scRNA-Seq ve scATAC-Seq Kullanarak Retinal Gen Ekspresyonu ve Kromatin Erişilebilirliğinin Multipleks Analizi

Bu protokol, ilk fenotipleme için tek hücreli RNA-seq kullanımını sağlayacaktır. Ve tek hücreli ATAC-seq ile eşleştirildiğinde, gen düzenleyici ağların yeniden yapılandırılması. MULTI-seq kullanımı, ilk araştırma için maliyetleri düşük tutar ve tek hücreli RNA-seq ve tek hücreli ATAC-seq için eşleştirilmiş numunelerin sabitlenmesi, gen düzenleyici ağların zaman akışı analizine izin verir.

Araştırmacılar, gelişimi ve hastalığın ilerlemesini kontrol eden genetik ağları anlamak için bu protokolü kullanabilirler. Başlamak için, her numuneye 20 mikrolitre ankraj barkod çözeltisi ekleyin ve karıştırmak için pipet uygulayın. Beş dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.

Daha sonra her numuneye 20 mikrolitre ko-ankraj çözeltisi ekleyin ve beş dakika daha buz üzerinde inkübe edin. Her numuneye bir mililitre buz gibi soğuk% 1 BSA ve PBS ekleyin ve hücreleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300 x g'de santrifüj edin. Hücre peletini rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın.

Daha sonra 400 mikrolitre buz soğuk% 1 BSA ve PBS ekleyin. Dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300 x g'de santrifüj. Bir hemositometre kullanarak her numune için hücre konsantrasyonunu belirleyin ve Emülsiyonda Jel Boncuk veya GEM için gereken toplam hücre sayısını ve hacmini hesaplayın.

Her numuneden hesaplanan hacimleri yeni bir steril 1,5 mililitrelik tüpte birleştirin ve kombine numunelerin nihai hücre konsantrasyonunu belirleyin. GEM üretimi ve barkodlamasından sonra, boyut seçimini kullanarak gen ekspresyonu cDNA temizliği gerçekleştirin ve süpernatantı numune barkodunu içeren ilk seçim turundan atmadığınızdan emin olun. Süpernatantı yeni steril 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpe aktarın ve buz üzerinde saklayın.

Paramanyetik boncuk bazlı boyut seçim reaktifini vorteksleyin ve süpernatana 260 mikrolitre reaktif ve 180 mikrolitre% 100 İzopropanol ekleyin. Karışımı 10 kez pipetleyin ve beş dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Tüpü manyetik bir rafa yerleştirin ve çözeltinin temizlenmesini bekleyin.

Çözüm netleştiğinde, süpernatanı çıkarın ve atın. Boncuklara 30 saniye boyunca 500 mikrolitre% 80 etanol ekleyin, ardından süpernatanı atın. Bunu toplam iki yıkama için tekrarlayın.

Boncukları kısaca santrifüj edin ve manyetik rafa geri koyun. Zamanlayıcıyı iki dakikaya ayarlayın. Ardından artık etanolün bir P10 pipetle çıkarılmasını sağlayın ve kalan iki dakika boyunca manyetik raftaki boncukları havayla kurulayın.

Boncukları manyetik raftan çıkarın ve 100 mikrolitre elüsyon tamponunda yeniden askıya alın. Pipetleri iyice bastırın ve oda sıcaklığında iki dakika inkübe edin, ardından boncukları manyetik rafa geri koyun ve çözeltinin temizlenmesini bekleyin. Süpernatantı taze bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.

Elüsyon arabelleğinin hacminin yarısını kullanarak temizleme işlemini gösterildiği gibi tekrarlayın. ScATAC dizisine yönelik numuneler için, bir P200 pipet kullanarak mikrosantrifüj tüpünden herhangi bir sıvıyı çıkarın ve numuneleri etanol kuru buzda flaşla dondurun. ScRNA dizilimi için hedeflenen örneklerdeki hücreleri ayrıştırmak için, metin el yazmasında açıklandığı gibi papain kullanarak ayrışma adımlarını gerçekleştirin.

Hücreleri oda sıcaklığında üç dakika boyunca 300 x g'da santrifüj edin ve hücre peletini bozmadan süpernatantı çıkarın. Bir mililitre soğutulmuş PBS ekleyin ve 10 kez veya hücreler tamamen askıya alınana kadar karıştırın. Yine, dört santigrat derecede beş dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın ve PBS ile yıkamayı iki kez tekrarlayın.

Tüpü en düşük hız ayarında vortekslemeye başlayın ve hücrelerin kümelenmesini önlemek için tüpü yavaşça vortekse etmeye devam ederken, damla damla 900 mikrolitre soğutulmuş metanol ekleyin. Buz üzerindeki hücreleri 15 dakika boyunca inkübe edin. Bir hemositometre kullanarak sabit hücrelerin konsantrasyonunu belirleyin ve tripan mavisi kullanarak fiksasyon adımının etkinliğini değerlendirin.

Dondurulmuş dokuyu ve sabit hücreleri eksi 80 santigrat derecede saklayın. MULTI dizi barkodlaması, birden fazla numunenin birleşik dizilenmesini ve ardından hesaplamalı dekonvolüsyonunu sağlar. Menşe örneği, barkod ifadelerine göre her hücre için belirlenebilir.

Bu birleştirilmiş örnekler, hücre kümelemesi ve hücre tipi tanımlaması amacıyla tek bir veri kümesi olarak analiz edilebilir. Her hücre GEM oluşturmadan önce barkodlandığından, hücre çiftlerinin birden fazla MULTI dizi barkodu için ifade gösterme olasılığı yüksek olacaktır ve bu nedenle çiftlerin çoğunluğu kümeleme ve hücre tipi tanımlamadan önce tanımlanabilir ve kaldırılabilir. Tek hücreli ATAC dizilimi, tek hücreli RNA dizilimi ile bulunanlarla eşleşecek hücre tiplerine sahip bir veri kümesi oluşturmak için kullanılabilir.

Tek hücreli RNA dizileme gen ekspresyonu ve tek hücreli ATAC dizileme DNA erişilebilirlik bilgisinin eşleştirilmesi, gen düzenleyici ağların yeniden yapılandırılmasını sağlar. Protokolü denerken, etnol buharlaşmasının iki dakikalık zamanlamasının, sonraki elüsyon adımlarında dizi alımı için çok önemli olduğunu unutmayın. Eşleştirilmiş tek hücreli RNA-seq ve tek hücreli ATAC-seq kullanarak gen düzenleyici ağların yeniden yapılandırılması, gen aşırı ekspresyonu ve nakavt çalışmaları için hedefler üretir.

MULTI-seq bu aşamada hücre tipine özgü etkileri tanımlamak için kullanılabilir.