Caenorhabditis elegans Mitokondriyal Hastalık Modellerinde Hayvan Aktivitesini Ölçmek için Deneysel Yöntemlerin Karşılaştırmalı Analizi
April 4th, 2021
Bu çalışma, C. elegans complex I hastalığı gaz-1(fc21)solucanlarında, yani ZebraLab (orta verimli bir test) ve WormScan'da (yüksek verimli bir test) iki yarı otomatik lokomotor aktivite analizi yaklaşımı için protokoller sunar ve nematod davranışını ve entegre nöromüsküler işlevi ölçmek için çok çeşitli araştırma yöntemleri arasında karşılaştırmalı analiz sağlar.
Bu protokol, sıvı ortamda C.elegans lokomotor aktivitesini hızlı bir şekilde ölçmek için iki farklı yarı otomatik test kullanır ve C.elegans hastalık modellerinde ilaç taraması için uygulanma potansiyeline sahiptir. Bu iki tekniğin temel avantajları kullanım kolaylığı ve tekrarlanabilirlik kolaylığıdır. Her iki teknik de solucan davranışı üzerindeki ilaç etkilerini değişken aktarım hızı ile değerlendirme potansiyeline sahiptir.
Bu hareketlilik tahlilleri, hayvanların nöromüsküler sisteminin bozulduğunda C.elegans mitokondriyal hastalık modellerinin lokomotor aktivitesini değerlendirmek için yararlıdır. L4 aşamasına ilgi çekici ilaç tedavileri olan ve olmayan NGM plakalarındaki mutant solucan suşlarında kontrolü senkronize ettikten sonra cam slaytlardaki sıvı ortamda C.elegans lokomotor aktivitesini analiz etmek için, bir solucan seçimi ve stereomikroskop kullanarak suş başına beş solucan ve koşul olarak cam bir slayttaki S.bazal çözeltinin 20 mikroliter damlasına alın. Birden fazla teknik çoğaltma elde etmek için aynı slayttaki birden çok damlacık için farklı NGM plakalarından aynı deneysel durumdan solucanlar ekleyin.
Tüm solucanlar toplandığında, solucanların her damlada bir dakika boyunca damla başına saniyede 15 karede yüzme aktivitesini kaydetmeden önce hayvanların oda sıcaklığında bir dakika boyunca kaydırağa alışmasına izin verin. ZebraLab yazılımını kullanarak kaydedilen C.elegans lokomotor etkinliğini analiz etmek için zebralab AVI seçeneğini kullanarak yazılıma video yükleyin. AVI Dosyalarıyla Niceleme seçeneğini tıklatın.
Yeni bir iletişim kuralı oluşturmak için Parametreler, Protokol Parametreleri ve Zaman'ı seçin ve deneme süresini bir dakika olarak ayarlayın. Zaman Kutusu Yok'u seçin ve istenen veri çıktısına göre Tümleştirme Dönemi'nin seçimini kaldırın ve daha önce kaydedilmiş her bir video dosyasını yüklemek için Dosya ve Film Aç'ı seçin. Tek bir algılama alanı oluşturmak için, solucanların bulunduğu tüm sıvı damlasının etrafında bir alan oluşturmak için daire aracını kullanın.
Seçilen alandaki tüm solucanların etkinliği algılanacaktır. Kalibre etme mesafesini belirtmek için video alanının solundan sağuna yatay bir çizgi çizin ve Kalibrasyon, Çiz ve Gruba Uygula'yı seçin. Tüm farklı C.elegans solucan suşlarının algılanmasının analiz edilmesine izin vermek için Alan simgesinin seçimini kaldırın ve Etkinlik Eşiğindeki Algılama Duyarlılığı'nı ayarlayın.
Etkinlik analizi devam ederken hayvanlar tarafından yapılan parçaları görselleştirmek için Ekran Ölçeği'ni 70 olarak ayarlayın ve Gruba Uygula'yı seçin. Videoları çözümlemek için Oynat'ı tıklatın ve Deney'i seçin ve videonun dosya adını girmek için Yürüt'ü seçin. Kaydettikten sonra, videonun maksimum bilgisayar hızında analiz edilip edilmeyeceğini soran bir pencere görünecektir.
Evet'i tıklatın. Çalışan deneme penceresi açılır. Başlat'ı tıklatın.
Kayıt analizi tamamlandığında, damlacıkta analiz edilen etkinliği bir elektronik tabloya kaydetmek için Deneme ve durdur'a tıklayın. C.elegans lokomotor aktivitesini sıvı ortamda 96 kuyulu bir plaka formatında analiz etmek için, solucanlar L4 aşamasına ulaştığında, açık bir 96 kuyu düz alt mikro plakanın her kuyusuna E.coli OP50 ve S.bazal ortamı hacmi başına% 2 ağırlıkta 50 mikrolitre ekleyin. Stereomikroskopu kullanarak 96 kuyu plakasının kuyusu başına 15 senkronize solucanı manuel olarak seçin ve solucanların 20 dakika boyunca alışmasını bekleyin.
Alışma süresinin sonunda, taramalar arasında 10 saniyeden az bir süre ile her mikro plakayı iki kez taramak için standart bir düz yataklı tarayıcı kullanın Taramaları analiz etmek için, iki sıralı taramayı hizalamak ve tarayıcının bir piksele ayarlandığında ürettiği ışık yoğunluğuna göre lokomotor yanıtındaki değişiklikleri belirlemek için iki ardışık taramayı hizalamak ve iki görüntü ile göreli solucan tarama puanı arasındaki piksel değiştirme verilerini almak için açık kaynaklı yazılım kullanın eşiği beştir. Tek bir sıvı ortamdaki C.elegans lokomotor aktivitesinin bu analizinde, mitokondriyal kompleks I hastalığı solucanları, L4 aşamasındaki lokomotor aktivitelerinde vahşi tip solucanlara kıyasla önemli bir% 38 azalma göstermiştir. Benzer şekilde, aynı popülasyonların solucan tarama analizi, L4 evre hastalık modeli solucanları için N2 Bristol vahşi tip solucanlara kıyasla lokomotor aktivitesinde önemli bir azalma olduğunu göstermiştir.
Bu lokomotif aktivite kaybı, solucan tarama analizi ile değerlendirilen yetişkin bir evre mitokondriyal kompleks I hastalığı solucanlarında da gözlenmiştir. Her tahlil kurarken doğru sayıda solucan kullanmayı hatırlamak önemlidir. Bu işlemi takiben laboratuvarımız sık sık ilaç taraması gerçekleştirmektedir.
Bu iki teknik laboratuvarımızda mitokondriyal hastalığın preklinik hayvan modellerinde ilgi çekici ilaçların solucan aktivitesi üzerindeki etkilerini değerlendirmek için kullanılmaktadır.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, C. elegans kompleks I hastalığı gas-1 (fc21) solucanlarında iki yarı otomatik lokomotor aktivite analiz yaklaşımı için protokoller sunmaktadır, yani ZebraLab ve WormScan. Bu teknikler, nematod davranışının ve entegre nöromüsküler fonksiyonun kantitasyonunu sağlar.
Çalışmanın Ana Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Davranış Analizi
- Genetik
Arka Plan
- C. elegans, nöromüsküler fonksiyonu incelemek için bir model organizmadır.
- Lokomotor aktivite değerlendirmeleri, ilaç etkilerini değerlendirmek için kritik öneme sahiptir.
- Kompleks I hastalık modelleri, mitokondriyal işlev bozukluğu hakkında bilgiler sağlar.
- Bu değerlendirmeler, ilaç taraması bağlamında uygulanabilir.
Çalışmanın Amacı
- Lokomotor aktiviteyi kantitatif olarak belirlemek için yarı otomatik değerlendirmeler geliştirmek.
- Nematod davranışı analizinde farklı araştırma yöntemlerini karşılaştırmak.
- C. elegans hastalık modellerinde ilaç taramasına olanak sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- İki yarı otomatik lokomotor aktivite değerlendirmesi: ZebraLab ve WormScan.
- Solucanlar senkronize edilir ve sıvı ortamda analiz edilir.
- Numune hazırlığı için bir solucan pikasi ve stereomikroskop kullanılır.
- Doğruluk için çoklu teknik tekrarlar elde edilir.
Ana Sonuçlar
- Her iki teknik de kullanım kolaylığı ve tekrarlanabilirliği göstermiştir.
- Değerlendirmeler, solucan davranışında ilaç etkilerini etkili bir şekilde değerlendirmiştir.
- Sonuçlar, bu yöntemlerin araştırmadaki potansiyelini destekler.
- Karşılaştırmalı analiz, her yaklaşımın güçlü yönlerini vurgulamaktadır.
Sonuçlar
- Çalışma, lokomotor aktivite analizi için değerli protokoller sağlamaktadır.
- Bu yöntemler, C. elegans modellerinde ilaç taramasına katkı sağlayabilir.
- Gelecek araştırmaları, bu bulgulara dayanarak daha fazla bilgi elde edebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of locomotor activity in Caenorhabditis elegans models enables objective evaluation of neuromuscular phenotypes relevant to mitochondrial disease. Semi-automated methods like ZebraLab and WormScan provide scalable, reproducible platforms for preclinical drug screening and mechanistic de-risking in translational research. These approaches support predictive confidence and portfolio triage by standardizing behavioral phenotyping across experimental conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying neuromuscular impairment in disease models.
- Supports functional target validation through objective measurement of locomotor deficits.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing genotype-phenotype relationships in mitochondrial dysfunction.
Screening & Assay Development
- Prepares validated animal models for downstream compound evaluation in drug screening workflows.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative locomotor activity outputs for assay development.
- Enables medium- to high-throughput screening readiness with adaptable throughput options.
- Supports reliable comparison of drug effects across multiple experimental replicates.
Translational & Preclinical Research
- Aligns behavioral phenotyping with disease-relevant endpoints in mitochondrial dysfunction models.
- Provides continuity from early discovery through preclinical validation by supporting objective, scalable readouts.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative behavioral data.
Pipeline & Workflow Integration
These semi-automated locomotor assays integrate from early discovery through lead identification and preclinical research, supporting hypothesis testing and compound triage in mitochondrial disease models.
- Discovery Biology: Quantitative activity measurements clarify genotype-phenotype relationships and support null hypothesis testing.
- Screening: Standardized outputs enable reproducible, scalable compound evaluation in validated animal models.
- Analytics: Automated software provides objective, quantitative readouts for cross-condition comparison.
- Translational Research: Behavioral endpoints align with disease-relevant phenotypes for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Protocols and software tools are adaptable for diverse genetic and pharmacological studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of behavioral assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust phenotypic screening.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in C. elegans handling and behavioral assay setup.
- Needs access to video recording or flatbed scanning instrumentation and compatible analysis software.
- Demands cross-team standardization of assay parameters and calibration procedures.
- Adaptable to various genetic backgrounds and experimental conditions with protocol optimization.
- Throughput and sensitivity may vary based on assay format and instrumentation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:47
Worm Locomotor Activity Analysis in Liquid Medium on Glass Slides
1:37
C. elegans Locomotor Activity Recording Analysis in ZebraLab Software
3:30
Worm Locomotor Activity Analysis in Liquid Medium in 96-Well Plate Format
4:30
Results: Comparative Analysis of Locomotor Activity by ZebraLab and WormScan Software Assays
5:14
Conclusion
