Name: Sendromla İlişkili Nörolojik Açıkların Aşağı Akış Modellemesi için Turner Sendromundan İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerin (45XO) Fetal Hücrelerinin Üretimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Keşfedin Turner sendromundan indüklenmiş pluripotent kök hücre üretimini. Nükleofeksiyonla epizomal plazmidleri kullanarak fetal fibroblastlardan entegrasyonsuz iPSC oluşturun ve nöronal farklılaştırma yapın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yukarıdaki araştırma için mali destek Manipal Yükseköğretim Akademisi tarafından sağlanmıştır. Hattın karakterizasyonu kısmen NCBS'deki M.M. Panicker laboratuvarında gerçekleştirildi. Karyotyping konusunda yardım için Anand Tanı Laboratuvarı'ne teşekkür ederiz.

<ol><li>Verlinsky, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell+lines+with+genetic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+BioMedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell lines with genetic disorders.</a> Reproductive BioMedicine Online. 10, 105-110 (2005).</li>
<li>Eiges, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+Study+of+Fragile+X+Syndrome+Using+Human+Embryonic+Stem+Cells+Derived+from+Preimplantation+Genetically+Diagnosed+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Developmental Study of Fragile X Syndrome Using Human Embryonic Stem Cells Derived from Preimplantation Genetically Diagnosed Embryos.</a> Cell Stem Cell. 1, 568-577 (2007).</li>
<li>Biancotti, J. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Embryonic+Stem+Cells+as+Models+for+Aneuploid+Chromosomal+Syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22STEM+CELLS%22%5BJournal%5D)">Human Embryonic Stem Cells as Models for Aneuploid Chromosomal Syndromes.</a> STEM CELLS. 28, 1530-1540 (2010).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+abnormal+early+development+with+induced+pluripotent+stem+cells+from+aneuploid+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Modeling abnormal early development with induced pluripotent stem cells from aneuploid syndromes.</a> Human Molecular Genetics. 21, 32-45 (2012).</li>
<li>Gravholt, C. H., Viuff, M. H., Brun, S., Stochholm, K., Andersen, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turner+syndrome%3A+mechanisms+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Turner syndrome: mechanisms and management.</a> Nature Reviews Endocrinology. 15, 601-614 (2019).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniparental+disomy+of+the+entire+X+chromosome+in+Turner+syndrome+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discovery%22%5BJournal%5D)">Uniparental disomy of the entire X chromosome in Turner syndrome patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell Discovery. 1, 15022(2015).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+induced+pluripotent+stem+cell+line+from+an+adult+male+with+45%2CX%2F46%2CXY+mosaicism%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Generation of an induced pluripotent stem cell line from an adult male with 45,X/46,XY mosaicism.</a> Stem Cell Research. 27, 42-45 (2018).</li>
<li>Parveen, S., Panicker, M. M., Gupta, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+induced+pluripotent+stem+cell+line+from+chorionic+villi+of+a+Turner+syndrome+spontaneous+abortion%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Generation of an induced pluripotent stem cell line from chorionic villi of a Turner syndrome spontaneous abortion.</a> Stem Cell Research. 19, (2017).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Fibroblasts+by+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Soldner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+Disease+Patient-Derived+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Free+of+Viral+Reprogramming+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Parkinson's Disease Patient-Derived Induced Pluripotent Stem Cells Free of Viral Reprogramming Factors.</a> Cell. 136, 964-977 (2009).</li>
<li>Somers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Transgene-Free+Lung+Disease-Specific+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Using+a+Single+Excisable+Lentiviral+Stem+Cell+Cassette%5BTitle%5D)+AND+%22STEM+CELLS%22%5BJournal%5D)">Generation of Transgene-Free Lung Disease-Specific Human Induced Pluripotent Stem Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette.</a> STEM CELLS. 28, 1728-1740 (2010).</li>
<li>Woltjen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+transposition+reprograms+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 458, 766-770 (2009).</li>
<li>Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Generated+Without+Viral+Integration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cells Generated Without Viral Integration.</a> Science. 322, 945-949 (2008).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Japan+Academy%2C+Series+B%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proceedings of the Japan Academy, Series B. 85, 348-362 (2009).</li>
<li>Warren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient+Reprogramming+to+Pluripotency+and+Directed+Differentiation+of+Human+Cells+with+Synthetic+Modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Free+of+Vector+and+Transgene+Sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8, 409-412 (2011).</li>
<li>Martí, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Characterization of pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 8, 223-253 (2013).</li>
<li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).</li>
<li>Ambartsumyan, G., Clark, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy+and+early+human+embryo+development%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy and early human embryo development.</a> Human Molecular Genetics. 17, 10-15 (2008).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 9, 2329-2340 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Sitogenetik olarak anormal fetal dokunun stabil hücresel modellerinin üretilmesi, kusurlu fenotipin sürekliliği için gereklidir. iPSC rotası, kusurlu özelliklerin sürekli korunması için hücre hazırlamanın en etkili yöntemidir20.
Pluripotent kök hücreler (PSC), erken bölünme embriyolarını andıran özel hücrelere kendini yenileme ve farklılaşma özelliklerini gösterir21. Bu nedenle, PSC'ler erken kürtaj yapılan fetüslerde erken moleküler, hücresel ve...

Aneuploidiler insanlarda doğum kusurlarına/konjenital malformasyonlara ve gebelik kaybına yol açar. Gebelik kayıplarından elde edilen örneklerin ~%50-%70'inde sitogenetik anormallikler görülür. Gebelikte erken kaybedilen aneuploid embriyolar, insan embriyogenezini yakından temsil eden başka modeller geliştirme ihtiyacını artıran deneysel analizler için kolayca elde edilemez. Genetik bozukluk tanısı alan hücrelerden elde edilen indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler), temsili genetik düzensizliklerive fetal gelişim 1 , 2,3,4üzerindeki sonuçları modellemek için kullanılmıştır. Bu iPSC'ler gelişmekte olan embriyonun epiblast hücrelerine benzer ve embriyo oluşumunun erken olaylarını nüksedebilir. Erken memeli embriyolarında hücre soylarının ve desenlerinin gelişim programının anlaşılmasına ve karakterizasyonuna izin verirler. Daha önce monozomi X (Turner sendromu), trizomi 8 (Warkany sendromu 2), trizomi 13 (Patau sendromu) ve kısmi trizomi 11 gibi aneuploidi sendromlarının prenatal tanı testlerinden cilt fibroblastları ve amniyositlerden elde edilen iPSC'ler; 22 (Emanuel sendromu) başarısız gelişim hakkında değerli içgörüler sağlamıştır4.
Turner sendromu (TS), kadın kısırlığı, kısa boy, endokrin ve metabolik bozukluklar, otoimmün hastalık riskinin artması ve kardiyovasküler hastalığa yatkınlık ile karakterize nadir bir durumdur5. Hayatta kalabilen tek monosomi sendromu olmasına rağmen, spontan kürtajlara neden olan gelişmekte olan embriyo için de ölümcüldür6. TS ile hayatta kalan bireyler hücrelerinde X kromozomal malzemenin değişim dereceleri ile mevcuttur. Karyotipler bir X kromozomunun (45,XO) tamamen kaybolmasından 45,XO/46,XX gibi mozaiklere kadar uzanır; 45,XO/47,XXX, halka kromozomlarının varlığı, Y kromozomal malzemenin varlığı, vb5.
Sendromun tanısı genellikle semptomatik bireylerin kanının karyotipingi ve erken aneuploidi sendromlarını tespit etmek için koryonik villi örnekleme (CVS) ile yapılır. Anöploidi sendromları spontan kürtajların ~%30'unu oluşturduğundan, spontan kürtaj üzerine gebe kalma (POC) ürününü karyotip etmek rutindir. Sitogenetik anormalliğe sahip koryonik villi ve onlardan türetilen iPSC'ler de dahil olmak üzere bu fetal hücreler, aneuploidi sendromlarını incelemek için değerli bir biyolojik malzeme kaynağı sağlar4,6. TS iPSC'ler daha önce retroviral reprogramlama yoluyla amniyositlerden4, koryonik villi fibroblastları (prenatal tanı ile elde edilir) retroviral yoluyla kurulmuştur. reprogramming6, sendai virüs reprogramming yoluyla kan mononükleer hücrelerden7 ve lentiviral yeniden programlama yoluyla TS bireylerin cilt fibroblastları4 . Laboratuvarımızın birincil odağı gelişimsel başarısızlığı anlamak olduğundan, POC'den TS iPSC'leri, özellikle de spontan bir kürtajın koryonik villi bileşenini oluşturduk8. Bu fetal dokudan izole edilen tüm hücrelerin 45XO karyotipi vardı ve aynı karyotipe sahip iPSC'ler verdi. Bu iPSC'ler, kürtaj yapılan bir fetüsten ilk oluşturulanlar olduğu ve aneuploidi ile ilgili gebelik başarısızlıklarını incelemek için değerli bir kaynak sağladıkları için benzersizdir. Bu makalede, epizomal yeniden programlama yoluyla bu benzersiz hücre kaynağından iPSC'lerin neslinin ayrıntılı bir metodolojisi sağlanmıştır.
iPSC neslinin ilk yöntemleri, yeniden programlama faktörlerini sunmak için viral transdüksiyon ve transposonlar kullandı. Hücreleri pluripotency'ye indükleme yöntemleri retroviral vektörler9, uyarılabilir lentiviral vektörler10 , 11ve transposon bazlı yöntemler12'yi entegre etmeyen adenoviral vektörler13 ve Sendai virüs bazlı vektörler14kullanılarak evrimleşmiştir. Retroviral ve lentiviral bazlı yeniden programlama, verimli olmasına rağmen, yeniden programlama faktörlerinin konak kromozomlarına entegrasyonunu içerir ve iPSC'lerde öngörülemeyen etkileri olan ekleme mutasyonlarına neden olur. Ayrıca, viral tabanlı yeniden programlama, iPSC'lerin çevirisel uygulamasını engeller. Virüslerin ve DNA transfeksiyonlarının kullanımıyla ilgili potansiyel riskleri tamamen ortadan kaldırmak için RNA tabanlı sistemler15 ve doğrudan protein iletimi16 araştırılmıştır. Ancak, bu yöntemlerin verimsiz olduğu kanıtlanmıştır.
2011 yılında Okita ve arkadaşları, shRNA ile TP53 bastırma ile artırılmış epizomal plazmidler tarafından yeniden programlama verimliliğinin arttığını bildirdi. Ayrıca hiPSC'lerin güvenliğini artırmak için cMYC'yi dönüştürmeyen LMYC (küçük hücreli akciğer karsinomu ilişkili MYC) ile değiştirdiler. Bu epizomal plazmidler 5 yeniden programlama faktörünü ifade eder: OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC ve TP53için shRNA17,18. Bu vektörler ekstra kromozomal olarak korunur ve sürekli kültür üzerine yeniden programlanan hücrelerden kaybolur, böylece çizgileri 10-15 pasaj içinde transgene-free hale getirir. Nükleofeksiyon, nükleik asitleri doğrudan konak hücrelerin çekirdeğine ulaştıran özel bir elektroporasyon şeklidir. Plazmidlerin çeşitli hücre tiplerine yeniden programlanması için etkili bir yöntemdir. Epizomal plazmidler uygun maliyetlidir ve nükleofeksiyonun yüksek maliyetlerini telafi eder. Bu yöntem, çeşitli somatik hücrelerden kararlı iPSC'ler sağlayan optimize edilmiş koşullar altında verimli ve tekrarlanabilir. Bu protokolde epizomal reprogramlama plazmidlerinin nükleofeksiyonu ile fetal dokudan izole edilen fibroblastlardan iPSC'lerin üretilmesi için yöntemi açıklıyoruz. İşte fetal koryonik villiden fibroblast izolasyonu, plazmid saflaştırma, nükleofeksiyon, kolonilerin yeniden programlama plakasından toplanması ve stabil iPSC'lerin kurulması için ayrıntılı protokoller.
Yeni oluşturulan iPSC'lerde pluripotency özelliklerinin varlığını onaylamak önemlidir. Bu, pluripotency ile ilgili faktörlerin gösterimini içerir (örneğin, alkalin fosfataz ekspresyonu, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-cadherin; genellikle immünofluoresans veya gen ekspresyon tahlilleri ile gösterilir), üç mikrop tabakasının farklılaşma potansiyellerini doğrulamak için in vitro farklılaşma testleriyle tanımlanması, kromozomal içeriği belirlemek için karyotipleme, ebeveyn hücreleriyle kimlik oluşturmak için STR yazma, eksojen genlerin kaybını doğrulama, ve teratom oluşumu ve tetraploid kompleasyonu gibi daha sıkı in vivo tahliller. Burada karyotipingin karakterizasyon protokollerini, canlı hücreler alkali fosfataz boyamayı, pluripotency ile ilgili biyobelirteçlerin immünofluoresans ile tespitini, in vitro farklılaşma tahlillerini ve eksojen gen kaybını gösterme yöntemini açıklıyoruz19.

<table><tbody><tr><td>% 0.15 tripsin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>27250018</td><td>G Bantlama</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985023</td><td>Pluripotens ve Embriyoid vücut ortamı</td></tr><tr><td>4 ', 6 diamidino-2-fenilindol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8417</td><td>İmmünositokimya</td></tr><tr><td>Aktivin A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SRP3003</td><td>Farklılaşma testleri</td></tr><tr><td>Alkalin Fosfataz Canlı Leke</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14353</td><td>AP boyama</td></tr><tr><td>AMAXA Nükleofektör II</td><td></td> Lonza-Nükleofeksiyon <td></td><td></td></tr><tr><td>AmnioMAX II tam ortam</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>11269016</td><td>Fetal koryonik villus hücre kültürlerine özgü ortam</td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>HiMedia</td><td>TC021</td><td>Plazmid saflaştırma</td></tr><tr><td>Anti Fare IgG (H + L) Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11059</td><td>İmmünositokimya</td></tr><tr><td>Anti Tavşan IgG (H + L) Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td>İmmünositokimya</td></tr><tr><td>Anti Tavşan IgG (H + L) Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A11035</td><td>İmmünositokimya</td></tr><tr><td>Antibiyotik-Antimikotik</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>15240096</td><td>Kontaminasyon kontrolü</td></tr><tr><td>Anti-E-Cadherin</td><td>BD Biyobilimleri</td><td>610181</td><td>İmmünositokimya</td></tr><tr><td>Anti-Nanog</td><td>BD Biyobilimler</td><td>560109</td><td>İmmünositokimya</td></tr><tr><td>Anti-OCT3 / 4</td><td>BD Biyolojik Bilimler</td><td>611202</td><td>İmmünositokimya</td></tr><tr><td>Anti-SOX17</td><td>BD Biyolojik Bilimler</td><td>561590</td><td>İmmünositokimya</td></tr><tr><td>Anti-SOX2</td><td>BD Biyolojik Bilimler</td><td>561469</td><td>İmmünositokimya</td></tr><tr><td>Anti-SSEA4</td><td>BD Biosciences</td><td>560073</td><td>İmmünositokimya</td></tr><tr><td>Anti-TRA 1-81</td><td>Milipor</td><td>MAB4381</td><td>İmmünositokimya</td></tr><tr><td>temel Fibroblast Büyüme Faktörü [FGF2]</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>F0291</td><td>Pluripotens ortamı</td></tr><tr><td>Kemik Morfogenetik Faktör 4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SRP3016</td><td>Farklılaşma testleri</td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3059</td><td>Bloke</td></tr><tr><td>Edici Kollajen İnsan Tip IV</td><td>BD Biosciences</td><td>354245</td><td>Farklılaşma testleri</td></tr><tr><td>Kollajenaz karışımı</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8051</td><td>Fetal koryonik villusların sindirimi</td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902</td><td>Farklılaşma testleri</td></tr><tr><td>DMEM F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320033</td><td>Farklılaşma tahlilleri</td></tr><tr><td>FastDigest EcoR1</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0274</td><td>Kısıtlama sindirimi</td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2518</td><td>Farklılaşma testleri</td></tr><tr><td>Giemsa Stain</td><td>HiMedia</td><td>S011</td><td>G Bantlama</td></tr><tr><td>Buzul Asetik Asit</td><td>HiMedia</td><td>AS001</td><td>Karyotipleme için Fiksatif</td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7528</td><td>Farklılaşma deneyleri</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Pluripotens ve Embriyoid vücut ortamı</td></tr><tr><td>Heparin sodyum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149</td><td>Farklılaşma testleri</td></tr><tr><td>İnsülin çözeltisi insan</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278</td><td>Farklılaşma testleri</td></tr><tr><td>İnsülin Transferrin Selenit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1884</td><td>Farklılaşma tahlilleri</td></tr><tr><td>KAPA HiFi PCR kiti</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KR0368</td><td>OriP, EBNA1 PCR</td></tr><tr><td>KaryoMAX Colcemid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15210040</td><td>Karyotipleme için mitotik tutuklama</td></tr><tr><td>KnockOut DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10829018</td><td>Pluripotens ve Embriyoid vücut ortamı</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replasmanı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td>Pluripotens ve Embriyoid vücut ortamı</td></tr><tr><td>Luria Bertani agar</td><td>HiMedia</td><td>M1151F</td><td>Plazmid saflaştırma</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td>Farklılaşma testleri</td></tr><tr><td>MEM Esansiyel olmayan amino asitler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td>Pluripotens ve Embriyoid vücut ortamı</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>HiMedia</td><td>MB113</td><td>Karyotipleme için fiksatif</td></tr><tr><td>Miyozin ventriküler ağır zincir &alpha;/&beta;</td><td>Millipore</td><td>MAB1552</td><td>İmmünositokimya</td></tr><tr><td>NHDF Nükleofektör Kiti</td><td>Lonza</td><td>VAPD-1001</td><td>Nükleofeksiyon</td></tr><tr><td>Paraformaldehit (PFA)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>Sabitleme hücreleri</td></tr><tr><td>pCXLE-hOCT3 / 4-shp53-F</td><td>Addgene</td><td>27077</td><td>Epizomal yeniden programlama Plazmid</td></tr><tr><td>pCXLE-hSK</td><td>Addgene</td><td>27078</td><td>Epizomal yeniden programlama Plazmid</td></tr><tr><td>pCXLE-hUL</td><td>Addgene</td><td>27080</td><td>Epizomal yeniden programlama Plazmid</td></tr><tr><td>Penisilin Streptomisin</td><td>&nbsp; Thermo Fisher Bilimsel,</td> <td>&nbsp; 15070063</td><td>Pluripotens ve Embriyoid vücut ortamı</td></tr><tr><td>Phalloidin- Tetrametilrodamin B izotiyosiyanat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1951</td><td>İmmünositokimya</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td>1 X PBS 200 mL deiyonize su içinde çözülmüş ve otoklavlama ile sterilize edilmiş 1 tablet PBS Depolama: Oda sıcaklığı. PBST- 1X PBS. içinde 20% 0,05 Tween 20 Depolama: Oda sıcaklığı.</td></tr><tr><td>Plazmid saflaştırma Kiti- Midi hazırlık</td><td>QIAGEN</td><td>12143</td><td>Plazmit saflaştırma</td></tr><tr><td>Potasyum Klorür Çözeltisi</td><td>HiMedia</td><td>MB043</td><td>Karyotipleme için hipotonik çözelti</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Kan Kiti</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>Genomik DNA izolasyonu</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875093</td><td>Hepatosit farklılaşma ortamı</td></tr><tr><td>Sodyum Sitrat</td><td>HiMedia</td><td>RM255</td> Triton X-100 <td>Karyotipleme için hipotonik çözüm</td></tr><tr><td></td><td>HiMedia</td><td>MB031</td><td>Geçirgenleştirme</td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (%0,05)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>25300054</td><td>&nbsp; Alt Kültürü; fetal koryonik villus fibroblastları</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>HiMedia</td><td>MB067</td><td>PBST ve beta'nın hazırlanması</td></tr><tr><td>; III tübülin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8578</td><td>İmmünositokimya</td></tr><tr><td>Y-27632 dihidroklorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td>Farklılaşma testleri</td></tr></tbody></table>

sendromla İlişkili nörolojik açıkların aşağı akış modellemesi için turner sendromundan İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (45xo) fetal hücrelerinin Üretimi

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome (45XO) Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndrome

Kromozomal aneuploidiler merkezi sinir sistemi malformasyonları ve fetal ölüm de dahil olmak üzere şiddetli konjenital malformasyonlara neden olur. Prenatal genetik tarama tamamen tanısaldır ve hastalık mekanizmasını aydınlatmaz. Aneuploid fetüslerden gelen hücreler kromozomal aneuploidi taşıyan değerli biyolojik malzeme olmasına rağmen, bu hücreler kısa ömürlüdür ve aşağı akış araştırma deneyleri için kullanımlarını sınırlar. İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) modellerinin üretilmesi, aneuploid özelliklerinin sürekli korunması için hücre hazırlamanın etkili bir yöntemidir. Embriyonik gelişimi anımsatan özel hücrelere kendi kendini yeniler ve ayırt ederler. Bu nedenle, iPSC'ler erken gelişim olaylarını incelemek için mükemmel araçlar olarak hizmet vermektedir. Turner sendromu (TS), tamamen veya kısmen eksik bir X kromozomu ile ilişkili nadir bir durumdur. Sendrom infertilite, kısa boy, endokrin, metabolik, otoimmün ve kardiyovasküler bozukluklar ve nöroknasitif kusurlar ile karakterizedir. Aşağıdaki protokol, fibroblastların TS (45XO) fetal dokudan izolasyonu ve kültleştirilmesini, epizomal yeniden programlanan plazmidlerin nükleofeksiyon ve ardından niteleme yoluyla entegrasyonsuz TSiPSC'lerin üretilmesini açıklamaktadır. Yeniden programlanan TSiPSC'ler başlangıçta canlı hücre alkali fosfataz boyama ve ardından pluripotency biyobelirteçler için kapsamlı problama ile tarandı. Seçilen koloniler mekanik olarak parçalandı, birkaç kez geçirildi ve daha fazla deney için kararlı kendini yenileyen hücreler kullanıldı. Hücreler pluripotency transkripsiyon faktörlerini ifade etti OCT4, NANOG, SOX2, hücre yüzey belirteçleri SSEA 4 ve TRA1-81 pluripotent kök hücrelere özgüdür. Orijinal 45XO karyotip, yeniden programlama sonrası tutuldu. TSiPSC'ler embriyoid cisimleri oluşturabildi ve endoderm, mezoderm ve ektoderm hücrelerine dönüşerek soyuna özgü biyobelirteçlere ((SRY BOX17), (MYOSIN VENTRIKÜLER AĞIR CHAINα/β), (βIII TUBULIN)) hücrelerine farklılaştı. Eksojen epizomal plazmidler kendiliğinden kaybedildi ve hücrelerde 15. Bu TSiPSC'ler Turner sendromu ile ilişkili nörokingtif açıklara neden olan kusurlu moleküler ve hücresel nörogelişim modellemek için değerli bir hücresel kaynaktır.

45XO karyotipli, kendiliğinden kürtaj yapılan bir fetüsten entegrasyonsuz iPSC'lerin üretimi Turner sendromuna (TS) özgü 45XO karyotipli FCV'den fibroblastları izole ettik ve özellikle ilişkili nörolojik açıkların (Şekil 1a&amp;b)aşağı akış modellemesi için kullanılabilecek TSiPSC'ler üretmek için epizomal yeniden programlama plazmidleri ile enfekte ettik. Transfection deneyleri için nonintegrating epizomal vektörler ve nükleofeksiyon kullandık (<strong c...

Bu protokol, epizomal plazmidlerin nükleofeksiyon ile verilmesi yoluyla fetal doku fibroblastlarından entegrasyonsuz iPSC'lerin üretilmesini ve ardından iPSC karakterizasyonu ve nöronal farklılaşma için kullanılan yöntemlerin tanımlanmasını açıklar.

Sendromla İlişkili Nörolojik Açıkların Aşağı Akış Modellemesi için Turner Sendromundan İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerin (45XO) Fetal Hücrelerinin Üretimi

Chromosomal aneuploidies cause severe congenital malformations including central nervous system malformations and fetal death. Prenatal genetic screening ...

Turner sendromu, tamamen veya kısmen eksik olan X kromozomu ile ilişkili nadir bir durumdur. Sendrom kısırlık, kısa boy, kardiyovasküler bozukluklar ve nöroknaknitif kusurlar ile karakterizedir. Bazı durumlarda fetal ölüme neden olur.Aneuploid fetüslerin somatik hücreleri biyolojik olarak değerli olmasına rağmen, kısa ömürlüdir, böylece araştırmada kullanımlarını sınırlarlar. Bu nedenle iPSC üretimi, aneuploid özelliklerinin sürekli korunması için etkili bir hücre hazırlama yöntemidir. Kendi kendini yenilerler ve erken embriyonik gelişimi anımsatan özel hücre tiplerine farklılaşabilirler.Entegre olmayan epizomal reprogramlama plazmidlerinin nükleer kurgu yoluyla teslim edilmesi, tamamen yeniden programlanmış ve kararlı iPSC'ler üretmek için verimli ve tekrarlanabilir bir yöntemdir. Bu yöntem, programlanın zor olan hücrelerde de kullanılabilir. Bu protokolde iPSC'lerin fetal materyalden aneupliod ile yenilenmesini açıklıyoruz.Toplanan fetal koryonik villiyi steril bir Petri kabına aktarın. 1X antibiyotik antimycotic çözeltisi içeren PBS ile birkaç kez yıkayın. PBS'yi pipetleme ile tamamen çıkarın.Villiye 1 ml kollajenaz karışımı ekleyin ve 10 dakika boyunca veya doku parçalanana kadar 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. İnkübasyondan sonra% 10 fetal Sığır Serumu içeren ortam ekleyerek kollajenazı nötralize edin. Petri kabının içeriğini 15 ml'lik bir tüpe aktarın.Parçalanmış villi ve serbest bırakılan hücreleri toplamak için sindirimi santrifüjlayın. Üst saltantı dikkatlice deklare edin. Plaka, T25 kültür şişesi ve AmnioMAX ortamlarında salınan hücrelerle birlikte villi parçalandı ve bir araya gelen fibroblast kültürü elde edilene kadar büyüdü.Stokları sonraki transfeksiyon ve karakterizasyon deneylerinde kullanıma hazırlamak için fibroblastları ve kültürü genişletin. Yeniden programlanan plazmidleri içeren alkali kültürlerini hazırlayın. Plazmidleri, üreticinin talimatlarına göre Midi plazmid arıtma kiti kullanarak izole edin.Mililitre başına 1 mikrogramlık son konsantrasyon elde etmek için her paleti uygun miktarda DNASE RNAse içermeyen suda yeniden askıya alın. Üreticinin talimatlarına uyarak ECoR1 kısıtlama sindirim kitini kullanarak plazmidleri doğrulayın. Koryonik villi fibroblastları deneyin.Hücreleri toplamak için nötralize edin ve santrifüjlayın. Süpernatantı dekante edin ve hücreleri 5 ml OPTI-MEM'de yeniden askıya alın. Hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve nükleofeksiyon için 1 milyon hücreyi çıkarın.Hücre paleti elde etmek için santrifüj. Amaxa NHDF Neucleofactor Kit kullanarak nükleofeksiyon gerçekleştirin. Kitte verilen 0,5 mL takviyesi ve 2,25 mL nükleofaktör çözeltisini karıştırarak neükleofactor reaktifi hazırlayın.100 mikrolitre nükleofaktör çözeltisini çıkarın ve her plazmidden 1 mikrogram ekleyin. Bu karışımdaki 1 milyon hücreyi yavaşça yeniden askıya alın. Hücre DNA süspansiyonunu cuvette'e aktarın, numunenin herhangi bir hava kabarcığı olmadan cuvette'in altını kaplamasını sağlayın.Cuvette'i kapla ve tutucuya tak. Yüksek verimlilik için D-23 nükleofactor programını seçin ve uygulayın. Cuvette'i tutucudan çıkarın ve 1 mL AmnioMAX ortam ekleyin.İçeriği, kitte verilen pipeti kullanarak, petri kabını tedavi edilen bir doku kültürüne hafifçe aktarın. Hücreleri 37 santigrat derecede nemlendirilmiş karbondioksit inkübatöründe kuluçkaya yatır. AmnioMAX ortamlarındaki hücreleri 10 gün boyunca koruyun ve ardından 20 gün boyunca pluripotency ortamına kaydırın.iPSC genişlemesi için, çekilen bir cam pipet kullanarak yeniden programlama kabında oluşan embriyonik kök hücre benzeri kolonileri manuel olarak parçalara ayırın. IPSC'leri uygun şekilde yayın ve her beş ila yedi günde bir masaj yapın. iPCS'ler pluripotency marker alkalin fosfataz için pozitifti.iPSC kolonilerini küçük parçalara ayırarak ve embriyoid vücut ortamında düşük ekli Petri kaplarına kaplayarak embriyoid cisimler oluşturun. Ektoderm farklılaşması, dördüncü gün embriyoid cisimlerinin ektoderm farklılaşma ortamında kaplanması ile indüklenmiştir. Benzer şekilde mezoderm farklılaşması, mezoderm farklılaşma ortamında sekizinci gün embriyoid cisimlerinin kaplanması ile indüklenmektedir.Endoderm farklılaşmasına neden olmak için, endoderm farklılaşma ortamında bir monolayerde kültür iPSC'leri. Fibroblastlardaki morfolojik değişiklikler yeniden programlama sırasında izlendi. Epitel hücre benzeri morfolojiyi ifade ederler ve kompakt koloniler oluştururlar.Hücreler ayrıca kültürdeki pluripotent hücrelerinin tipik bir boyuna sitoplazmik orana sahip bir yükseklik çekirdeğine sahipti. IPSC'ler 45 XO taşıyıcı tipine sahipti ve PLURIPOTENCY belirteçleri OCT4, NANOG, SOX 2, SSEA 4, TRA-1-81 ve E-CADHERIN için pozitifti. Hücreler temsili mikrop tabakası belirteçleri için boyandı.Turner Sendromu böylece nöroknatif eksiklikler geliştirir. Turner Sendromu iPSC'den elde edilen nöronlar mükemmel bir model olabilir. Bu, normal disassociative Turner Sendromu'nun yeni çizgisini anlamak için bir petri plakasında modellenmiştir.

generation-induced-pluripotent-stem-cells-from-turner-syndrome-45xo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Bu video indüklenebilir lentivirüs kullanarak bağlı pluripotent kök hücreleri üretmek için prosedürü ifade Oct4, Sox2, c-Myc ve Klf4 gösterir.

Sox-2 Zorla İfade yoluyla MEFS iPS Hücreler oluşturma, Eki 4, c-Myc ve Klf4

Stemgent Dox Đndüklenebilir Fare TF lentivirüs Set bağlı pluripotent kök (IPS) hücreleri fare embriyonik fibroblastlar (MEFS) yeniden programlamak. Burada fare reprogramming transkripsiyon faktörleri Oct4 DOX indüklenebilir ifade için protokol göstermek, Sox2, Klf4 ve c-Myc ifade ortak MES pluripotency belirteçlerinin iPS koloniler oluşturmak için.

Dört Transkripsiyon Faktör Fare Embriyonik Fibroblastlar yeniden programlanması Bağlı Pluripotent Kök Hücre Üretimi, Doksisiklin lentiviral İletim Sistemi Đndüklenebilir

Atılır insan fetal kortikal doku sinir kök hücrelerin izolasyonu ve kültürü üzerinde basit ve güvenilir bir yöntem açıklanmıştır. Bilinen insan nörolojik bozukluklar türetilen Kültürler farmakolojik etkinliğini değerlendirmek için bir platform sağlamak gibi, hücresel ve moleküler patolojik süreçleri karakterizasyonu için kullanılabilir.

Atılan İnsan Fetal Kortikal Doku Sinir Kök Hücre Üretimi

Bu protokol, kas distrofisi hastalarından idrardan türetilmiş hücrelerin izolasyonu için ayrıntılı prosedürler gerektirir; Sendai virüsü transdüksiyonu yoluyla verimli ve hızlı yeniden programlamaları.

Musküler Distrofi Hastalarda gelen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin oluşturulması: İdrar Türetilmiş Hücre Verimli Entegrasyonu-ücretsiz yeniden programlanması

Bu protokol, birçok nörolojik bozuklukta hastalık patogenezine katkıda bulunan gelişimsel yolları tanımlamak için kullanılabilecek sağlam ve replikatif bir nöral hücre popülasyonu elde etmek için nöral progenitör hücrelerin insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden nasıl ayırt edilebileceğini açıklar.

Nörolojik Hastalıklar Çalışmaları Yaratma ve Kullanma hiPSC Türetilmiş NPC A Guide

Bu çalışmada, viral olmayan bir transpozon sistemi kullanarak fare amniyotik sıvı hücrelerinden indüklenmiş pluripotent kök hücreler üretiyoruz.

Bir Transpozon Sistemi Kullanılarak Fare Amniyotik Sıvı Hücreleri pluripotent kök hücrelerin üretimi

İnsan beyni gelişiminin modellenmesi, nöral epitel dokusunun benzeri görülmemiş karmaşıklığı nedeniyle engellenmiştir. Burada, insan beyninin gelişiminin erken olaylarını tanımlamak ve mikrosefaliyi in vitro olarak modellemek için sağlam beyin organoidleri üretimi için bir yöntem açıklanmaktadır.

iPSC türetilmiş İnsan Beyin Organoids oluşturulması Erken Nörogelişimsel Bozuklukları Model

Bu iletişim kuralı birincil amniyotik sıvı ve membran Mezenkimal kök hücrelerin içine İndüklenmiş pluripotent kök hücreler tamamen kimyasal olarak tanımlanan koşullarda bir sigara entegre episomal yaklaşım kullanarak yeniden programlama açıklar. Yordamlar, ayıklama, kültür, yeniden programlama ve elde edilen İndüklenmiş pluripotent kök hücreler sıkı yöntemlerle karakterizasyonu ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Birincil amniyotik sıvı ve membran hücreler Pluripotent Xeno-Alerjik koşullarında için yeniden programlama

İnsan derisinden türetilmiş fibroblastları indüklenmiş Nöronal Progenitör Hücrelere (iNPC' ler) yeniden programlamak için bir protokol ve daha sonra indüklenmiş Astrositlere (iAs) farklılaşmalarını açıklıyoruz. Bu yöntem, büyük miktarlarda iNPC'lerin ve iA'ların hızlı ve tekrarlanabilir üretimine yol açar.

Fibroblastlardan Nöronal Progenitör Hücrelere Doğrudan Dönüşüm ve Astrositlere Farklılaşma Kullanarak Nörolojik Hastalıklar için İn vitro Modelleme

Bu protokol, DS insan iPSC'leri kullanılarak Down sendromu (DS) bozulmuş nörojenezini özetlemek için bir metodolojinin ana hatlarını çizmektedir. Protokol, Down sendromunda bozulmuş nörogenezin nedeni olarak bifazik hücre döngüsü defektini tanımladı. DS ile ilişkili anormal nörojenezin altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaları anlamak için sağlam bir platform sağlar.

In Vitro Down Sendromu Nörogenezinin İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücreler Kullanılarak Modellenmesi

Burada, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerin fonksiyonel ön beyne özgü astrositlere farklılaşmasını kolaylaştıran bir protokolü açıklıyoruz. Bu, Frajil X Sendromu gibi nörogelişimsel bozuklukların patogenezinde glial hücrelerin rolünün araştırılmasını ve diğer beyin bozukluklarının modellenmesini sağlar.

Frajil X Messenger Ribonükleoproteinden Yoksun İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Astrositlerin Üretimi ve Karakterizasyonu

Keşfedin Turner sendromundan indüklenmiş pluripotent kök hücre üretimini. Nükleofeksiyonla epizomal plazmidleri kullanarak fetal fibroblastlardan entegrasyonsuz iPSC oluşturun ve nöronal farklılaştırma yapın.

Sendromla İlişkili Nörolojik Açıkların Aşağı Akış Modellemesi için Turner Sendromundan İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerin (45XO) Fetal Hücrelerinin Üretimi (Video) | JoVE Journal

Sendromla İlişkili Nörolojik Açıkların Aşağı Akış Modellemesi için Turner Sendromundan İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerin (45XO) Fetal Hücrelerinin Üretimi

Daha fazla video keşfet