsantrasyonu için örnek olarak 50:10:39:1 molar oranı (iyinil lipid:yardımcı lipid:kolesterol:PEG) kullanılacaktır. Tablo 1, bu bileşenlerin her biri için gereken konsantrasyonları ve hacimleri gösterir. NOT: Mikroakışkan mikser için etanol (EtOH) içinde lipid karışım konsantrasyonunu elde etmek için gereken hacim hesaplanırken, EtOH ilavesinin lipit konsantrasyonlarını etkilemediğinden emin olmak için toplam hacim hesaba katlanır. Örneğin, 68,5 μL'lik iyotlu bir lipit hacmi, etanoldeki 5 mM konsantrasyonunun toplam 533 μL lipit karışım hacmi ile çarpması ve daha sonra 38,9 mM'lik stok lipit konsantrasyonuna bölünmesiyle hesaplanır.</li>
	<li>Bileşenlerin aralıklı girdapla karışmasını sağlamak için her lipid stok çözeltisinin uygun miktarını bir cam şişeye ekleyin. Toplam 533 μL karışımı için 200 prova etanol ekleyin. Örneğin Tablo 1, bu 254 μL etanoldür. NOT: 1 mL LNP üretmek için tek bir çalışma için 342,5 μL lipid çözeltisi gerekir. Bunun nedeni, numune toplamadan önce ve sonra atılan bir miktar hacim ile organik lipid çözeltisine 3:1 sulu nükleik asit karışımıdır. Fazlalık olarak telafi etmek için 533 μL'lik bir karışım yapılır.</li>
</ol>3. Nükleik asit çözeltisinin hazırlanması
NOT: Nükleik asit çözeltilerinin hazırlanması ve işlenmesi mümkün olan her yerde steril ve RNase içermeyen bir ortamda yapılmalıdır. Nükleik asitle mümkün olduğunda bir biyogüvenlik kabininde çalışın.
<ol><li>Yok oranını hesapla. N/P oranı, iyotlanabilir lipid amin gruplarının (N) negatif yüklü nükleik asit fosfat gruplarının (P) toplam sayısına kadar olan toplam sayısıdır. Yok oranı genellikle LNP oluşumu sırasında optimize edilebilen bir parametredir. Aşağıdaki adımları izleyin.<ol>
<li>Aşağıdaki formülü kullanarak N birimlerinin sayısını hesaplayın: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62226/62226eq01.jpg"> NOT: Iyinilenebilir lipit konsantrasyonu (Tablo 1) 5 x 10-6 mol / mL'ye eşdeğer olan 5 mM'dir. Gerekli lipit enjeksiyon hacmi 0.3425 mL'dir. Örneğin, molekül başına N birimi sayısı 1 ise, yukarıdaki denklemi kullanarak, lipid karışımında 1,03 x10 18 N birim vardır.</li>
		<li>İstediğiniz YOK oranı için P birimlerini hesaplayın. Burada örneğin bir YOK = 36 kullanılır. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62226/62226eq02.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aşağıdaki denklemi kullanarak 2,86 x 1016 P birim elde etmek için gerekli nükleik asit konsantrasyonu hesaplayın. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62226/62226eq03.jpg"> Burada, mRNA için baz çifti başına P birimi sayısı 1 ve DNA 2'dir. 1.200 baza sahip bir mRNA için, N/P = 36 için gereken mRNA miktarı 3,96 x 10-11 bendir.</li>
	<li>Aşağıdaki denklemi kullanarak N/P = 36 için gereken mRNA kütle konsantrasyonunun hesapını hesaplayın. <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/62226/62226eq04.jpg"> Ribonükleotid monofosfat ünitesinin ortalama moleküler ağırlığı 322 g/mol30'dur. 1.200 baz mRNA ile mRNA'nın moleküler ağırlığı 386.400 g/mol'dir. Nükleik asit çözeltisinin gerekli enjeksiyon hacmi 1.028 mL'dir. Böylece, ihtiyaç duyulan mRNA konsantrasyonu 1.488x10-5 g/mL'dir, bu da 14.88 μg / mL'dir.</li>
	<li>Sitrat tamponunda 1,5 mL 14,88 μg/mL mRNA yapın. NOT: DNA nükleik asit kapsüllendiğinde, nükleik asit çözeltisini oluşturan malik asit tamponu kullanın.</li>
</ol>4. Mikroakışkan kanalların astarlandırılması
NOT: Bu protokol, cihaz üreticisinin yönergelerinden uyarlanmıştır.
<ol><li>Uygun alanlara tıklayarak astar parametrelerini enstrüman yazılımına girin (Tablo 2). NOT: 3:1 akış oranı ve 4-12 mL/dk akış hızı27,31 önerilir. Bu, üretici tarafından olduğu kadar burada sunulan çalışmalarda da optimal olduğu gösterilmiştir. Uygulamaya yönelik ilgi çekiciyse, bu değiştirilebilir.</li>
	<li>Cihazın kapağını açın ve dönen bloğa bir mikroakışkan kartuş yerleştirin.</li>
	<li>Şırınna ucunda kabarcık veya hava boşluğu olmadığından emin olarak 1 mL şırındağa en az 0,5 mL etanol çizin. Bu şırınnayı kartuşun sağ girişine yükleyin.</li>
	<li>3 mL'lik bir şırınnayı 1,5 mL sulu tamponla doldurun (RNA için sitrat ve DNA için malik asit), hava kabarcıkları veya boşluklar olmadığından emin olun. Bu şırınnayı kartuşun sol girişine yükleyin.</li>
	<li>Atık konteyneri olarak hizmet vermek için klips tutuculara iki adet 15 mL konik tüp yerleştirin.</li>
	<li>Parametrelerin doğru girilmesini sağlayarak karıştırmaya başlamak için Enstrüman yazılımında Çalıştır'a tıklayın.</li>
	<li>Cihaz, alt mavi ışığın kapanmasıyla belirtilen astarlamayı durdurduğunda, kapağı açın ve konik tüpleri ve şırıngları düzgün bir şekilde atın.</li>
</ol>5. LNP oluşumu
NOT: Bu protokol, cihaz üreticisinin yönergelerinden uyarlanmıştır.
<ol><li>Uygun alanları tıklatarak yazılımı formülasyon parametreleriyle güncelleştirin (Tablo 2).</li>
	<li>1 mL'lik bir şırınnayı lipit karışımı ile doldurun (adım 2'de hazırlanır). Şırınd ucundaki hava boşluklarını veya kabarcıkları çıkarın ve şırınnayı kartuşun sağ tarafına yerleştirin.</li>
	<li>Nükleik asit çözeltisini (adım 3'te hazırlanmış) 3 mL şırınna çekerek şırınna ucunda kabarcık veya hava boşluğu olmadığından emin olun. Şırındıcı kartuşun sol girişine yerleştirin. NOT: LNP'lerin 1 mL'lik bir çözümünü yapmak için birimler sağlanır. Bu cihaz 10 mL'ye kadar şırıng boyutlarını bir araya getirebilir ve hacimler sonuç üzerinde hiçbir etkisi olmadan buna göre ölçeklendirilebilir. Bir preparatta hazırlanabilecek maksimum LNP hacmi 12 mL'dir.</li>
	<li>15 mL RNase içermeyen konik tüpü örnek adıyla etiketlenin ve sol tüp klipsine yerleştirin. Doğru tüp klipsine 15 mL atık konik yerleştirin.</li>
	<li>Parametrelerin doğru girişini onayladıktan sonra cihazın kapağını kapatın ve Çalıştır'ı tıklatın.</li>
	<li>Cihazın çalışması bittikten sonra, atık kabını ve kartuşu düzgün bir şekilde atın. Konik tüpü LNP örneğiyle tutun.</li>
	<li>Etanol'ü %5 (v/v) &lt; en aza indirmek için LNP 5x'i PBS ile seyreltin. NOT: Bozulmayı önlemek için mikroakışkan karıştırmadan sonra LNP'lerin PBS'de mümkün olan en kısa sürede seyreltmesi önemlidir. Seyreltmeyi her zaman bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin ve tampon değişimleri boyunca biyogüvenlik kabininde çalışmaya devam edin.</li>
</ol>6. Tampon değişimi
NOT: Ultra santrifüj filtreleri kullanma protokolü sağlanmıştır. Bu yöntem tamponların daha verimli bir şekilde değiştirilmesine neden olurken, diyaliz burada değiştirilebilir.
<ol><li>5 dakika boyunca 1000 x g'da santrifüjleme yaparak 2 mL PBS'lik ultra santrifüj filtresini (100 kDa gözenek boyutu) önceden yıkayın. PBS'i alt bölmeden boşaltın. NOT: PBS, pH'ı fizyolojik olarak alakalı olan ve iyotlu lipitin nötr bir yüke sahip olmasına neden olacak 7,4 ± 0,2'ye çıkarmak için seçilir.</li>
	<li>Önceden yıkanmış ultra santrifüj filtresinin üst bölmesine seyreltilmiş LNP'ler ve 12 dakika boyunca 1000 x g'da santrifüj ekleyin.</li>
	<li>Akış akışını alt bölmeden atın. Her seferinde ultra santrifüj filtresine 5 mL PBS ekleyerek iki yıkama daha gerçekleştirin. Aynı parametrelerde santrifüj. Korunması gereken en fazla birim yoktur. NOT: Ölçeklenmiş bir LNP hacmi hazırlanmışsa, her yıkama için PBS hacmini buna göre artırın. Örneğin, tek bir çalıştırmada 2 mL LNP hazırlanmışsa, yıkama başına 10 mL PBS önerilir.</li>
	<li>LNP kaybını en aza indirmek için LNP solüsyonunun ultra santrifüj filtresinin duvarlarına birkaç kez karşı borulayın. LNP çözümünü ultra santrifüj filtresinden çıkarın ve çekirdeksiz bir şişede saklayın. 1 mL'lik LNP çözümünün son hacmini elde etmek için gerekirse PBS ekleyin.</li>
	<li>Gerekirse önceden ıslanmış 0,2 μm şırınna filtresinden filtreleyin. NOT: Protokol burada duraklatılabilir.</li>
</ol>7. Kapsülleme verimliliğini ölçün
<ol><li>PBS'de çalışan nükleik asit çözeltisinin 2 kat seri seyreltmelerini yaparak, en yüksek 500 ng/mL konsantrasyondan başlayarak ve en az beş seyreltme yaparak standart bir eğri hazırlayın. PBS'i boş olarak kullanın.</li>
	<li>LNP numune seyreltmelerini hazırlayın. Standart eğrinin orta noktası etrafında yatan yaklaşık bir teorik konsantrasyon elde etmek için LNP örneklerini PBS ile seyreltin (örneğin, ilk konsantrasyondan tahmin edilen 250 ng/mL nükleik asit).</li>
	<li><li> </li><li><li><li><li><li><li><li><li><li> </li></ol><ol><li><li><li> </li></ol><ol><li> </li><li></li></ol><ol><li> </li><li><ol><li><li></li></ol></li></ol>

<ol><li>Mitchell, M. J., Billingsley, M. M., Haley, R. M., Wechsler, M. E., Peppas, N. A., Langer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+precision+nanoparticles+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Engineering precision nanoparticles for drug delivery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. , 1-24 (2020).</li>
<li>Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+therapeutics%3A+an+emerging+treatment+modality+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscience+and+technology%3A+A+collection+of+reviews+from+nature+journals%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle therapeutics: an emerging treatment modality for cancer.</a> Nanoscience and technology: A collection of reviews from nature journals. (239), 250(2010).</li>
<li>Patra, J. K., Das, G., Fraceto, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano+based+drug+delivery+systems%3A+recent+developments+and+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Nano based drug delivery systems: recent developments and future prospects.</a> J Nanobiotechnol. 16 (71), (2018).</li>
<li>Rai, R., Alwani, S., Badea, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+nanoparticles+in+gene+therapy%3A+New+avenues+of+design+and+optimization+for+delivery+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Polymers%22%5BJournal%5D)">Polymeric nanoparticles in gene therapy: New avenues of design and optimization for delivery applications.</a> Polymers. 11 (4), 745(2019).</li>
<li>Bailey, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+polymer+micelles+of+controlled+size%2C+stability%2C+and+functionality+for+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Symposium+Series%22%5BJournal%5D)">Designing polymer micelles of controlled size, stability, and functionality for siRNA delivery.</a> ACS Symposium Series. 1271, 35-70 (2017).</li>
<li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-viral+vectors+for+gene-based+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Non-viral vectors for gene-based therapy.</a> Nature Reviews Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).</li>
<li>Bailey-Hytholt, C. M., Nagarajan, R., Camesano, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F%C3%B6rster+resonance+energy+transfer+probing+of+assembly+and+disassembly+of+short+interfering+RNA%2FPoly%28ethylene+glycol%29-Poly-L-Lysine+polyion+complex+micelles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Assemblies%3A+Characterization+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Förster resonance energy transfer probing of assembly and disassembly of short interfering RNA/Poly(ethylene glycol)-Poly-L-Lysine polyion complex micelles.</a> Molecular Assemblies: Characterization and Applications. , 47-60 (2020).</li>
<li>Puri, A., Loomis, K., Smith, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-based+nanoparticles+as+pharmaceutical+drug+carriers%3A+from+concepts+to+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Ther+Drug+Carrier+Syst%22%5BJournal%5D)">Lipid-based nanoparticles as pharmaceutical drug carriers: from concepts to clinic.</a> Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 26 (6), 523-580 (2009).</li>
<li>Cullis, P. R., Hope, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanoparticle+systems+for+enabling+gene+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Lipid nanoparticle systems for enabling gene therapies.</a> Molecular Therapy. 25 (7), 1467-1475 (2017).</li>
<li>Munsell, E. V., Ross, N. L., Sullivan, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Journey+to+the+center+of+the+cell%3A+Current+Nanocarrier+design+strategies+targeting+biopharmaceuticals+to+the+cytoplasm+an+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Journey to the center of the cell: Current Nanocarrier design strategies targeting biopharmaceuticals to the cytoplasm an nucleus.</a> Current Pharmaceutical Design. 22 (9), 1227-1244 (2016).</li>
<li>Zhao, Y., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanoparticles+for+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Lipid nanoparticles for gene delivery.</a> Advances in Genetics. 88, 13-36 (2014).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+particle+size+on+the+in+vivo+potency+of+lipid+nanoparticle+formulations+of+siRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Influence of particle size on the in vivo potency of lipid nanoparticle formulations of siRNA.</a> Journal of Controlled Release. 235, 236-244 (2016).</li>
<li>Wan, C., Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanoparticle+delivery+systems+for+siRNA-based+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Delivery+and+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Lipid nanoparticle delivery systems for siRNA-based therapeutics.</a> Drug Delivery and Translational Research. 4 (1), 74-83 (2014).</li>
<li>Kulkarni, J. A., Cullis, P. R., Van Der Meel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanoparticles+enabling+gene+therapies%3A+From+concepts+to+clinical+utility%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Lipid nanoparticles enabling gene therapies: From concepts to clinical utility.</a> Nucleic Acid Therapeutics. 28 (3), 146-157 (2018).</li>
<li>Shin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COVID-19+vaccine+development+and+a+potential+nanomaterial+path+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">COVID-19 vaccine development and a potential nanomaterial path forward.</a> Nature Nanotechnology. 15 (8), 646-655 (2020).</li>
<li>Thanh Le, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+COVID-19+vaccine+development+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The COVID-19 vaccine development landscape.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 19 (5), 305-306 (2020).</li>
<li>Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+lipid+nanoparticles+for+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery.</a> Pharmaceutics. 5 (3), 498-507 (2013).</li>
<li>Cayabyab, C., Brown, A., Tharmarajah, G., Thomas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+lipid+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Precision+Nanosystems+Application+Note%22%5BJournal%5D)">mRNA lipid nanoparticles.</a> Precision Nanosystems Application Note. , (2019).</li>
<li>Gilleron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-based+analysis+of+lipid+nanoparticle-mediated+siRNA+delivery%2C+intracellular+trafficking+and+endosomal+escape%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape.</a> Nature Biotechnology. 31 (7), 638-646 (2013).</li>
<li>Suzuki, Y., Ishihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+activity+and+uptake+mechanism+of+siRNA-lipid+nanoparticles+with+an+asymmetric+ionizable+lipid%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Structure, activity and uptake mechanism of siRNA-lipid nanoparticles with an asymmetric ionizable lipid.</a> International Journal of Pharmaceutics. 510 (1), 350-358 (2016).</li>
<li>Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivering+the+messenger%3A+Advances+in+technologies+for+therapeutic+mRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery.</a> Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).</li>
<li>Schmid, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acidic+environment+in+endocytic+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">The acidic environment in endocytic compartments.</a> Biochemical Journal. 303 (2), 679-680 (1994).</li>
<li>Maugeri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linkage+between+endosomal+escape+of+LNP-mRNA+and+loading+into+EVs+for+transport+to+other+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells.</a> Nature Communications. 10 (1), (2019).</li>
<li>Kulkarni, J. A., Witzigmann, D., Leung, J., Tam, Y., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+role+of+helper+lipids+in+lipid+nanoparticle+formulations+of+siRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">On the role of helper lipids in lipid nanoparticle formulations of siRNA.</a> Nanoscale. (45), (2019).</li>
<li>Hafez, I. M., Maurer, N., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanism+whereby+cationic+lipids+promote+intracellular+delivery+of+polynucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">On the mechanism whereby cationic lipids promote intracellular delivery of polynucleic acids.</a> Gene Therapy. 8 (15), 1188-1196 (2001).</li>
<li>Hafez, I. M., Culis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+lipid+polymorphism+in+intracellular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Roles of lipid polymorphism in intracellular delivery.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 47 (2-3), 139-148 (2001).</li>
<li>Evers, M. J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State-of-the-art+design+and+rapid-mixing+production+techniques+of+lipid+nanoparticles+for+nucleic+acid+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Small+Methods%22%5BJournal%5D)">State-of-the-art design and rapid-mixing production techniques of lipid nanoparticles for nucleic acid delivery.</a> Small Methods. 2 (9), 1700375(2018).</li>
<li>Mui, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+polyethylene+glycol+lipid+desorption+rates+on+pharmacokinetics+and+pharmacodynamics+of+siRNA+lipid+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Influence of polyethylene glycol lipid desorption rates on pharmacokinetics and pharmacodynamics of siRNA lipid nanoparticles.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2 (139), (2013).</li>
<li>Zukancic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+poly%28Ethylene+glycol%29+and+lipid+structure+in+targeted+gene+delivery+to+lymph+nodes+by+lipid+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">The importance of poly(Ethylene glycol) and lipid structure in targeted gene delivery to lymph nodes by lipid nanoparticles.</a> Pharmaceutics. 12 (11), 1-16 (2020).</li>
<li>NEBioCalculator. New England BioLabs Inc. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas">https://nebiocalculator.neb.com/#!/formulas</a> (2020).</li>
<li>Kastner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+manufacturing+of+size-tuned+liposomes+by+a+new+microfluidics+method+using+enhanced+statistical+tools+for+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">High-throughput manufacturing of size-tuned liposomes by a new microfluidics method using enhanced statistical tools for characterization.</a> International Journal of Pharmaceutics. 477 (1-2), 361-368 (2014).</li>
<li>Zhigaltsev, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bottom-up+design+and+synthesis+of+limit+size+lipid+nanoparticle+systems+with+aqueous+and+triglyceride+cores+using+millisecond+microfluidic+mixing%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Bottom-up design and synthesis of limit size lipid nanoparticle systems with aqueous and triglyceride cores using millisecond microfluidic mixing.</a> Langmuir. 28 (7), 3633-3640 (2012).</li>
<li>Belliveau, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+synthesis+of+highly+potent+limit-size+lipid+nanoparticles+for+in+vivo+delivery+of+siRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1 (8), 37(2012).</li>
<li>Hassett, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+lipid+nanoparticles+for+intramuscular+administration+of+mRNA+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Optimization of lipid nanoparticles for intramuscular administration of mRNA vaccines.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 15, 1-11 (2019).</li>
<li>Tanaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+delivery+of+mRNA+to+colon+inflammatory+lesions+by+lipid-nano-particles+containing+environmentally-sensitive+lipid-like+materials+with+oleic+acid+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">The delivery of mRNA to colon inflammatory lesions by lipid-nano-particles containing environmentally-sensitive lipid-like materials with oleic acid scaffolds.</a> Heliyon. 4 (12), 00959(2018).</li>
<li>Singh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+lipid+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Precision+Nanosystems+Application+Note%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid lipid nanoparticles.</a> Precision Nanosystems Application Note. , (2018).</li>
</ol>

Tüm yazarlar Sanofi'nin çalışanlarıdır. Yazarlar, çıkar çatışması veya rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Tekrarlanabilirlik, hız ve düşük hacimli tarama, diğer mevcut yöntemlere (örneğin, lipid film hidrasyon ve etanol enjeksiyonu) kıyasla LNP'leri oluşturmak için mikroakışkan karıştırma kullanmanın önemli avantajlarıdır. Bu yöntemin tekrarlanabilirliğini, farklı LNP partileriyle gözlenen kapsülleme verimliliği veya partikül boyutu üzerinde hiçbir etkisi olmadan gösterdik. Bu, LNP'ler de dahil olmak üzere herhangi bir terapötik tedavinin klinik olarak kullanılabilir hale gelmesi için gerekli bir kriterdir.
<p class="jov...

İlaç taşıyıcıları, düşük sitotoksiklik, artan biyoyararlanlık ve gelişmiş stabilite1,2,3dahil olmak üzere tipik elverişli özelliklere sahip bir terapötik korumak ve sunmak için kullanılır. Polimerik nanopartiküller, miseller ve lipid bazlı parçacıklar daha önce nükleik asit kapsülleme ve teslimi için araştırılmıştır4,5,6,7. Lipitler, yüksek stabilite ile biyouyumlu oldukları için lipozomlar ve lipid nanopartiküller de dahil olmak üzere farklı nanokarrier sistemlerinde kullanılmıştır8. LNP'ler gen iletimi için nükleik asitleri kolayca kapsülleyebilir9,10. Sistemik dolaşım11 sırasında nükleik asidi serum proteazları tarafından bozulmaya karşı korurlar ve LNP'lerin yüzey topografyası ve fiziksel özellikleri biyodistribution12'yietkilediği için belirli bölgelere teslimatı artırabilirler. LNP'ler ayrıca doku penetrasyonunu ve hücresel alımı iyileştirir9. Önceki çalışmalar, 2018 yılında Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) ve Avrupa İlaç Ajansı tarafından onaylanan kalıtsal transtiretein aracılı amiloidoz14 tedavisinin tedavi polinöropatisi için siRNA terapötik içeren ilk ticari olarak mevcut LNP de dahil olmak üzere, bir LNP13içinde siRNA kapsüllemenin başarısını göstermiştir. Daha yakın zamanda, LNP'ler daha büyük nükleik asit moieties, yani mRNA ve DNA9'unteslimi için çalışılmaktadır. 2018 itibariyle, klinik çalışmalardan geçen ~ 22 lipid bazlı nükleik asit iletim sistemi vardı14. Ek olarak, LNP'leri içeren mRNA şu anda önde gelen adaylardır ve COVID-19 aşısı15,16için istihdam edilmiştir. Bu viral olmayan gen tedavileri için potansiyel başarı, nükleik asidin yüksek kapsüllenmesine sahip küçük (~100 nm), kararlı ve düzgün parçacıklar oluşturmayı gerektirir.
LNP formülasyonunda ana bileşen olarak iyotlu bir lipit kullanımı karmaşıklık, kapsülleme ve teslimat efekti14için avantajlar göstermiştir. Iyâne edilebilir lipitler tipik olarak 7 < asit ayrışma sabiti (pKa) vardır; örneğin, DILINOLEYLMETHYL-4-dimetilaminobütirat (D-Lin-MC3-DMA), FDA onaylı LNP formülasyonunda kullanılan iyonlaşabilir lipit, 6.4417pKa'ya sahiptir. Düşük pH'da, iyotlanabilir lipid üzerindeki amin grupları protonlanır ve pozitif olarak şarj edilir, bu da mRNA ve DNA'da negatif yüklü fosfat grupları ile montaja izin verir. Amin oranı, "N", gruplar fosfat, "P", gruplar montajı optimize etmek için kullanılır. Yok oranı, formülasyona bağlı olarak değişen lipitlere ve kullanılan nükleik asitlere bağlıdır18. Oluşumdan sonra, pH terapötik uygulama için nötr veya fizyolojik bir pH'a ayarlanabilir. Bu pH değerlerinde, iyotlanabilir lipit de LNP'ye nötr yüzey yükü veren deprotonated edilir.
Iyotlu lipid ayrıca endosomal kaçış19,20. LNP'ler hücresel alım sırasında endositoz geçirir ve mRNA kargosunu hücre sitoplazması veya DNA kargosuna çekirdek21'eteslim etmek için endozomdan salınmalıdır. Endozom içinde tipik olarak hücre dışı ortamdan daha asidik bir ortam vardır, bu da iyotlanabilir lipidi pozitif yüklü hale getirir22,23. Pozitif yüklü iyonizlenebilir lipid, endosomal lipid zarındaki negatif yüklerle etkileşime girebilir, bu da endozomun LNP ve nükleik asidin salınmasına izin veren istikrarsızlaşmasına neden olabilir. Farklı iyotlanabilir lipitler şu anda hem LNP dağılımının hem de endosomal kaçış14'ün etkinliğini artırmak için incelenmektedir.
Bir LNP'nin diğer tipik bileşenleri arasında fosfatidikolin (PC) veya fosfotitananolamin (PE) lipid gibi yardımcı lipitler bulunur. 1,2-Dioleoyl-sn-glisero-3-fosphoethanolamine (DOPE), 1,2-distearoyl-sn-glisero-3-fosphocholine (DSPC) ve 1,2-dioleoyl-sn-glisero-3-fosfokolin (DOPC) yaygın olarak kullanılan yardımcı lipitler24,25. DOPE'un ters altıgen II (HII) fazı oluşturduğu ve membran füzyonu26ile transfeksiyonu artırdığı gösterilmiştir, DSPC'nin silindirik geometrisi27ile LNP'leri stabilize ettiği düşünülmektedir. Kolesterol ayrıca membran sertliğini artırmak için formülasyona dahil edilir ve daha sonra LNP'nin stabilitesine yardımcı olan. Son olarak, lipid konjuge polietilen glikol (PEG), parçacık kendi kendine montajına yardımcı olmak için gerekli sterik bariyeri sağlamak için formülasyona dahil edilir27. PEG ayrıca toplamayı önleyerek LNP'lerin depolama kararlılığını artırır. Ayrıca, PEG genellikle gizli bir bileşen olarak kullanılır ve LNP'ler için dolaşım süresini artırabilir. Bununla birlikte, bu özellik, apolipoprotein E (ApoE)28tarafından yönlendirilen endojen bir hedefleme mekanizması aracılığıyla LNP'lerin hepatositlere işe alınması için de zorluklar doğurabilir. Bu nedenle, çalışmalar PEG'in LNP'den yayılması için acyl zincir uzunluğunu araştırmıştır, kısa uzunlukların (C8-14) LNP'den ayrıştığını ve daha uzun acyl uzunluklarına kıyasla ApoE işe alımına daha uygun olduğunu tespitederek 28. Ayrıca, PEG'in eşlendiği lipid kuyruğunun doygunluk derecesinin LNP'lerin doku dağılımını etkilediği gösterilmiştir29. Son zamanlarda, biyolojik ilaç ürünü formülasyonlarında yaygın olarak kullanılan bir yüzey aktif madde olan ve uzun bir doymamış lipit kuyruğuna sahip olan Tween 20'nin, enjeksiyon bölgesinde kası büyük ölçüde transktasyon yapan PEG-DSPE'ye kıyasla lenf düğümlerinin boşaltılmasında yüksek transfeksiyona sahip olduğu gösterilmiştir29. Bu parametre istenen LNP biyodistribution elde etmek için optimize edilebilir.
LNP'leri oluşturmanın geleneksel yöntemleri ince film hidrasyon yöntemini ve etanol enjeksiyon yönteminiiçerir 27. Bunlar kolayca kullanılabilen teknikler olsa da, aynı zamanda emek yoğundur, düşük kapsülleme verimliliğine neden olabilir ve27'yiölçeklendirmek zordur. Karıştırma tekniklerindeki gelişmeler, daha düzgün parçacıklar geliştirirken, ölçek büyütmek için daha uygun yöntemlerle sonuçlanmıştır27. Bu yöntemler arasında T-junction karıştırma, sendelemiş balıksırtı karıştırma ve mikroakışkan hidrodinamik odaklama27bulunur. Her yöntemin benzersiz bir yapısı vardır, ancak hepsi nükleik asidi içeren sulu bir fazın lipid bileşenlerini içeren organik bir fazla hızlı bir şekilde karıştırılmasına izin verir ve bu da nükleik asidin yüksek kapsüllenmesine neden27. Bu protokolde, kademeli balıksırtı karıştırma tasarımını kullanan mikroakışkan bir kartuş aracılığıyla hızlı ve kontrollü karıştırma kullanılır. Bu protokol, LNP'ler içeren nükleik asidin hazırlanmasını, montajını ve karakterizasyonunu özetler.

<table><tbody><tr><td>1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-metoksipolietilen glikol-2000 (C-14 PEG)</td> <td>Avanti Polar Lipidler</td><td>880151P</td><td></td></tr><tr><td>10 & mikro; l Dereceli Filtre İpuçları&nbsp; (RNase-, DNase-, DNA içermez)</td><td>ABD Bilimsel</td><td>1121-3810</td><td></td></tr><tr><td>1000 & l Dereceli Filtre Uçları (RNase-, DNase-, DNA içermez)</td> <td>USA Scientific</td><td>1111-2831</td><td></td></tr><tr><td>20 & l Eğimli Filtre Uçları (RNase-, DNase-, DNA içermez)</td> <td>USA Scientific</td><td>1120-1810</td><td></td></tr><tr><td>200 & mikro; l Granül Filtre Uçları (RNase-, DNase-, DNA içermez)</td><td>USA Scientific</td><td>1120-8810</td><td></td></tr><tr><td>3&beta;-Hidroksi-5-kolesten, 5-Kolesten-3&beta;-ol (Kolesterol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>BD Slip Tip Steril Şırıngalar (1 ml şırınga)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-823-434</td><td></td></tr><tr><td>BD Slip Tip Steril Şırıngalar (3 ml şırınga)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-823-436</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Genel Kullanım Şırınga İğneleri (BD Künt Dolgu İğnesi 18G)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23-021-020</td><td></td></tr><tr><td>Tezgah Üstü Santrifüj</td><td>Beckman coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siyah 96 kuyulu plakalar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-245-177</td><td></td></tr><tr><td>BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, DNA içermeyen mikrosantrifüj tüpleri (1.5mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-380-813</td><td></td></tr><tr><td>Sitrik Asit</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-002-611</td><td></td></tr><tr><td>Corning 500ml Vakum Filtresi / Saklama Şişesi Sistemi, 0.22 um gözenekli</td><td>Corning</td><td>430769</td><td></td></tr><tr><td>Tek kullanımlık katlanmış kılcal hücreler</td><td>Malvern</td><td>DTS1070</td><td></td></tr><tr><td>Etil Alkol, Saf 200 geçirmez</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Marka Yarı Mikro Küvet</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>14955127</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen Konik Tüpler (15 mL) (DNase-RNaz içermez)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM12500</td><td></td></tr><tr><td>MilliporeSigma Amicon Ultra Santrifüj Filtre Üniteleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>UFC901024</td><td></td></tr><tr><td>NanoAssemblr Tezgah Üstü</td><td>Hassas Nanyosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz içermeyen su</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9930</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Test Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; P7589</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT RiboGreen RNA Test Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R11490</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-004-036</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Sitrat, Dihidrat, granül</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-004-056</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax i3x</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano</td><td>Malvern</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mikroakışkan karıştırma platformu kullanarak gen teslimatı için lipid nanopartiküllerinin formülei ve karakterizasyonsu

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

Lipid bazlı ilaç taşıyıcıları, küçük boyutları, biyouyumlulukları ve yüksek kapsülleme verimlilikleri nedeniyle klinik ve ticari olarak mevcut doğum sistemleri için kullanılmıştır. Nükleik asitleri kapsüllemek için lipid nanopartiküllerinin (LNP) kullanılması, RNA veya DNA'yı bozulmaya karşı korurken hücresel alımı teşvik etmek için avantajlıdır. LNP'ler genellikle iyotlu lipid, yardımcı lipid, kolesterol ve polietilen glikol (PEG) konjuge lipid dahil olmak üzere birden fazla lipit bileşeni içerir. LNP'ler, düşük pH'da katyonik olan ve negatif yüklü RNA veya DNA ile komplekslenme sağlayan iyonizlenebilir lipid varlığı nedeniyle nükleik asitleri kolayca kapsülleyebilir. Burada LNP'ler, lipid bileşenlerinin organik bir fazda ve nükleik asit bileşeninin sulu bir fazda hızlı bir şekilde karıştırılması kullanılarak haberci RNA (mRNA) veya plazmid DNA'nın (pDNA) kapsüllenerek oluşturulur. Bu karıştırma, laminar akışı korurken nanopartikül kendi kendine montajına izin vererek hassas bir mikroakışkan karıştırma platformu kullanılarak gerçekleştirilir. Hidrodinamik boyut ve polidisperite dinamik ışık saçılımı (DLS) kullanılarak ölçülür. LNP üzerindeki etkili yüzey yükü, zeta potansiyeli ölçülerek belirlenir. Kapsülleme verimliliği, tuzaklanmış nükleik asidi ölçmek için floresan bir boya kullanılarak karakterize edilir. Temsili sonuçlar, bu yöntemin tekrarlanabilirliğini ve farklı formülasyon ve işlem parametrelerinin geliştirilen LNP'ler üzerindeki etkisini göstermektedir.

Tekniğin tekrarlanabilirliğini göstermek için ayrı günlerde aynı lipit formülasyonuna ve 6 N/P oranına sahip birden fazla LNP grubu geliştirilmiştir. Toplu iş 1 ve 2, benzer polidispersiteye sahip boyut dağılımlarının çakışmasına neden oldu (Şekil 2A) İki farklı parti arasındaki boyut veya kapsülleme verimliliğinde önemli bir fark gözlenmedi (Şekil 2B). Kapsülleme verimliliği her parti için yüksekti (%&gt;98,5) ve boyutlar 77 nm ...

Lipid nanopartikülleri mRNA ve DNA kapsülleme için mikroakışkan karıştırma platformu yaklaşımı kullanılarak geliştirilmiştir.

Mikroakışkan Karıştırma Platformu Kullanarak Gen Teslimatı için Lipid Nanopartiküllerinin Formülei ve Karakterizasyonsu

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...

Bu protokol, yüksek tekrarlanabilirlik ve hız ve düşük hacimli nükleik asit kapsüllenmiş lipid nanopartikülleri üretmek için kullanılabilir. Formülasyon parametreleri, klinik uygulamaya göre istenen biyo dağılımı elde etmek için ayarlanabilir. Mikroakışkan kartuşun standart balıksırtı tasarımı, karıştırma sırasında hızlı, hassas ve kontrollü bir laminar akış sağlar.Yöntem ölçekleme için uygun ve düzgün, yüksek kapsüllenmiş parçacıklar üretir. Viral yöntemlere dayanan ticari olarak onaylanmış gen terapisi ürünlerinin çoğunda, bu prosedür gen iletimi hakkında fikir verebilir, çünkü viral olmayan yaklaşımı, tekrar dosingin gerekli olduğu uygulamalara izin verir. Aralıklı girdaplı bir cam şişeye her sıvı stok çözeltisinin uygun miktarını ekleyerek başlayın.tabloda belirtildiği gibi, ardından 533 mikrolitrelik son hacme 200 prova etanol eklenmesi. Daha sonra uygun miktarda mRNA stoğu ekleyin ve istenen konsantrasyonda 1,5 mililitrelik son bir hacim elde etmek için sitrat tamponu ile seyreltin. Mikroakışkan kanalları astarlamak için, önce astar parametresini tabloda belirtildiği gibi enstrüman yazılımına girin.Ardından, cihazın kapağını açın ve dönen bloğa bir mikroakışkan kartuş yerleştirin. Şırınga ucunda kabarcık veya hava boşluğu olmamasına dikkat ederek en az 500 mikrolitre etanol'ü 1 mililitrelik bir şırıngaya yükleyin ve şırıngayı kartuşun sağ girişine yerleştirin. Hava kabarcığı veya boşluk olmamasına dikkat ederek 1,5 mililitre sitrat tamponu ile beş mililitrelik bir şırınna yükleyin ve şırınnayı kartuşun sol girişine yerleştirin.Atık konteyneri olarak hizmet vermek için klips tutuculara iki adet 15 mililitrelik konik tüp yerleştirin ve çözümleri karıştırmak için Git"i tıklayın. Cihaz, alt mavi ışığın kapanmasıyla belirtildiği gibi astarlamayı durdurduğunda, geç açın ve konik tüpleri ve şırıngları uygun şekilde atın. Lipid nanopartikül oluşumu için, tabloda belirtildiği gibi uygun formülasyon parametrelerini ayarlayın ve daha önce hazırlanmış bir lipit karışımı ile 1 mililitrelik bir şırınna yükleyin.Şırınd ucundaki hava boşluklarını veya kabarcıkları çıkarın ve şırınnayı kartuşun sağ tarafına yerleştirin. Daha önce hazırlanmış nükleik asit çözeltisini 3 mililitrelik bir şırınna yükleyin, şırıngam ucunda kabarcık veya hava boşluğu olmamasına dikkat edin ve şırınnayı kartuşun sol girişine yerleştirin. Örnek adıyla etiketlenmiş 15 mililitre RNAase içermeyen konik bir tüpü sol tüp klipsine yerleştirin ve sağ tüp klipsine 15 mililitrelik bir atık konik yerleştirin.Cihaz kapağını kapatın ve Go'yu tıklayın.Lipid ve mRNA çözeltileri mikroakışkan kartuştan akacak ve lipid nanopartikül çözeltisi konik tüplerde toplanacak. Formülasyon işleminin sonunda konik tüpü tutun, ardından lipid nanopartiküllerini 5 mililitre PBS ve biyolojik bir güvenlik kabini ile seyreltin. Tampon değişimi yapmak için, önce 100 kilodalton gözenek boyutunda ultracentrifuge filtresini 2 mililitre PBS, santrifüj ile önceden yıkayın ve ardından PBS'yi alt bölmeden boşaltın.Seyreltilmiş lipid nanopartiküllerini üç santrifüj yıkama için önceden yıkanmış ultracentrifuge filtresinin üst bölmesine ekleyin, akıştan atın ve ilk iki yıkamadan sonra ultracentrifuge filtresine 5 mililitre PBS ekleyin. Son yıkamadan sonra, nanopartikül çözeltisini nükleaz içermeyen bir şişeye aktarmadan önce nanopartikül kaybını en aza indirmek için lipid nanopartikül çözeltisini ultracentrifuge filtresinin duvarlarına birkaç kez karşılayın. Ardından, nanopartikül süspansiyonu uygun deneysel konsantrasyona ve hacme getirmek için PBS ekleyin.Lipid nanopartiküllerinin kapsülleme verimliliğini değerlendirmek için, önce pbs'de çalışan nükleik asit çözeltisinin iki kat seri seyreltmelerini hazırlaarak mililitre başına 500 nanogramdan başlayıp en az beş seyreltme yaparak standart bir eğri oluşturun. Daha sonra, standart eğrinin orta noktası etrafında yatan uygun bir teorik konsantrasyon elde etmek için PBS'deki nanopartikül örnek seyreltmelerini hazırlayın. Daha sonra uygun miktarda RNA reaktifi, Triton X100 ve PBS'yi karıştırarak lipid nanopartikül içinde ve dışında RNA varlığını tespit etmek için ribo yeşil RNA reaktifini hazırlayın.Daha sonra, sıvı nanopartikül dışında RNA varlığını tespit etmek için, yalnızca uygun miktarda RNA reaktifini ve PBS'yi karıştırın. Nükleik asit standardının ve lipid nanopartikül çözeltilerinin siyah floresan özellikli 96 kuyu plakasına çoğaltılması, daha sonra standart ve numune kopyalarına Triton X100 ile ve triton X100 olmadan eşit miktarda RNA niceleme reaktifi ekleyin. Numunelerin kapsamlı bir şekilde karıştırılmasını sağlamak için plaka okuyucusunda plaka okuyucusunda beş dakika boyunca hafiften korunan plakayı sallayın, ardından 480 nanometrelik bir heyecan dalga boyunda ve 520 nanometre emisyon dalga boyunda bir mikro plaka okuyucusunda floresan ölçün.Lipid nanopartiküllerinin hidrodinamik boyutunu ve poli dağılımını ölçmek için, önce nanopartikül çözeltisini PBS'de 40 kez seyreltin ve çözeltiyi yarı mikro bir cuvette ekleyin. Cuvette'i Zetasizer'a yükleyin ve nanopartikülleri malzeme, dağıtıcı, sıcaklık ve hücre tipine göre ölçecek cihazı ayarlamak için standart bir çalışma prosedürü seçin. Ardından lipid nanopartiküllerinin hidrodinamik boyutunu ve poli dağılımını ölçmek için Başlat"ı tıklayın.Lipid nanopartiküllerinin Zeta potansiyelini ölçmek için, nanopartikül çözeltisini çekirdeksiz suda 40 kez seyreltin ve çözeltiyi dolgu hattına bir cuvette yükleyin. Cuvette'i bir Zeta potansiyel analizörüne yükleyin, elektrotların cihazla temas etmesine dikkat edin ve cihazı lipid nanopartiküllerinin spesifik makyajına göre Zeta potansiyelini ölçecek şekilde ayarlayın. Ardından Zeta lipid nanopartikül potansiyelini ölçmek için Başlat"ı tıklayın.Bu analizde tekniğin tekrarlanabilirliğini göstermek için ayrı günlerde aynı lipit formülasyonu ve amin-fosfat oranına sahip birden fazla lipid nanopartikül grubu geliştirilmiştir. Gözlemlendiği gibi, bir ve iki parti, benzer bir poli dağılımına sahip üst üste binen boyut dağılımları sergiledi ve partiler arasındaki boyut veya kapsülleme verimliliğinde önemli bir fark gözlenmedi. Tipik olarak, formülasyon parametrelerindeki değişiklikler bazı küçük ama istatistiksel olarak anlamlı farklılıklara neden olabilir.Örneğin, amin fosfat oranına düşürülmesi, kapsülleme verimliliğinde% 4'lük bir azalmaya ve nanopartiküllerin hidrodinamik çapında eşlik eden bir artışa neden olur. Farklı iyotlu lipitlerle formüle edilmiş ancak fosfat oranına aynı amin ile formüle edilen lipid nanopartikülleri, kapsülleme verimliliğinde önemli bir değişiklik ve parçacık çapında küçük farklılıklar sergiler. Plazmid DNA'nın kapsüllenmesi, mRA kapsülleyen lipid nanopartiküllerine kıyasla daha büyük parçacıklarla sonuçlanır, ancak her iki nanopartikül türü de benzer bir kapsülleme verimliliği gösterir.Bununla birlikte, akış hızı proses parametreslerindeki değişiklikler lipid nanopartikül gelişimini etkilemez. Lipid nanopartikülleri harika uygulamalara sahiptir, mükemmel örnek yakın zamanda onaylanan COVID-19 aşılarıdır. Bu teknik harika bir takım seti görevi görür ve alt ektremite formülasyon taramasına izin vererek gelecekteki uygulamaların önünü lar.

formulating-characterizing-lipid-nanoparticles-for-gene-delivery

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Burada biz bir protokol üzerinde kuru-film yöntemini temel alır ve güvenli için kullanılan katyonik nanoliposomes, nesil için tarif ve in vitro verimli bir şekilde teslim mesajcı RNA transkripsiyonu.

Vitro verimli bir şekilde teslim için katyonik Nanoliposomes nesil mesajcı RNA transkripsiyonu

Protokol, sendelenmiş herringbone micromixer microfluidics cihazını kullanarak termosensitli lipozomların hazırlanması için optimize edilmiş parametreleri sunar. Bu aynı zamanda lipozomlar içine doksorubisin ve indosiyanyeşil co-kapsülleme ve kontrollü / tetiklenen ilaç salınımı için doksorubisin fototermal tetiklenen serbest sağlar.

Lysolipid İçeren Sıcaklığa Duyarlı Lipozomların Mikroakışkan Üretimi

RNA teslimatı da dahil olmak üzere ilaç dağıtım sistemlerinde (DDS) mikroakışkan bazlı lipid nanopartikül (LNP) üretim yöntemleri dikkat çekmiştir. Bu protokol, iLiNP adlı orijinal mikroakışkan cihazımızı kullanarak imalat, LNP (siRNA yüklü LNP) üretimi ve LNP değerlendirme süreçlerini açıklar.

Mikroakışkan Cihaz Kullanılarak siRNA Yüklü Lipid Nanopartiküllerinin Üretimi

Burada, ateşböceği lusiferazını kodlayan mRNA'yı kapsülleyen lipid nanopartiküllerini (LNP'ler) formüle etmek için bir protokol sunulmaktadır. Bu LNP'ler, HepG2 hücrelerinde in vitro ve C57BL / 6 farelerinde in vivo potansiyelleri açısından test edildi.

Mikroakışkan Karıştırma ile Formüle Edilen mRNA-Lipid Nanopartiküllerin In Vitro ve In Vivo Etkinliğinin Test Edilmesi

İki jetli bir CIJ ve dört jetli çok girişli girdap karıştırıcı (μMIVM) dahil olmak üzere sınırlı çarpma jeti (CIJ) karıştırıcı teknolojileri kullanılarak lipid nanopartiküllerinin (LNP'ler) sentezlenmesi için ayrıntılı bir protokol gösterilmiştir. CIJ mikserleri, tekrarlanabilir, türbülanslı mikro karıştırma ortamları oluşturur ve bu da monodispers LNP'lerin üretilmesiyle sonuçlanır.

Lipid Nanopartiküllerinin Kapalı Çarpmalı Jet Karıştırıcılarda Türbülanslı Akışla Sentezlenmesi

B Tipi jelatin tabanlı mühendislik nanovectors sistemi (gens), pankreas kanseri tedavisi sistemik gen teslimat ve transfeksiyon için geliştirilmiştir. Epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) nanparticles yüzey üzerinde belirli peptid değişiklik, EGFR reseptör hedef olabilir ve plazmid gibi yüksek intrasellüler glutatyon konsantrasyonları olarak azaltılması, çevre altında serbest.

İnsan Pankreas Kanseri Hücrelerinde Epidermal Büyüme Faktörü kullanarak Gen Teslimat ve Transfeksiyon Jelatin Tabanlı Engineered Nanovectors Reseptör-hedefli

Biz protein dizilerin ifade etmek için bir mikroakışkan bir yaklaşım sunuyoruz. Cihaz, mikro-mekanik vana ile kontrol reaksiyon odaları binlerce oluşur. Mikroakışkan cihaz bir mikro baskılı gen kütüphanesi ile birleştirilmiştir. Bu genler daha sonra transkripsiyonu ve deneysel kullanıma hazır bir protein dizisi sonucunda, on-chip çevrilir.

Bir mikroakışkan Platform kullanarak Yüksek throughput Protein Ekspresyonu Jeneratör

Nanoparçacık izleme analizi (NTA) ve polimerik gen teslimat nanopartiküller değerlendirmek için high-throughput Akım sitometri için bir protokol tanımlanmıştır. NTA nanoparçacık parçacık büyüklüğü dağılımı ve plazmid başına parçacık dağılımını karakterize etmek için kullanılmaktadır. Yüksek throughput flow sitometri gen teslimat biyomalzemelerin bir kütüphane için nicel transfeksiyon etkinliği değerlendirilmesini sağlar.

Polimerik Gen Taşıyıcı Değerlendirilmesi Nanoparçacık İzleme Analizi ve Yüksek throughput Flow Sitometri tarafından Nanopartiküller

Hücrelerin hızlı mekanik deformasyon makromoleküller ve nanomalzemelerin hücre içi iletimi için gelecek vaat eden bir vektör içermeyen bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. Bu protokol, geniş bir uygulama yelpazesi için sistemin nasıl kullanılacağı hakkında ayrıntılı adımlar sağlar.

Sağlam, mikroakışkan Hücre içi Delivery Platform olarak hücre Sıkma

Bir damlacık arayüz lipid ikili tabakasına karşı mikroakışkan jeti zar asimetri, zar proteinlerinin dahil edilmesi, ve malzeme kapsülleme üzerinde kontrol ve veziküllerin üretilmesi için güvenilir bir yöntem sağlar. Bu teknik, bölümlere biyomoleküllerin istenen biyolojik sistemlerin çeşitli çalışma uygulanabilir.

Mikroakışkan jeti kullanarak çift katlı lipid Vesikül Üretimi

Öğrenin, mikroakışkan karıştırma platformu kullanarak gen teslimatı için lipid nanopartiküllerinin formülasyonunu ve karakterizasyonunu. Bu yöntem, tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir üretim sağlar.

Mikroakışkan Karıştırma Platformu Kullanarak Gen Teslimatı için Lipid Nanopartiküllerinin Formülei ve Karakterizasyonsu

Daha fazla video keşfet