Name: FRETe duyarlı emisyona sahip canlı hücrelerdeki protein etkileşimlerinin değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: Öğrenin, canlı hücrelerde FRET verimliliğini konfokal mikroskopi ve matematiksel algoritmalarla nasıl nicelendireceğinizi. Bu yöntem, protein etkileşimlerini fizyolojik koşullarda gerçek zamanlı izlemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Stanford Üniversitesi Tıp Fakültesi Sinirbilim Görüntüleme Servisi'ne bu proje için ekipman ve alan sağladığı için teşekkür ederiz. Bu araştırma, Stanford Kanser Enstitüsü ve Jinekolojik Onkoloji Bölümü Stanford'un intramural finansmanının yanı sıra Macaristan Ulusal Araştırma, Geliştirme ve İnovasyon Ofisi'nden GINOP-2.3.2-15-2016-00026, GINOP-2.3.3-15-2016-00030, NN129371, ANN135107 tarafından desteklenmiştir.

1. Plazmid yapımı
<ol><li>eGFP-mCherry1 füzyon probunu oluşturmak için, AgeI ve BsrGI kısıtlama bölgeleri kullanılarak eklenen mCherry1 10 ile bir N1 memeli hücre ekspresyon vektörü (bkz. Malzeme Tablosu) kullanın.</li>
	<li>SalI-BamHI parçası olarak bir durdurma kodonu olmadan eGFP11'i yükseltmek için aşağıdaki oligonükleotidleri kullanın: N-terminal primer 5'-AAT TAA CAG TCG ACG ATG GTG AGC AAG GGC GAG G 3' ve C-terminal primer 5'-AAT ATA TGG ATC CCG CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC 3'.</li>
	<li>Yeşil ve kırmızı floresan proteini arasına RNPPV bağlayıcı (beş aminoasit) bağlayıcıyı tanıtmak için bu SalI-BamHI fragmanını N1 vektörünün çoklu klonlama bölgesine yerleştirin. NOT: Bu bağlayıcı, GFP-Cherry donör-alıcı çifti için yaklaşık 0.25-0.3'lük bir ortalama FRET verimliliği sağlar (Şekil 1A). Ölçülen FRET verimliliklerini ölçeklendirmek için farklı uzunluklarda sert12 ve helisel13 bağlayıcıların seçimi başka yerlerde tartışılmıştır, ancak füzyon proteini amacımız için gerekli değildir. Basitlik için ileriye dönük olarak, floresan proteinlerine 'GFP' ve 'Kiraz' adını vereceğiz.</li>
</ol>2. Hücre kültürü ve transfeksiyon
<ol><li>Arka plan floresansını azaltmak için fenol kırmızısı olmadan ortamdaki FRET deneyleri için herhangi bir hücre hattını, örneğin NRK hücrelerini kullanın, örneğin, Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's media (DMEM). Aynı nedenle, fenol kırmızısı serbest tripsin kullanımı tavsiye edilir.</li>
	<li>Hücreler% 80 birleştiğinde, hücreleri 1 mL% 0.05 tripsin-EDTA ile ayırın, bir Neubauer odası kullanarak süspansiyondaki hücre sayısını sayın ve 8 iyi odacıklı bir kapak camının kuyusu başına yaklaşık 10.000 hücre tohumlayın; Alternatif olarak, T25 şişesinde yetiştirilen bir akıcık hücre kültüründen, 2 mL'lik bir pipetten 1 damla hücre süspansiyonu veya bir T 12.5 hücreli kültür şişesinde yetiştirilen bir akıcılık kültüründen 5 mL'lik bir hücre süspansiyonundan 3 damla kullanın.</li>
	<li>Standart hücre kültürü koşullarında (37 ° C ve% 5 CO 2) floresan canlı hücre mikroskobu için # 1.0 kapak camı ile 8 kuyucuklu odalarda (0.8 cm2 / kuyu) hücreleri büyütün.</li>
	<li>Kaplamadan 24 saat sonra, GFP, Kiraz, GFP / Kiraz karışımı (1: 1 karışım, yani 0.8 μg ve 0.8 μg GFP ve Kiraz plazmid DNA'sı) ve GFP-Cherry kimera ile ticari olarak temin edilebilen uygun bir transfeksiyon ortamı ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak hücreleri transfekte edin.<ol><li>Transfeksiyon için, 45 μL DMEM ve 1.6 μg plazmid DNA'sında 5 μL transfeksiyon reaktifi kullanın. Mikrosantrifüj tüpünü hafifçe hafifçe sallayarak karıştırın.</li>
		<li>Karışımın oda sıcaklığında 15 dakikalık inkübasyonundan sonra, 8 delikli oda kızağının her bir oyuğuna 1-2 μL transfeksiyon reaktif karışımı ekleyin. Odalı kapak camını inkübatöre geri koyun.</li>
	</ol></li>
	<li>Canlı hücre görüntülemeden önce transfeksiyondan sonra 20 saat geçmesine izin verin, böylece uygun floresan protein ekspresyonuna, katlanmasına ve olgunlaşmasına, özellikle kırmızı floroforun olgunlaşmasına izin verin.</li>
</ol>3. FRET Görüntüleme
<ol><li>37 °C'de nemlendirilmiş ve ısıtılmış bir çevre odasında transfekte edilmiş hücreleri görüntüleyin. Hücre ortamını fizyolojik pH'da tamponlamak için,% 5 akışa ayarlanmış CO 2 gazı kullanın veya hücre ortamını CO2'den bağımsız hale getirmek için20 mM HEPES ekleyin.</li>
	<li>Konfokal lazer tarama mikroskobu kullanın. Sinyali optimize etmek ve çapraz konuşmayı en aza indirmek için uyarımı ve emisyonu aşağıdaki gibi ayarlayın.<ol><li>GFP'yi heyecanlandırmak için argon iyon lazerinin 488 nm çizgisini ve Cherry'yi heyecanlandırmak için 561 nm diyot pompalı katı hal lazerini (veya mevcut lazer hatlarına bağlı olarak 543 nm Helyum Neon lazeri) kullanın.</li>
		<li>Ticari bir konfokal mikroskop yazılımında aşağıdakileri ayarlayın. Dichroic aynasını açılır menüyü kullanarak düğme tıklamasıyla 488 / 561 olarak ayarlayın. Kanal 1'de 505 - 530 nm (veya 505 - 550 nm) emisyon bandından ve kanal 2'de uzun geçirgen filtreli &gt;585 nm ile uyarma için 488 nm lazer ışığı kullanarak floresan toplayın ve 585 nm (dalga boylarında tip) uzun geçiş filtresi ile kanal 3&gt;'te uyarma için 561 nm lazer ışığını kullanın. Raman-saçılımını dışlama avantajına sahip 590 - 650 nm veya benzeri bant geçiş filtreleri de kullanılabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>İki lazerle sırayla heyecanlanın ve görüntüleme modunu her satırdan sonra Değiştir olarak ayarlayın, böylece 512 x 512 piksellik görüntünün uyarılması her satırdan sonra değişir (ve görüntüleri farklı uyarımlarla kaydederken etiketli proteinlerin difüzyonu nedeniyle FRET algılama yeteneğini ortadan kaldıracak her kareden sonra değil; düğme tıklaması).</li>
	<li>Önemli fotobeyazlatma olup olmadığını algılamak ve potansiyel olarak lazer gücünü azaltmak için düğme tıklamalarıyla üç görüntüden oluşan mini bir dizi ayarlayın. %1'den az fotobeyazlatma en uygunudur. Yüksek lazer yoğunluğu ayrıca görünür FRET verimliliğini azaltan emilim doygunluğuna yol açabilir14. Lazer gücü, objektif lenste ölçülen 10-20 μW'a kadar kullanımı güvenlidir.</li>
	<li>İlk olarak, GFP-Cherry füzyon yapısını ifade eden görüntü hücreleri. Konfokal bir görüntüde piksel başına zamana entegre lazer yoğunluğunu, yani pikselin mikrosaniye cinsinden bekleme süresini, akusto-optik ayarlanabilir filtre (AOTF) iletimini yüzde olarak ve yakınlaştırmayı tanımlayan parametreleri ayarlayın.<ol><li>63x yağ hedefi kullanan görüntü hücreleri ve 3x olarak ayarlanmış Yakınlaştırma . Bu, görüntü hücrelerine bütünüyle yeterli büyütme ve çözünürlük sağlar. 70-80 nm piksel boyutunu hedefleyin.</li>
		<li>488 nm ve 561 nm lazer için Pixel bekleme süresini 2-4 μs ve AOTF iletimine ayarlayın, böylece görüntüler ağartma olmadan iyi bir sinyal-gürültü oranına sahip olur ve floresan yoğunluğu doygunluğunu gösteren pikseller olmaz. 488 ve 561'in lazer gücünü, kanal 1 ve kanal 3'teki sinyal seviyeleri benzer olacak şekilde ayarlamak avantajlıdır.</li>
		<li>Fotoçarpan (ortalama modu) kazancını 600-800 olarak ayarlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Bu ayarlarla birlikte GFP-Cherry füzyon proteinini eksprese eden 15-20 hücrenin görüntüsü. 15-20 hücre, mikroskobik kurulumun stabilitesini sağlamaya yardımcı olmak için FRET ölçüm oturumunun toplam süresini birkaç saatle sınırlı tutarken iyi istatistikler sağlar.</li>
	<li>GFP, Cherry, GFP ve Cherry'yi eksprese eden aynı ayar hücrelerine sahip görüntü ve transfekte olmayan hücreler. Sırasıyla yeşil kanaldaki veya kırmızı kanaldaki eksprese edici hücreleri arayın.</li>
	<li>Daha sonra, görüntü 15-20 hücre, sırasıyla GFP ve Cherry ile birleştiğinde, ilgilenilen proteinleri birlikte ifade eder. Eksprese edici hücreleri aramak, floresan proteinleri ağartmamak için hücrelerin uzun süre maruz kalmasını önleyin. Kiraz, GFP'den daha düşük bir fotostabiliteye sahiptir ve alıcı olan Cherry'yi ağartmak, FRET analizini tehlikeye atar. NOT: GFP ve Cherry'nin absorpsiyonu ve emisyon spektrumları Ek Şekil 1'de gösterilmiştir. 5-6 saat ölçüm yaptıktan sonra, kurulumun stabil kaldığını ve GFP-Cherry füzyon proteininin FRET verimliliklerinin bir görüntüleme seansı sırasında önemli ölçüde değişmediğini belgelemek için görüntüleme seansının sonunda GFP-Cherry kimerasını eksprese eden birkaç hücrenin görüntülenmesinin tekrarlanması önerilir.</li>
</ol>4. Donör söndürme ve hassaslaştırılmış emisyon kullanarak mutlak FRET verimliliklerini tespit etmek için görüntü analizi
NOT: Burada, ekli elektronik tablonun (Ek Dosya 2) kullanımıyla FRET verimliliğinin nasıl belirleneceğine ilişkin pratik bir adım adım kılavuz sağlanmaktadır. Sunulan denklemlerin teorisi ve türetilmesi önceki yayınlarda ayrıntılı olarak bulunabilir 4,15,16,17. Açıklanan ayarlarla, aşağıdaki floresan yoğunlukları toplanır.
<ol><li>Kanal 1'de, donör kanalında, 488-nm uyarma ve 505-530 nm emisyon bandı ile donör sinyali I1'i ölçün. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq02.jpg"> burada ID, bir alıcının yokluğunda ölçülecek olan kanal 1'deki söndürülmemiş donör sinyalidir, ortalama FRET verimliliğidir ve B1, kanal 1'deki ortalama arka plan sinyalidir.</li>
	<li>Alıcı sinyal I 3'ü, alıcı kanal olan kanal 3'te, 561 nm uyarma ve &gt;585 nm'de emisyon ile ölçün. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq03.jpg"> burada IA alıcı sinyaldir ve B3 kanal 3'teki arka plandır.</li>
	<li>FRET sinyalini kanal 2'de, transfer kanalında, 488 nm uyarma ve &gt;585 nm'de emisyon ile ölçün. <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq04.jpg"> Burada, kanal 2'deki sinyal dört farklı bileşenin toplamıdır: (i) I D (1 - E) S 1, söndürülmüş donör sinyalinden &gt;585 algılama kanalına (çapraz konuşma faktörü S 1 ile) spektral dökülmedir, (ii) IA S 2, 488 nm ışık tarafından doğrudan uyarılmadan gelen alıcı sinyaldir (çapraz konuşma faktörü S2 ile), (iii) IDEα, alıcının FRET tarafından uyarılmış donör molekülünden duyarlılaştırılmış emisyonudur (α 4.8. - 4.10'da daha ayrıntılı olarak açıklanacaktır.) ve (iv) B2 arka plan sinyalidir.</li>
	<li>Transfekte edilmemiş veya alaycı transfekte edilmiş hücrelerde kanal 1, 2, 3'teki ortalama arka plan yoğunluklarını ölçün; ya da ihmal edilebilir bir farkla iyidir. Tüm hücre ölçümleri için, ilgi alanlarını tanımlamak ve otofloresansı artmış perinükleer veziküllerden kaçınmak için serbest el aletini kullanın. Bu perinükleer veziküllerden önemli otofloresanlardan kaçınmak önemlidir.<ol><li>Ölçümleri, sağlanan elektronik tablonun X, Y ve Z sütunlarına girin. 3 kanaldaki ortalama arka plan yoğunlukları excel elektronik tablosunun A2, B2 ve C2'sine girilir (Ek Dosya 2).</li>
	</ol></li>
	<li>Yalnızca GFP veya Cherry'yi eksprese eden hücrelerin 1, 2, 3 kanallarındaki ortalama yoğunlukları ölçün ve ölçümleri C, D, E ve N, O, P sütunlarına girin.</li>
	<li>E'yi, FRET verimliliğini hesaplamak için, çapraz konuşma faktörleri S 1 ve S 2'yi belirleyin. Spektral çapraz konuşma faktörü S1, sadece GFP'yi eksprese eden hücrelerden hesaplanır. <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq6v5.png"> sütun I. Excel elektronik tablosundaki D2 hücresine S1 için ortalama değeri girin.</li>
	<li>Sadece Cherry'yi eksprese eden hücrelerden spektral çapraz konuşma faktörü S2'yi hesaplayın <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq07.jpg"> T sütununda. Excel elektronik tablosundaki E2 hücresine S 2 ortalamasını girin.</li>
	<li>α faktörünün, kanal 1'deki herhangi bir sayıda uyarılmış GFP molekülünden gelen sinyali, kanal 2'deki eşit sayıda uyarılmış Kiraz molekülünün sinyaliyle ilişkilendirdiğinden ve <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq08.jpg">   <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq13v5.png"> burada Q A ve QD, Cherry ve GFP'nin floresan kuantum verimleridir; ηA ve ηD, sırasıyla kanal 2 ve 1'deki alıcı ve donör floresansının tespit verimliliklerini gösterir. NOT: α faktörü, GFP ve Cherry'nin bilinen mutlak miktarlarını ifade eden iki numuneden belirlenebilir. Bununla birlikte, bir hücrede ifade edilen GFP ve Cherry'nin tam miktarını bilmek imkansızdır. Bu nedenle, GFP-Cherry füzyon proteinini eksprese eden hücreleri kullanarak faktörü hesapladık. Burada, mutlak miktar hala bilinmemekle birlikte, donör ve alıcı moleküllerin oranının bir olduğu bilinmektedir.</li>
	<li>GFP-Cherry füzyon proteinini eksprese eden hücrelerin 1, 2, 3 kanallarındaki ortalama yoğunlukları ölçün ve ölçümleri AE, AF, AG sütunlarına girin. Arka plan yoğunlukları çıkarılır (AH, AI, AJ'de).</li>
	<li>GFP-Cherry füzyon proteininin kanal 1, 2 ve 3'teki floresan yoğunluklarından α faktörünü (AJ sütunu) aşağıdaki gibi hesaplayın: <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq10v6.png"></li>
	<li>Sırasıyla kanal 1 (I 1 - B 1), 2 (I 2 - B2) ve 3 (I 3 - B3) olarak ölçülen arka plan düzeltmeli yoğunluklar, GFP-Cherry kimera kullanılarak ölçülür. Spektral çapraz konuşma faktörü S1, sadece GFP'yi eksprese eden hücreler kullanılarak belirlendi (bkz. 4.7.). εD ve ε A, donör GFP'nin ve alıcı Kiraz'ın 488 nm'deki yok olma katsayılarıdır ve literatürden (ε GFP = 53.000 M-1 cm-1)18 ve Kirazın emilim eğrisi (εKiraz ≈ 5560 M-1 cm1) olarak belirlenebilir. Oran<img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq11.jpg">, excel elektronik tablosunun G2 hücresine girilmiştir. J2'ye α faktörün ortalama değerini girin.</li>
	<li>FRET verimliliğinin hesaplanması için belirlenen α faktörü olan E'yi aşağıdaki gibi kullanın (sütun AK): <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq12v6.png"></li>
	<li>Alternatif olarak, negatif kontroller için FRET verimliliğini, E'yi, yani GFP-Cherry füzyon proteini ölçümleri altında AD, AE ve AF sütunundaki excel sayfasındaki kanal 1, 2 ve 3'ün ölçümlerini ekleyerek GFP ve Cherry'nin birlikte ekspresyonunu ve GFP'nin tek başına ekspresyonunu belirleyin. GFP ve Cherry etiketli proteinler arasındaki FRET verimliliklerini aynı şekilde belirleyin.</li>
	<li>Söndürülmemiş donör yoğunluğunu, I D'yi (I 1 - B 1)/(1 - E) ve alıcı yoğunluğunu IA = I3 - B3 olarak belirleyin; bu değerler, etiketlenmiş proteinlerin ekspresyon seviyeleri ile orantılıdır.</li>
	<li>GFP-Cherry füzyon proteininin düzeltilmiş alıcı-donör yoğunluk oranını (Q) aşağıdaki gibi belirleyin (kolon AL): <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq13v5.png"></li>
	<li>Diğer ko-transfekte hücreler için, alıcı-donör moleküler oranını N A / ND'yi aşağıdaki gibi hesaplayın: <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/62241/62241eq14.jpg"> NOT: N A / N D oranını belirlemenin ve ortalama hücresel FRET verimliliği E'ye karşı N A / N D'yi çizmenin mantığı, bir donör molekülün enerjiyi birden fazla alıcıya aktarabilmesi, bir alıcı molekülün ise belirli bir zamanda yalnızca bir donörden enerji alabilmesidir. Etkileşimin stokiyometrisi nedeniyle sadece bir alıcı bir donörle etkileşime girebilse bile, alıcı konsantrasyonundaki bir artışın, kitle eylem yasası nedeniyle alıcı ile kompleks halindeki donörlerin fraksiyonunu arttırması beklenir. Bu nedenle, sabit (veya dar bir donör aralığı) ifadesi için, FRET verimliliği artan NA / ND ile artmalıdır. Bununla birlikte, GFP ve Kiraz'ın birlikte ekspresyonu için FRET verimliliği E ve N A / N D'yi çizerken, yani negatif prob, N A / ND'deki bir artış, FRET verimliliğinde bir artışa neden olmamalıdır (en azından, alıcı boyaların donör boyalara yakınlığı nedeniyle rastgele FRET'nin meydana gelmediği yeterince düşük alıcı konsantrasyonlarında).</li>
</ol>

<ol><li>Förster, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zwischenmolekulare+Energiewanderung+und+Fluoreszenz%5BTitle%5D)+AND+%22Annal+der+Physik%22%5BJournal%5D)">Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz.</a> Annal der Physik. 437, 55-75 (1948).</li>
<li>Jovin, T. M., Arndt-Jovin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminescence+digital+imaging+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biophysical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Luminescence digital imaging microscopy.</a> Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 18, 271-308 (1989).</li>
<li>Mekler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photochemical+technique+to+enhance+sensitivity+of+detection+of+fluorescence+resonance+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">A photochemical technique to enhance sensitivity of detection of fluorescence resonance energy transfer.</a> Photochemistry and Photobiology. 59, 615-620 (1994).</li>
<li>Vamosi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation+of+the+c-Fos%2Fc-Jun+complex+in+vivo%3A+A+combined+FRET%2C+FCCS%2C+and+MD-modeling+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Conformation of the c-Fos/c-Jun complex in vivo: A combined FRET, FCCS, and MD-modeling study.</a> Biophysical Journal. 94 (7), 2859-2868 (2008).</li>
<li>Renz, M., Daniels, B. R., Vamosi, G., Arias, I. M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+the+asialoglycoprotein+receptor+deciphered+by+ensemble+FRET+imaging+and+single-molecule+counting+PALM+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Plasticity of the asialoglycoprotein receptor deciphered by ensemble FRET imaging and single-molecule counting PALM imaging.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 109 (44), 2989-2997 (2012).</li>
<li>van Rheenen, J., Langeslag, M., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correcting+confocal+acquisition+to+optimize+imaging+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+by+sensitized+emission%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Correcting confocal acquisition to optimize imaging of fluorescence resonance energy transfer by sensitized emission.</a> Biophysical Journal. 86 (4), 2517-2529 (2004).</li>
<li>Muller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Forster+resonance+energy+transfer+by+monitoring+sensitized+emission+in+living+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Sciences%22%5BJournal%5D)">Quantification of Forster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells.</a> Frontiers in Plant Sciences. 4, 413(2013).</li>
<li>Gates, E. M., LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Hoffman, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+quality%2C+reproducibility%2C+and+usability+of+FRET-based+tension+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Improving quality, reproducibility, and usability of FRET-based tension sensors.</a> Cytometry Part A. 95 (2), 201-213 (2019).</li>
<li>Menaesse, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+instrument+calibration+for+wide-field+fluorescence+resonance+energy+transfer+%28FRET%29+measured+by+the+sensitized+emission+method%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Simplified instrument calibration for wide-field fluorescence resonance energy transfer (FRET) measured by the sensitized emission method.</a> Cytometry Part A. , 24194(2020).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).</li>
<li>Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FACS-optimized+mutants+of+the+green+fluorescent+protein+%28GFP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP).</a> Gene. 173, 1 Spec No 33-38 (1996).</li>
<li>Nagy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+calibration+method+for+flow+cytometric+fluorescence+resonance+energy+transfer+measurements+between+visible+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Novel calibration method for flow cytometric fluorescence resonance energy transfer measurements between visible fluorescent proteins.</a> Cytometry Part A. 67 (2), 86-96 (2005).</li>
<li>Arai, R., Ueda, H., Kitayama, A., Kamiya, N., Nagamune, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+the+linkers+which+effectively+separate+domains+of+a+bifunctional+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Engineering%22%5BJournal%5D)">Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein.</a> Protein Engineering. 14 (8), 529-532 (2001).</li>
<li>Szendi-Szatmari, T., Szabo, A., Szollosi, J., Nagy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reducing+the+detrimental+effects+of+saturation+phenomena+in+FRET+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reducing the detrimental effects of saturation phenomena in FRET microscopy.</a> Analytical Chemistry. 91 (9), 6378-6382 (2019).</li>
<li>Tron, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+measurement+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+on+cell+surfaces.+Quantitative+evaluation+of+the+transfer+efficiency+on+a+cell-by-cell+basis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric measurement of fluorescence resonance energy transfer on cell surfaces. Quantitative evaluation of the transfer efficiency on a cell-by-cell basis.</a> Biophysical Journal. 45 (5), 939-946 (1984).</li>
<li>Sebestyen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+wavelength+fluorophores+and+cell-by-cell+correction+for+autofluorescence+significantly+improves+the+accuracy+of+flow+cytometric+energy+transfer+measurements+on+a+dual-laser+benchtop+flow+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Long wavelength fluorophores and cell-by-cell correction for autofluorescence significantly improves the accuracy of flow cytometric energy transfer measurements on a dual-laser benchtop flow cytometer.</a> Cytometry. 48 (3), 124-135 (2002).</li>
<li>Szaloki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+FRET+analysis+of+protein-protein+interactions+by+slide-based+imaging+laser+scanning+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">High throughput FRET analysis of protein-protein interactions by slide-based imaging laser scanning cytometry.</a> Cytometry Part A. 83 (9), 818-829 (2013).</li>
<li>McRae, S. R., Brown, C. L., Bushell, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+purification+of+EGFP%2C+EYFP%2C+and+ECFP+with+high+yield+and+purity%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Rapid purification of EGFP, EYFP, and ECFP with high yield and purity.</a> Protein Expression and Purification. 41 (1), 121-127 (2005).</li>
<li>Kremers, G. J., Goedhart, J., van Munster, E. B., Gadella, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyan+and+yellow+super+fluorescent+proteins+with+improved+brightness%2C+protein+folding%2C+and+FRET+Forster+radius%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Cyan and yellow super fluorescent proteins with improved brightness, protein folding, and FRET Forster radius.</a> Biochemistry. 45 (21), 6570-6580 (2006).</li>
<li>Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Guide+to+Fluorescent+Protein+FRET+Pairs%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs.</a> Sensors (Basel). 16 (9), (2016).</li>
<li>Scott, B. L., Hoppe, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+fluorescent+protein+trios+for+3-Way+FRET+imaging+of+protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Optimizing fluorescent protein trios for 3-Way FRET imaging of protein interactions in living cells.</a> Science Reports. 5, 10270(2015).</li>
<li>Chen, Y. C., Spring, B. Q., Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+lifetime+imaging+comes+of+age+how+to+do+it+and+how+to+interpret+it%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fluorescence lifetime imaging comes of age how to do it and how to interpret it.</a> Methods Molecular Biology. 875, 1-22 (2012).</li>
<li>King, C., Sarabipour, S., Byrne, P., Leahy, D. J., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FRET+signatures+of+noninteracting+proteins+in+membranes%3A+Simulations+and+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">The FRET signatures of noninteracting proteins in membranes: Simulations and experiments.</a> Biophysical Journal. 106 (6), 1309-1317 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Sunulan protokol, alıcının duyarlılaştırılmış emisyonunun tespitini ve donör molekülün konfokal mikroskopi ile söndürülmesini kullanarak FRET'yi ölçmek için genetik olarak eşleşmiş bire bir floresan protein kalibrasyon probunun kullanımını detaylandırmaktadır. Bu yöntem, farklı hücre altı bölmelerde canlı hücrenin fizyolojik bağlamındaki protein etkileşimlerini değerlendirmek için uygulanabilir. Uzamsal çözünürlük, bir görüntünün her pikselindeki FRET verimliliklerini hesaplamak için sunulan algoritma uygulanarak daha da...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated from:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine
to:
Gy&#246;rgy V&#225;mosi1 
Sarah Miller2 
Molika Sinha2 
Maria Kristha Fernandez2 
Gabor Mocs&#225;r1 
Malte Renz2 
1Department of Biophysics and Cell Biology, Faculty of Medicine, University of Debrecen 
2Gynecologic Oncology Division, Stanford University School of Medicine

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62241">Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

Förster Rezonans Enerji Transferi'nin (FRET) mikroskopi tabanlı analizi, canlı hücrelerdeki proteinler arasındaki etkileşimlerin değerlendirilmesine izin verir. Etkileşimin hücrenin neresinde ve hangi hücre altı bölmede gerçekleştiği ve bu etkileşimin zaman içinde değişip değişmediği hakkında bilgi de dahil olmak üzere mekansal ve zamansal bilgi sağlar.
Theodor Förster, 1948'de FRET'in teorik temelini attı1. FRET, uyarılmış bir donörden bir alıcı moleküle radyasyonsuz bir enerji transferidir ve moleküllerin mesafesine ve geçiş dipollerinin göreceli oryantasyonuna ve ayrıca donör emisyonu ile alıcı absorpsiyon spektrumları arasındaki örtüşmeye bağlıdır. Enerji transfer hızı, donör-alıcı mesafesinin altıncı gücü ile ters orantılıdır. Böylece, FRET 1-10 nm aralığında moleküler yakınlığı ölçmek için kullanılabilir.
FRET, donör molekülün diğer uyarım giderme işlemleriyle rekabet eder ve alıcının donör söndürme ve hassaslaştırılmış emisyonu ile sonuçlanır. Donör söndürme, yayılan donör fotonlarının sayısının azaltılmasıdır, hassaslaştırılmış emisyon ise yayılan alıcı fotonlarda bir artıştır. Birçok mikroskobik FRET analizi, alıcı fotobeyazlatma 2, donör fotobeyazlatma2 veya alıcı3'ün FRET-duyarlılaştırılmış fotobeyazlatma dahil olmak üzere floresan yoğunluğu ölçümlerini kullanır.
Burada, genellikle oranmetrik FRET olarak adlandırılan bir yöntem olan donör söndürme ve alıcı duyarlılaştırılmış emisyon 4,5 kullanarak FRET'yi ölçmek için adım adım deneysel bir protokol ve matematiksel algoritma sunulmaktadır. Hassaslaştırılmış emisyonun nasıl yaklaşacağına dair birçok protokol yayınlanmıştır, çok azı mutlak FRET verimliliğiniölçmüştür 6,7,8,9. Canlı hücredeki FRET verimliliklerinin nicelleştirilmesi, (i) floresan proteinlerin çapraz konuşmasının (spektral dökülme veya kanama) ve ayrıca (ii) mikroskobik kurulumun tespit verimliliğinin belirlenmesini gerektirir. Çapraz konuşma, floroforlardan sadece birini eksprese eden görüntüleme hücreleri ile değerlendirilebilirken, donör ve alıcı floresansının göreceli tespit etkinliğinin değerlendirilmesi daha karmaşıktır. En azından ölçülen sinyallere yol açan donör ve alıcı molekül sayısının oranının bilinmesini gerektirir. Bununla birlikte, canlı hücrelerde eksprese edilen floroforların sayısı hücreden hücreye değişir ve bilinmemektedir. Sözde α faktörü, tek bir uyarılmış donör ve alıcı molekülden gelen göreceli sinyal güçlerini karakterize eder. Faktör bilgisi, floresan proteinlerle canlı hücre görüntülemesi sırasında karşılaşılan değişken alıcı-donör molekül oranlarına sahip örneklerde kantitatif oranmetrik FRET ölçümleri için bir ön koşuldur. Kalibrasyon probu olarak 1'e 1 donör-alıcı füzyon proteini kullanmak, α faktörünün belirlenmesine izin verir ve ayrıca pozitif bir kontrol görevi görür. Bu genetik olarak bağlanmış prob, hücreler tarafından bilinmeyen toplam miktarlarda, ancak bire bir sabit ve bilinen göreceli bir miktarda eksprese edilir. Aşağıdaki protokol, 1'e 1 probun nasıl oluşturulacağını ve FRET verimliliğinin ölçülmesi için nasıl kullanılacağını ortaya koymaktadır. Tüm formülleri içeren bir elektronik tablo ekte bulunabilir ve okuyucular tarafından aşağıda belirtildiği gibi ilgili sütunlara kendi ölçümlerini girmek için kullanılabilir.
Protokol GFP-Cherry donör / alıcı çiftini kullanırken, sunulan yaklaşım başka herhangi bir FRET çifti ile gerçekleştirilebilir. Ek Dosya 1, camgöbeği-sarı çiftleri hakkında ayrıntılı bilgi sağlar.

<table><tbody><tr><td>Fenol kırmızısı içermeyen% 0,5 Tripsin-EDTA (10x)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Clontech mCherry N1 vektör</td><td>Addgene</td><td>3553</td><td></td></tr><tr><td>fenol kırmızısı içermeyen DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11054020</td><td></td></tr><tr><td>Fugene 6</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>LabTek 8 kuyulu odalar #1.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12565470</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific 25030081</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fret'e duyarlı emisyona sahip canlı hücrelerdeki protein etkileşimlerinin değerlendirilmesi

Assessing Protein Interactions in Live-Cells with FRET-Sensitized Emission

Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET), uyarılmış bir donörden bir alıcı moleküle radyasyonsuz enerji transferidir ve moleküllerin mesafesine ve oryantasyonuna ve ayrıca donör emisyonu ile alıcı absorpsiyon spektrumları arasındaki örtüşme derecesine bağlıdır. FRET, canlı hücredeki proteinlerin zaman içinde ve farklı hücre altı bölmelerdeki etkileşimini incelemeye izin verir. Literatürde mikroskopi kullanarak FRET ölçümü için farklı yoğunluk tabanlı algoritmalar tanımlanmıştır. Burada, hem alıcının duyarlılaştırılmış emisyonunu hem de donör molekülün söndürülmesini ölçmeye dayanarak FRET verimliliğini ölçmek için bir protokol ve bir algoritma sağlanmaktadır. Canlı hücredeki oranmetrik FRET'nin nicelleştirilmesi, sadece floresan proteinlerinin çapraz konuşmasının (spektral dökülme veya kanama) belirlenmesini değil, aynı zamanda mikroskobik kurulumun tespit verimliliğini de gerektirir. Burada sağlanan protokol, bu kritik parametrelerin nasıl değerlendirileceğini ayrıntılarıyla açıklamaktadır.

Şekil 1, sırasıyla donör kanal, kanal 1 (488, 505-530 nm), transfer kanalı, kanal 2 (488, &gt;585 nm) ve alıcı kanal, kanal 3'te (561, &gt;585 nm) elde edilen görüntüleri göstermektedir. Sadece GFP'yi, sadece Cherry'yi, GFP ve Cherry'yi birlikte eksprese eden ve GFP-Cherry füzyon proteinini eksprese eden hücrelerin temsili görüntüleri. GFP-Cherry füzyon proteinini eksprese eden NRK hücrelerinde (pozitif kontrol, Şekil 2A) ve GFP-Cherry'yi (negatif kontrol, <s...

İki florofor molekülü arasındaki Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET), canlı hücredeki protein etkileşimlerini incelemek için kullanılabilir. Burada, alıcı ve konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak donör molekülünün söndürülmesi ile alıcının duyarlılaştırılmış emisyonunu tespit ederek canlı hücrelerde FRET'nin nasıl ölçüleceğine dair bir protokol sağlanmaktadır.

FRET'e duyarlı emisyona sahip canlı hücrelerdeki protein etkileşimlerinin değerlendirilmesi

F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) is the radiationless transfer of energy from an excited donor to an acceptor molecule and depends upon the ...

Bu protokol, donör söndürme ve alıcı duyarlılaştırılmış emisyon kullanarak FRET'yi ölçmek için adım adım deneysel bir süreç ve matematiksel algoritmayı açıklar. Canlı hücredeki FRET verimliliklerinin miktarının belirlenmesi, floresan proteinlerinin çapraz etkileşiminin ve mikroskobik kurulumdaki floroforların göreceli emisyon ve algılama verimliliklerinin belirlenmesini gerektirir. Crosstalk, sadece bir florofor eksprese eden görüntüleme hücreleri ile değerlendirilebilir.Bir donörün veya bir alıcı molekülün tespit verimliliğinin değerlendirilmesi, ölçüm sinyaline yol açan donör ve alıcı moleküllerin sayısının oranının bilinmesini gerektirir. Canlı hücrelerde eksprese edilen floroforların sayısı hücreden hücreye değişir ve bilinmemektedir. Bu yöntemde kullanılan kalibrasyon probu, bire bir donör-alıcı füzyon proteini, donör ve alıcı moleküllerin göreceli tespit verimliliğini belirlemeyi mümkün kılar.Başlamak için, EGFP mCherry 1 füzyon probunu üretmek için mCherry 1 ile bir N1 memeli hücre ekspresyon vektörü kullanın. Bir hücre bir BAM h1 parçası olarak bir durdurma kodonu olmadan EGFP'yi yükseltmek için oligonükleotidler tasarlayın. Yeşil ve kırmızı floresan protein arasındaki beş amino asit bağlayıcısı, GFP kiraz donör-alıcı çifti için 0.25 ila 0.3 arasında ortalama bir FRET eksikliği vermelidir.Arka plan floresansını azaltmak için fenol kırmızısı olmadan herhangi bir hücre çizgisi ve ortam kullanın. Hücreler% 80 birleştiğinde, bunları bir mililitre% 0.05 tripsin EDTA ile ayırın ve beş mililitrelik bir hücre süspansiyonundan üç damla ekleyerek sekiz delikli bir plakanın her bir kuyucuğuna yaklaşık 10.000 hücre tohumlayın. Kaplamadan 24 saat sonra, uygun bir transfeksiyon ortamı kullanarak hücreleri transfekte edin.Uygun floresan protein ekspresyonuna, katlanmaya ve olgunlaşmaya izin vermek için canlı hücre görüntülemeden önce hücreleri 20 saat boyunca inkübe edin. Nemlendirilmiş ve ısıtılmış bir çevre odasındaki hücreleri, konfokal tarama mikroskobu ile 37 santigrat derecede görüntüleyin. Hücre ortamını fizyolojik pH'ta tamponlamak için, hücre ortamını karbondioksitten bağımsız hale getirmek için 20 milimolar HEPES ekleyin.Ardından slaytı mikroskopa monte edin. GFP'yi heyecanlandırmak için argon iyon lazerinin 488 nanometre çizgisini ve kirazı heyecanlandırmak için 561 nanometre diyot lazerini kullanın. 488 nanometre lazeri, 505 ila 530 nanometrelik bir emisyon bandı aracılığıyla birinci kanalda ve 585 nanometrenin üzerinde uzun geçiş filtresiyle ikinci kanalda uyarma için ayarlayın.585 nanometrenin üzerinde uzun geçiş filtresiyle üçüncü kanalda uyarma için 561 nanometre lazeri kullanın. İki lazeri sırayla uyarın ve görüntüleme modunu her satırdan sonra değişecek şekilde ayarlayın, böylece 512 x 512 piksel görüntünün uyarılması her satırdan sonra değişir. Önemli fotobeyazlatma meydana gelip gelmediğini tespit etmek ve gerekirse lazer gücünü azaltmak için üç görüntüden oluşan mini bir zaman serisi ayarlayın.İlk olarak, GFP kiraz füzyon yapısını ifade eden görüntü hücreleri. Konfokal görüntüde piksel başına zamana entegre lazer yoğunluğunu tanımlayan parametreleri ayarlayın. 63X yağ hedefi kullanın ve bir hücreyi tamamını yeterli büyütme ve çözünürlükle görüntülemek için 3X'e ayarlayın.70 ila 80 nanometrelik bir piksel boyutunu hedefleyin. Piksel bekleme süresini iki ila dört mikrosaniyeye ve 488 nanometre ve 561 nanometre lazer için AOTF iletimine ayarlayın, böylece görüntüler herhangi bir ağartma olmadan iyi bir sinyal-gürültü oranı gösterir ve floresan yoğunluğu doygunluğunu gösteren piksel yoktur. 488 ve 561'in lazer gücünü, birinci ve üçüncü kanaldaki sinyal seviyeleri benzer olacak şekilde ayarlayın.Fotoğraf çarpanı kazancını 600 ila 800 olarak ayarlayın. Resim 15 ila 20 GFP kiraz füzyon proteinini eksprese eden hücreler, GFP, kiraz, GFP ve kirazı eksprese eden hücreler ve transekte olmayan hücreler. Daha sonra, ilgilenilen proteinleri birlikte ifade eden görüntü hücreleri, sırasıyla GFP ve kiraz ile birleşti.FRET'i hesaplamak için, birinci kanaldaki donör sinyalini, 488 nanometre uyarımlı donör kanalını ve 505 ila 530 nanometrelik bir emisyon bandını ölçün. Daha sonra alıcı sinyalini üçüncü kanalda, alıcı kanalda 561 nanometre uyarım ve 585 nanometrenin üzerinde emisyon ile ölçün. Son olarak, FRET sinyalini ikinci kanalda, 488 nanometre uyarım ve 585 nanometrenin üzerinde emisyon ile transfer kanalında ölçün.İkinci kanaldaki sinyal dört farklı bileşenin toplamıdır: söndürülmüş donör sinyalinden çapraz konuşma faktörü S1 ile 585'in üzerindeki algılama kanalına spektral yayılma, çapraz konuşma faktörü S2 ile 488 nanometre ışık tarafından doğrudan uyarılmadan gelen alıcı sinyal, alıcının FRET tarafından uyarılmış donör molekülünden duyarlılaştırılmış emisyonu, ve arka plan sinyali. Donör kanalında, transfer kanalında ve alıcı kanalda, sadece GFP'yi eksprese eden hücrelerde, sadece kirazda, GFP ve kirazı birlikte eksprese eden hücrelerde ve GFP kiraz füzyon proteininde görüntüler elde edildi. GFP kiraz füzyon proteinini eksprese eden NRK hücrelerinde ve GFP kirazını birlikte eksprese edenlerde hesaplanan ortalama hücresel FRET verimlilikleri, her hücredeki alıcı-donör oranı yoğunluk oranı veya moleküler orana göre çizilmiştir.GFP kiraz füzyon proteinini ifade eden, GFP ve kirazı negatif bir kontrol olarak birlikte ifade eden ve Ashwell-Morell reseptörünün reseptör alt birimlerini ifade eden hücrelerin normalleştirilmiş piksel piksel FRET görüntüleri burada gösterilmiştir. Sıçan hepatik lektininin RHL1 ve 2'si, plazma zarının sitoplazmik tarafında GFP ve kiraz ile etiketlendi. GFP RHL1 ve kiraz RHL2 ve GFP RHL1 delta stoğu ve kiraz RHL2'yi eksprese eden hücrelerin ortalama hücresel FRET verimlilikleri, alıcı-donör moleküler oranına göre çizilmiştir.Sunulan nicel FRET yaklaşımı aşağıdakilere izin verir. Canlı hücrenin fizyolojik bağlamında protein etkileşimlerinin tespiti. Protein etkileşimlerinde zamanla meydana gelen değişiklikler.Hücre altı bölmelerdeki etkileşimlerde, konfokal görüntünün piksel düzeyine göre piksele kadar olan etkileşimlerdeki farklılıklar. Ve tespit edilen FRET sinyalinin canlı bir hücrede ifade edilen moleküler alıcı-donör oranına bağımlılığı.

assessing-protein-interactions-live-cells-with-fret-sensitized

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol bir FRET tabanlı yakınlık tahlil kullanarak nasıl görüntü protein-protein etkileşimleri açıklar.

Görüntüleme Protein-protein etkileşimleri In vivo</em

Förster rezonans enerji transferi (FRET) mikroskopi gazetecilere gibi çeşitli biyosensör kullanılarak canlı hücrelerde olayların sinyalizasyon gerçek zamanlı izleme için güçlü bir tekniktir. Burada nasıl bir özelleştirilmiş Epifloresans oluşturmak için ticari olarak mevcut bileşenleri ve nasıl deneyler FRET için kullanmak, görüntüleme sistemi FRET tarif.

Unimoleküler Biyosensörler kullanma Canlı Hücreler Olaylar Sinyal gerçek zamanlı izlenmesi için Mikroskopi FRET

Video, floresan proteinler, bir donör eGFP ve alıcı mCherry ile etiketlenmiş sitoplazmik proteinleri eksprese eden canlı bakterilerde protein-protein etkileşimini belirlemek için FLIM-FRET görüntüleme tekniğini açıklar. Kombine teknik ayrıca etkileşen proteinlerin miktarının belirlenmesine de izin verir.

Canlı Bakterilerde Protein-Protein Etkileşimlerinin Karakterizasyonu için FLIM-FRET Görüntüleme

Proteinler arasındaki etkileşimleri tüm hücresel süreçleri için temel vardır. Bio-ışıldama, rezonans enerji transferi kullanılarak, proteinlerin bir çift arasındaki etkileşim, canlı hücrelerde ve gerçek zamanlı olarak izlenebilir. Bundan başka, potansiyel olarak patojenik mutasyonların etkisi değerlendirilebilir.

Biyoparlaklık Rezonans Enerji Transferi kullanma Canlı Hücrelerde Protein-protein etkileşimleri araştıran

Bu iletişim kuralı hücre-hücre etkileşimleri, yani proteinler hücre kavşaklar, doğrudan canlı hücreler içinde lokalize arabuluculuk proteinler arasındaki etkileşimler araştırmaya floresans dalgalanma spektroskopisi temelli bir yaklaşım açıklar. Biz aleti kalibrasyon, veri toplama ve analizi, olası yapay doku kaynaklarına düzeltmeler dahil olmak üzere ayrıntılı yönergeler sağlar.

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

Burada, bir protokol Förster rezonans eşzamanlı kullanımı için protein yük ve floresan kurtarma kuvvet duyarlı ölçüm etkinleştirme protein dynamics ölçmek için photobleaching sonra ölçmek için enerji transferi tabanlı gerilim sensörler mevcut canlı hücreler içinde protein dinamiği.

Kuvvet duyarlı Protein Dynamics floresan teknikleri bir arada kullanarak canlı hücrelerdeki ölçümü

Protein-protein etkileşimleri biyolojik sistemleri için kritik olan ve bağlama Kinetik çalışmalar dynamics ve protein kompleksleri fonksiyonu sağlar. Floresans rezonans enerji transferi ve durdu-akış tekniği kullanarak karmaşık bir proteinin Kinetik parametrelerin quantifies bir yöntemi açıklanmaktadır.

Protein kompleksleri milisaniyelik zaman ölçekte dinamikleri çalışmaya vitro Floresans rezonans enerji transferi içinde kullanma

Modern floresan etiketleme tekniklerini kullanarak canlı hücrelerdeki membran reseptör dinamiklerini incelemek için Förster Rezonans Enerji transferi (FRET) ile birlikte canlı hücre çift renkli floresan çapraz korelasyon spektroskopisi (FCCS) gerçekleştirmek için deneysel bir protokol ve veri analizi iş akışı sunuyoruz.

Canlı Hücrelerde Protein-Protein Etkileşimi ve Protein Dinamiklerini incelemek için Çift Renkli Floresan Çapraz Korelasyon Spektroskopisi

Floresan rezonans enerji transferi (FRET), canlı hücrelerdeki protein etkileşimlerini tespit etmek için kullanılan bir görüntüleme tekniğidir. Burada, histon modifiye edici enzimlerin, bitki dokularındaki gen ekspresyonunun epigenetik düzenlenmesi için hedef promotörlere onları işe alan transkripsiyon faktörleri ile ilişkisini incelemek için bir FRET protokolü sunulmaktadır.

Histon Modifiye Edici Enzimler ve Transkripsiyon Faktörleri Arasındaki Etkileşimlerin in vivo Floresan Rezonans Enerji Transferi ile İncelenmesi

Burada, canlı HepG2 hücrelerinde Akt aktivasyonu ve fosforilasyonunun uzay-zamansal dinamiklerini ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Förster rezonans enerji transferi (FRET) görüntüleme, kanser hücrelerinde insülin sinyal yolları ve metabolik düzenleme hakkında değerli bilgiler sağlayan güçlü bir araçtır.

HepG2 Hücrelerinde Metabolik Olarak Düzenlenmiş Akt Aktivasyon Dinamiğinin Canlı Hücre Förster Rezonans Enerji Transferi Görüntülemesi

Öğrenin, canlı hücrelerde FRET verimliliğini konfokal mikroskopi ve matematiksel algoritmalarla nasıl nicelendireceğinizi. Bu yöntem, protein etkileşimlerini fizyolojik koşullarda gerçek zamanlı izlemenizi sağlar.

FRET'e duyarlı emisyona sahip canlı hücrelerdeki protein etkileşimlerinin değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet