Name: Cas9/sgRNA Ribonucleoprotein Kompleksinin Virüs Benzeri Parçacıklar (Nanoblades) aracılığıyla Ölümsüzleştirilmiş ve Birincil Hücrelerde Teslimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Keşfedin, Nanoblades ile ölümsüzleştirilmiş ve birincil hücrelerde Cas9/sgRNA kompleksinin hızlı, doza bağımlı ve geçici teslimatını. Bu yöntem, off-target etkileri azaltarak verimli genom düzenlemesi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Fransız Ulusal Araştırma Ajansı (ANR), Fondation FINOVI, tarafından işletilen Investissements d'Avenir (ANR-11-IDEX-0007) programı dahilinde Université de Lyon'dan Labex Ecofect (ANR-11-LABX-0048) tarafından finanse edildi. Agence Nationale des Recherches sur le SIDA et les Hépatites Virales (ANRS-ECTZ3306) ve Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programları kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi (ERC-StG-LS6-805500 ila E.P.R.) tarafından.

<ol><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Zuris, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipid-mediated+delivery+of+proteins+enables+efficient+protein-based+genome-editing+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome-editing in vitro and in vivo.</a> Nature Biotechnology. 33, 73-80 (2015).</li>
<li>Mangeot, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+primary+cells+and+in+vivo+using+viral-derived+Nanoblades+loaded+with+Cas9-sgRNA+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Genome editing in primary cells and in vivo using viral-derived Nanoblades loaded with Cas9-sgRNA ribonucleoproteins.</a> Nature Communications. 10 (1), 45(2019).</li>
<li>Cai, Y., Bak, R. O., Mikkelsen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+editing+by+lentiviral+protein+transduction+of+zinc-finger+and+TAL-effector+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Targeted genome editing by lentiviral protein transduction of zinc-finger and TAL-effector nucleases.</a> eLife. 3, 01911(2014).</li>
<li>Choi, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+pre-packed+with+Cas9+protein+for+safer+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Lentivirus pre-packed with Cas9 protein for safer gene editing.</a> Gene Therapy. 23 (7), 627-633 (2016).</li>
<li>Gee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+nanovesicles+for+packaging+of+CRISPR-Cas9+protein+and+sgRNA+to+induce+therapeutic+exon+skipping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Extracellular nanovesicles for packaging of CRISPR-Cas9 protein and sgRNA to induce therapeutic exon skipping.</a> Nature Communications. 11, 1334(2020).</li>
<li>Indikova, I., Indik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+%27hit-and-run%27+genome+editing+with+unconcentrated+lentivectors+carrying+Vpr.Prot.Cas9+protein+produced+from+RRE-containing+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient 'hit-and-run' genome editing with unconcentrated lentivectors carrying Vpr.Prot.Cas9 protein produced from RRE-containing transcripts.</a> Nucleic Acids Research. 48 (14), 8178-8187 (2020).</li>
<li>Lyu, P., Javidi-Parsijani, P., Atala, A., Lu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivering+Cas9%2FsgRNA+ribonucleoprotein+%28RNP%29+by+lentiviral+capsid-based+bionanoparticles+for+efficient+%27hit-and-run%27+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Delivering Cas9/sgRNA ribonucleoprotein (RNP) by lentiviral capsid-based bionanoparticles for efficient 'hit-and-run' genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 47 (17), 99(2019).</li>
<li>Gheysen, D., Jacobs, E., de Foresta, F., Thiriart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+release+of+HIV-1+precursor+Pr55gag+virus-like+particles+from+recombinant+baculovirus-infected+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Assembly and release of HIV-1 precursor Pr55gag virus-like particles from recombinant baculovirus-infected insect cells.</a> Cell. 59 (1), 103-112 (1989).</li>
<li>Hanna, R. E., Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+analysis+of+CRISPR-Cas+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Design and analysis of CRISPR-Cas experiments.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 813-823 (2020).</li>
<li>Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning+a+laboratory+manual.+Third+edition%22">Molecular cloning a laboratory manual. Third edition</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).</li>
<li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+high-titer+lentivirus+preparations+without+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation.</a> Scientific Reports. 5, 13875(2015).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
<li>O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+spinoculation+enhances+infection+through+virus+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding.</a> Journal of Virology. 74 (21), 10074-10080 (2000).</li>
<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), 168(2014).</li>
<li>Bollen, Y., Post, J., Koo, B. -K., Snippert, H. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+create+state-of-the-art+genetic+model+systems%3A+strategies+for+optimal+CRISPR-mediated+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">How to create state-of-the-art genetic model systems: strategies for optimal CRISPR-mediated genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 46 (13), 6435-6454 (2018).</li>
<li>Brinkman, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantification+of+template-directed+CRISPR%2FCas9+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing.</a> Nucleic Acids Research. 46 (10), 58(2018).</li>
<li>Dussaud, S., Pardanaud-Glavieux, C., Sauty-Colace, C., Ravassard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+mediated+production+of+transgenic+mice%3A+a+simple+and+highly+efficient+method+for+direct+study+of+founders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lentiviral mediated production of transgenic mice: a simple and highly efficient method for direct study of founders.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57609(2018).</li>
<li>Montagna, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VSV-G-enveloped+vesicles+for+traceless+delivery+of+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">VSV-G-enveloped vesicles for traceless delivery of CRISPR-Cas9.</a> Molecular Therapy. Nucleic Acids. 12, 453-462 (2018).</li>
<li>Marnef, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cohesin%2FHUSH-+and+LINC-dependent+pathway+controls+ribosomal+DNA+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">A cohesin/HUSH- and LINC-dependent pathway controls ribosomal DNA double-strand break repair.</a> Genes & Development. 33 (17-18), 1175-1190 (2019).</li>
</ol>

Philippe E. Mangeot ve Emiliano P. Ricci, Nanoblades teknolojisi ile ilgili bir patentte mucit olarak adlandırılır (patent başvuru sahipleri: Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Ecole Normale Superieure de Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, Villeurbanne Cedex; başvuru numarası: WO 2017/068077 Al; patent durumu: yayınlanan, 27 Nisan 2017; makalenin tüm yönleri patent başvurusu kapsamındadır. Geri kalan yazarlar rakip çıkar beyan etmemektedir.

Nanoblades, hücre hatlarında ve birincil hücrelerde Cas9/sgRNA RNP kompleksinin hızlı ve doza bağımlı olarak teslimine izin verir. Klasik transfeksiyon ve diğer viral iletim vektörlerinin aksine, ancak protein elektroporasyon gibi, Nanoblades de Cas9 / sgRNA RNP'nin transgene içermeyen bir şekilde geçici olarak teslim etme avantajına sahiptir. Nanoblades, protein dağıtımı için sürekli genişleyen CRISPR varyantları ailesine kolayca ve hızlı bir şekilde uyarlanabilen çok yönlü, basit ve ucuz bir platform sunar. Nanoblades HEK293T hücre hattında veya türevlerinde üretilebilir. Burada kullanılan HEK293T hücre hatları retroviral ve lentiviral partikül üretimini en üst düzeye çıkarmak için geliştirilmiştir ( bkz. Malzeme Tablosu). Bununla birlikte, HEK293T hücrelerinin diğer kaynakları uygun olsa da, HEK293T hücre kaynağına bağlı olarak parçacık üretiminde büyük farklılıklar gözlendiği için kullanıcılar farklı kaynaklardan GELEN HEK293T hücrelerini test etmeli ve karşılaştırmalıdır. Hücreler ayrıca parçacık üretimi üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olan aşırı etkiyi önlemek için sık sık Mikoplazma kontaminasyonu açısından kontrol edilmelidir ve her üç günde bir (klasik olarak 1/8 seyreltme) geçilmelidir.
Hücreler 20'den fazla pasaj için muhafaza edilmelidir. Hücre kültürü için glikoz, penisilin/streptomisidin, glutamin ve %10 ayrışmış fetal sığır serumu ile desteklenmiş DMEM kullanıldı. Serum orijini Nanoblade preparatının kalitesini etkileyebileceğinden, büyük ölçekli üretimden önce farklı serum partileri test edilmelidir. Nanoblades, transfection'dan sonraki gün DMEM'in yerini alabilen minimum esansiyel ortamın RPMI veya serumsuz modifikasyonları gibi diğer mecralarda verimli bir şekilde üretilebilir. Aşağıda belirtildiği gibi, transfeksiyondan sonra bazı DNA transfeksiyon reaktifleri ile orta değişim isteğe bağlı olsa da, özellikle parçacık preparatında serum izlerini sınırlamak için VLP'lerin salındığı ortamı değiştirmek faydalı olabilir. Bununla birlikte, transfeksiyondan önceki gün azaltılmış serum minimum esansiyel ortamda hücrelerin yetiştirilmesi henüz denenmemiştir.
Belirtildiği gibi, Nanoblades, üretici hücrelerde plazmidlerin bir karışımının aşırı ifade edildikten sonra üretilir. Aşırı ifade, optimum üretim için gerekli görünüyor. Gerçekten de, bu laboratuvar Gag-Pol ifade yapısı antibiyotik seçimi ile stabilize edildiği bir üretici hücre hattı geliştirdi; ancak, bu sistem önemli miktarda Nanoblades üretemedi. Benzer bir gözlem, sgRNA kodlama yapısı üretici hücrelerin genomuna bıçaklanarak entegre edildiğinde de yapılmıştır. Diğer parçacık üretim sistemleri için açıklandığı gibi, Nanoblades üretiminde yer alan en azından bazı yapıları ifade eden kararlı bir hücre hattı yararlı olabilir; bununla birlikte, bu kesinlikle büyük hacimli süpernatantın işlenmesini ve parçacıkları arındırmak için uygun bir teknik gerektirecektir. Yukarıdaki protokol, belirli transfeksiyon reaktiflerinden yararlanan Nanoblades üretmek için tercih edilen yordamı özetlemektedir ( bkz. Malzeme Tablosu).
Diğer üreticilerin transfeksiyon reaktifleri de başarıyla test edilmiş olsa da, bu grubun Nanoblades ile elde ettiği sonuçların büyük çoğunluğu burada açıklanan prosedürü takip eder. Kalsiyum fosfat reaktifleri kullanılarak düşük maliyetli transfeksiyon elde edilebilir ve iyi üretim verimliliği sağlayabilir; bununla birlikte, bu yöntem kesinlikle transfeksiyondan sonraki gün transfeksiyon ortamının değiştirilmesini gerektirir ve çökelmiş parçacık preparatında kalsiyum fosfat kalıntıları bırakabilir. Üretici hücrelerdeki Nanoblade bileşenleri için yüksek ekspresyon seviyelerinin gerekliliği ile tutarlı olarak, Cas9 proteini ile ilişkili sgRNA miktarının verimli genom düzenleme için sınırlayıcı bir faktör olabileceği gözlemidir. SgRNA yüklemesini iyileştirmek için, nanoblades'e benzer protein dağıtım vektörleri kullanan bağımsız gruplar tarafından son zamanlarda iki teknik yaklaşım geliştirilmiştir. Bunlar, sgRNA6'nın T7 polimeraz bağımlı sitoplazmik ekspresyonunun kullanılmasına veya Gag poliprotein6'ya bağlanmaya aracılık etmek için sgRNA dizisine retroviral kapsülleme sinyali eklenmesine dayanır. Bu yaklaşımlar, henüz test edilmiş olmasalar da Nanoblades içinde sgRNA yüklemesini gerçekten iyileştirebilir.
Hedef hücrelerin transdüksiyonunun prosedürde kritik bir adım olduğu sonucuna varılması. Ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarının çoğunda, Nanoblades ile transdüksiyonun sitopatik etkisi çok azdır veya hiç yoktur. Bununla birlikte, birincil hücrelerde toksisite bir sorun olabilir. Bu nedenle transdüksiyonun her hücre tipi için en iyi duruma getirilmelidir. Özellikle, Nanoblades'e maruz kalma süresi, transdüksiyon protokolünü optimize ederken değiştirilmesi gereken önemli bir faktördür. Birincil nöronlar veya kemik iliği hücreleri gibi hassas hücreler için, ortamı değiştirmeden önce Nanoblades ile 4-6 saat inkübasyon, hücre toksisitesini en aza indirirken Cas9 proteininin verimli bir şekilde teslim edilmesine izin verir. Ayrıca, katyonik polimerler gibi yardımcılar, diğerlerinin yanı sıra, bazı hücrelerde transdüksiyon verimliliğini önemli ölçüde artırabilir ( bkz. Malzeme Tablosu). Nanoblades'in VLP'ler olduğunu ve immünojenik bir yanıta neden olabileceğini belirtmek önemlidir. Bu, Nanoblades ile inkübasyonun gen ifadesinde ve hücrelerin fenotipinde önemli değişikliklere neden olabileceği makrofajlar veya dendritik hücreler gibi belirli birincil hücre türleriyle çalışıyorsa bir sınırlama olabilir. Makrofajlar ve dendritik hücreler hematopoetik kök hücre öncüllerinden (fare kemik iliği hücreleri gibi) türetilmişse, Nanoblades'e karşı hücresel bir yanıta neden olmamak için hücrelerin tamamen farklılaştırılmadan önce Nanoblades ile transdüse olması tercih edilir. Aksi takdirde, Cas9 protein elektroporasyon farklılaştırılmış bağışıklık hücreleri ile çalışırken uygun bir alternatif temsil edebilir.
Nanoblades, transgenik hayvanlar üretmek için fare zigotlarını veya embriyolarını transdüse etmek için in vivo olarak kullanılabilir. Klasik retroviral veya lentiviral vektörlere benzer şekilde, yetişkin hayvanlardan dokulara doğrudan enjekte edilebilirler. Bununla birlikte, Nanoblades (retroviral ve lentiviral vektörlere benzer) konakçı hayvanın bağışıklık tepkisi ile inaktive edilebilir; bu nedenle, enjekte edilecek doz her uygulama için optimize edilmelidir. Bu immün yanıt, fonksiyonel VLP'lerin enjeksiyon bölgesine yakın dokulara dağılımını da sınırlayabilir. Son olarak, lentiviral vektörlerin aksine, Nanoblades transgene içermez ve Cas9'u sınırlı bir zaman diliminde teslim eder. Bu nedenle, hücre seçimi sırasında sgRNA'ların yüksek verimli dizilimini gerektiren genom çapında fonksiyonel taramalar yapmak için kullanılamazlar. Nanoblades hızlı, doza bağımlı ve transgene içermeyen genom düzenleme gerektiğinde faydalıdır20. Ayrıca, protein elektroporasyonuna benzer şekilde, Nanoblades DNA transfeksiyonu veya klasik viral vektörler aracılığıyla Cas9 /sgRNA'nın uzun süreli ekspresyonuna göre daha az hedef dışı etkiye yol açar3. Nanoblades'in gelecekteki gelişimi, temel düzenleme ve RNA hedefleme gibi farklı teknolojik uygulamalar için Cas9 varyantlarını birleştirmeye odaklanmıştır.

Crispr-Cas sistemi, diğer programlanabilir nükleaslarla karşılaştırıldığında, ökaryotik hücrelerde diziye özgü genom hedefleme ve bölünme prosedürünü önemli ölçüde basitleştirdi ve demokratikleştirdi. Bir sgRNA'nın basit ifadesiyle, kullanıcılar Cas9 proteinini (veya optimize edilmiş varyantları) hemen hemen her hücresel lokus için programlayabilir1. Bu senaryoda, Cas9 proteini ve sgRNA'nın teslimatı, bölgeye yönelik mutajensis yapılırken ana sınırlama haline gelir. Ölümsüzleştirilmiş hücrelerde, sgRNA ve Cas proteini, çoğu hücrede verimli genom hedeflemesi elde etmek için transfected plazmidlerden kolayca ifade edilebilir. Bununla birlikte, Cas9/sgRNA kompleksinin kesin ifadesi Cas9 proteininin hedef dışı aktivitesini artırabilir ve spesifik olmayan loci2'de istenmeyen değişikliklere neden olabilir. Birincil hücrelerde, DNA transfeksiyonunun elde edilmesi teknik olarak zor olabilir ve zayıf ifadeye veya transktaklı hücrelerin küçük bir yüzdesine yol açabilir. Klasik DNA transfeksiyonuna alternatifler, Cas9 ve sgRNA için transgene kodlaması sağlayan viral vektörlerin kullanımını veya sentetik bir sgRNA ile birleştirilmiş rekombinant Cas9 proteininin elektroporasyonunu içerir. Bununla birlikte, bu yaklaşımlar hücre konak genomu içinde transgene entegrasyonuna (klasik retroviral ve lentiviral ekspresyon vektörlerinde olduğu gibi), hücresel faktörler tarafından kısıtlanmaya ve Cas9 proteini ve sgRNA'nın constitutive ekspresyonuna yol açabilir.
Cas9/sgRNA RNP kompleksinin elektroporasyonunun bu sorunların çoğunun üstesinden gelerek birincil hücrelerde ve in vivoda verimli ve geçici teslimata yol açabileceği gibi doza bağlı bir yanıta da izin verebilir. Bununla birlikte, genellikle pahalı ekipmanlara ve reaktiflere dayanır ve çok sayıda hücrenin tedavi edilmesi gerekiyorsa ölçeklenilmesi de zordur. Yukarıda belirtilen tekniklere alternatif olarak, bu yazarlar Cas9 proteini ve sgRNA3 için kavramsal olarak diğer viral türetilmiş kapsid protein dağıtım sistemlerine benzer bir retroviral iletim vektörü olan "Nanoblades"i geliştirmiştir4,5,6,7,8. Nanoblades, gag poliproteinin doğal kapasitesini retrovirüslerden yararlanarak, kültürlü hücrelerde tek başına ifade edildiğinde, hücre dışı ortamda salınan VLP'leri üretir9. Cas9 proteinini murine lösemi virüsünün (MLV) Gag poliproteinin C-terminal ucuna kaynaştırarak ve sgRNA ve viral zarf glikoproteinlerini birlikte ifade ederek, Cas9 proteini serbest bırakılan VLP'ler veya Nanoblades içinde kapsüllenebilir. Saflaştırmadan sonra, Nanoblades hedef hücrelerle inkübe edilebilir veya Cas9 / sgRNA RNP kompleksinin hızlı, geçici ve doza bağlı teslimatına aracılık etmek için vivo enjekte edilebilir3.
Nanoblades, farklı loci'de eşzamanlı düzenleme için birden fazla sgRNA ile veya hedefe özgü transkripsiyonal aktivasyon veya baskı3 gibi diğer uygulamaları gerçekleştirmek için Cas9 varyantlarıyla programlanabilir. Rekombinant ifadeye dayanan protein elektroporasyonunun aksine, literatürden yeni tanımlanan Cas varyantları Gag füzyon ifade vektörüne kolayca klonlanabilir ve bu da onu çok yönlü bir platform haline getirir. Nanoblades daha da karmaşık hale getirilebilir veya homolojiye yönelik onarım yapmak için tek telli ve çift telli oligodeoksinükleotidler (ssODN'ler) ile yüklenebilir3. Nanoblade üretimi nispeten basit ve ucuzdur. Ayrıca, Nanoblades günlerce 4 °C'de veya uzun süreli depolama için -80 °C'de saklanabilir. Tipik olarak, Nanoblades çoğu ölümsüzleştirilmiş ve birincil kültürlü hücrelerde verimli, transgene içermeyen genom düzenlemeye aracılık eder. Bununla birlikte, bazı birincil hücreler viral parçacıkların varlığına duyarlı olabilir ve bu da mortalitenin artmasına neden olabilir. Doğuştan gelen bağışıklık sisteminin hücreleri de Nanoblades varlığına (viral kökenleri nedeniyle) tepki verebilir ve aktive olabilir. Bu durumlarda, transdüksiyon protokolü Nanoblades maruz kalma süresini sınırlamak ve spesifik olmayan etkileri en aza indirmek için optimize edilmelidir. Nanoblades, mevcut diğer CRISPR teslimat yöntemlerine uygulanabilir ve uygulanması kolay bir alternatifi temsil eder.

<table><tbody><tr><td>13,2 mL, İnce Cidarlı Polipropilen Tüpler, 14 x 89 mm - 50Pk</td><td>Beckman Coulter Yaşam Bilimleri</td><td>331372</td><td>Nanoblades saflaştırması için Ultrasantrifüj tüpleri</td></tr><tr><td>Amersham Protran Premium Western kurutma membranları, nitroselüloz</td><td>Merck</td><td>GE10600004</td><td>Saflaştırılmış Nanoblade'ler içinde Cas9 seviyelerini ölçmek için nitroselüloz membran</td></tr><tr><td>BIC-Gag-CAS9</td><td>Addgene</td><td>119942</td><td>Bir GAG (F-MLV)-CAS9(sp) füzyonunu kodlar. Aşırı eksprese edilmiş gRNA(lar) ve uygun zarflarla ilişkili olarak üretici hücrelerden GAG-CAS9 Virüsü benzeri partiküllerin üretilmesine izin verir</td></tr><tr><td>BICstim-Gag-dCAS9-VPR</td><td>Addgene</td><td>120922</td><td>Hedeflenen transkripsiyonel aktivasyon için bir GAG-dCAS9-VPR füzyonunu kodlar</td></tr><tr><td>BLADE</td><td>Addgene</td><td>134912</td><td>Nanoblades sisteminde kullanılacak sgRNA dizisini klonlamak için boş omurga</td></tr><tr><td>BsmBI-v2</td><td>New England Biolabs</td><td>R0739S</td><td>SgRNA klonlaması için BLADE ve SUPERBLADES vektörlerini sindirmek için kısıtlama enzimi</td></tr><tr><td>Cas9 (7A9-3A3) Fare mAb (HRP Konjugat) #97982</td><td>Hücre Sinyalleme Teknolojisi</td> Nokta lekesi Cas9 nükleaz ile <td>Cas9 kantifikasyonu için</td><td>97982S</td> Anti-Cas9 antikoru</tr>, <tr><td>S. pyogenes</td><td>New England Biolabs</td><td>M0386T</td><td>Rekombinant Cas9 proteini, Nanoblade'ler içinde yüklü Cas9 miktarının mutlak miktar tayini için referans olarak kullanılacak</td></tr><tr><td>Etidyum bromür çözeltisi (H2O) içinde 10 mg mL)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510-10ML</td><td>Agaroz jellerini boyamak ve DNA'yı görselleştirmek için</td></tr><tr><td>Fisherbrand Dalga Hareket Çalkalayıcılar Fisher</td><td>Scientific</td><td>88-861-028</td><td>Santrifüjleme jeli üzerine Nanoblade'leri yeniden askıya almak için ajitasyon masası</td></tr><tr><td>Analizör</td><td></td><td></td><td>http://www.gelanalyzer.com; sindirimden sonra bant yoğunluğunun ölçülmesi</td></tr><tr><td>Gezikül Üreticisi 293T</td><td>Takara</td><td>632617</td><td>Nanoblades üreticisi hücre hattı</td></tr><tr><td>Gibco DMEM, yüksek glikoz, piruvat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>41966052</td><td>Gesikül Üreticisi 293T hücreleri için hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>GoTaq G2 DNA Polimeraz</td><td>Promega</td><td>M7848</td><td>T7 endonükleaz tahlillerinden önce genomik DNA'nın amplifikasyonu için Taq polimeraz</td></tr><tr><td>DNA ve DNA için jetPRIME Transfeksiyon Reaktif kiti/ siRNA</td><td>Polyplus</td><td>POL114-15</td><td>Gesikül Üreticisi 293T hücrelerinde Nanoblade üretimi için Transfeksiyon reaktifi</td></tr><tr><td>Millex-AA, 0.80 ve mikro; m, şırınga filtresi</td><td>Millipore SLAA033SS</td><td></td> Nanoblades Millex-GS, 0.22 ve mikro <td>konsantrasyonundan önce hücresel kalıntıları gidermek için şırınga filtresi</td></tr><tr><td>; m, şırınga filtresi</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SS</td><td>Sükroz yastık çözeltisini sterilize etmek için şırınga filtresi</td></tr><tr><td>Millex-HP, 0.45 & m, polietersülfon, şırınga filtresi</td><td>Nanoblades konsantrasyonundan önce hücresel kalıntıları gidermek için</td><td>Millipore</td><td>SLHP033RS</td> Şırınga filtresi</tr><tr><td>Monarch DNA Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>New England Biolabs</td><td>T1020L</td><td>DNA jel ekstraksiyon kiti, bsmBI NEB ile sindirim üzerine pBLADES veya pSUPERBLADES plazmit fragmanının saflaştırılması için</td></tr><tr><td>Kararlı Yetkin E. coli (Yüksek Verimlilik)</td><td>New England Biolabs</td><td>C3040I</td><td>Plazmit transformasyonu ve amplifikasyonu için yetkin bakteriler</td></tr><tr><td>Transfeksiyon dereceli plazmit DNA için NucleoBond Xtra Midi kiti</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410.50</td><td>Kültürlenmiş bakterilerden plazmit DNA'sının saflaştırılması için maxipreparat kiti</td></tr><tr><td>Nucleospin gDNA ekstraksiyon kiti</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740952.50</td><td>Transdüksiyon hücrelerinden genomik DNA'nın ekstraksiyonu</td></tr><tr><td>NucleoSpin Plasmid, Plazmid DNA</td> <td>için mini kitMacherey-Nagel</td><td>740588.50</td><td>Kültürlenmiş bakterilerden plazmit DNA'nın saflaştırılması için mini hazırlık kiti</td></tr><tr><td>NucleoSpin Doku, Hücrelerden ve dokudan DNA için mini kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740952.5</td><td>Genomik DNA ekstraksiyon kiti</td></tr><tr><td>Optima XE-90</td><td>Beckman Coulter Yaşam Bilimleri</td><td>A94471</td><td>Ultrasantrifüj</td></tr><tr><td>pBaEVRless</td><td>Els Verhoeyen (Inserm U1111)</td><td>Kişisel istekler şu adrese gönderilmelidir: els.verhoyen@ens-lyon.fr</td><td>Babun Endojen retrovirüs Girard-Gagnepain, A. ve ark. Babun zarf psödotipli LV'ler, erken sitokin ile uyarılan ve dinlenen HSC'lere gen transferi için VSV-G-LV'lerden daha iyi performans gösterir. Kan 124, 1221&ndash; 1231 (2014)</td></tr><tr><td>pBS-CMV-gagpol</td><td>Addgene</td><td>35614</td><td>Murin Lösemi Virüsü gag ve pol genlerini enocdes</td></tr><tr><td>eder pCMV-VSV-G</td><td>Addgene</td><td>8454</td><td>Lentiviral ve MuLV retroviral partiküller üretmek için zarf proteini</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14200091</td><td>10X PBS, miligözenekli suda seyreltmek için</td></tr><tr><td>Polibren Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Millipore Sigma</td><td>TR-1003-G</td><td>Belirli memeli hücrelerinde retroviral transdüksiyonun verimliliğini artıran katyonik polimer. Ayrıca, moleküler biyoloji için homolojiye yönelik onarım Sükroz için bir Oligodeoksinükleotidin (ODN) viral bağımlı girişine izin verebilir</td></tr><tr><td>; %99,5 (GC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389-5KG</td><td>Sükroz, ultrasantrifüjleme yoluyla Nanoblade saflaştırması için bir yastık hazırlamak için</td></tr><tr><td></td><td>Addgene</td><td>134913 SUPERBLADE5</td><td>Nanoblades sisteminde kullanılacak sgRNA dizisini klonlamak için boş omurga (Chen B ve diğerleri, 2013 aracılığıyla artan genom düzenleme verimliliği için optimize edilmiştir)</td></tr><tr><td>SuperSignal West Dura Uzatılmış Süreli Substrat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34076</td><td>Cas9 nokta lekeleri için gelişmiş kemilüminesans (ECL) HRP substratı</td></tr><tr><td>SW 41 Ti Sallanan Kova Rotoru</td><td>Beckman Coulter Yaşam Bilimleri</td><td>331362</td><td>Ultrasantrifüjleme için Rotor</td></tr><tr><td>SYBR Güvenli DNA Jel Leke</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33102</td><td>Agaroz jellerini boyamak ve DNA T4 DNA Ligase'ı görselleştirmek için etidyum bromüre alternatif</td></tr><tr><td></td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td>BLADE veya SUPERBLADES vektörlerini sgRNA'nın değişken bölgesine karşılık gelen duplekslenmiş DNA oligoları ile bağlamak için DNA ligaz T7</td></tr><tr><td>Endonükleaz I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0302S</td><td>T7 Endonükleaz I, mükemmel eşleşmemiş DNA'yı tanır ve parçalar. Belirli bir lokusta genom düzenlemenin kapsamını izlemeye izin verir</td></tr><tr><td>Triton içeren lizis tamponu</td><td>Promega</td><td>E291A</td><td>Nanoblades'i bozmak ve Cas9 miktar tayinine izin vermek için lizis tamponu</td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td>TBST'nin hazırlanması için</td></tr></tbody></table>

cas9/sgrna ribonucleoprotein kompleksinin virüs benzeri parçacıklar ("nanoblades") aracılığıyla Ölümsüzleştirilmiş ve birincil hücrelerde teslimi

Delivery of the Cas9/sgRNA Ribonucleoprotein Complex in Immortalized and Primary Cells via Virus-like Particles ("Nanoblades")

Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR)-Cas sistemi ökaryotik hücrelerde genom düzenlemeyi demokratikleştirmiş ve çok sayıda yenilikçi uygulamanın geliştirilmesine yol açmıştır. Bununla birlikte, Cas9 proteininin ve tek kılavuzlu RNA'nın (sgRNA) hedef hücrelere teslimi teknik olarak zor olabilir. Lentivirüsler (LV'ler) veya adeno ilişkili virüslerden (AAV' ler) elde edilenler gibi klasik viral vektörler, Cas9 proteini ve ilişkili sgRNA için transgenes kodlamasının birçok birincil hücrede ve in vivoda verimli bir şekilde sunulmasını sağlar. Bununla birlikte, bu vektörler transjenin hedef hücre genomuna entegrasyonu, sınırlı bir kargo kapasitesi ve Cas9 proteininin uzun süreli ekspresyoyup rna'yı hedef hücrelerde yönlendirmesi gibi dezavantajlardan muzdarip olabilir.
Bu sorunların bazılarının üstesinden gelmek için, herhangi bir kodlama transgene yokluğunda Cas9 proteinini ve ilişkili kılavuz RNA'yı paketlemek için murine Lösemi virüsüne (MLV) dayanan bir doğum vektörü geliştirilmiştir. Cas9 proteininin MLV'den Gag yapısal proteininin C-terminusuna kaynaştırılarak, Cas9 proteini ve sgRNA ("Nanoblades" olarak adlandırılır) ile yüklü virüs benzeri parçacıklar (VLP'ler) oluştu. Nanoblades, üretici hücrelerin kültür ortamından toplanabilir, saflaştırılabilir, ölçülebilir ve hedef hücreleri transdüse etmek ve aktif Cas9/sgRNA kompleksini sağlamak için kullanılabilir. Nanoblades, ribonikleoprotein (RNP) yüklerini çok çeşitli birincil ve ölümsüzleştirilmiş hücrelerde geçici ve hızlı bir şekilde sunar ve değiştirilmiş Cas9 proteinleri kullanılarak hedeflenen genlerin geçici transkripsiyonal aktivasyonu gibi diğer uygulamalar için programlanabilir. Nanoblades, transgenik hayvanlar üretmek için enjekte edilen yetişkin farelerin karaciğerinde ve oositlerde in vivo genom düzenleme yeteneğine sahiptir. Son olarak, "transfection içermeyen" homolojiye yönelik onarım için donör DNA'sı ile karmaşıklanabilirler. Nanoblade hazırlama basit, nispeten düşük maliyetlidir ve herhangi bir hücre biyolojisi laboratuvarında kolayca gerçekleştirilebilir.

Nanoblade hazırlama protokolü oldukça basittir ve doku kültürü başlığına, CO2 inkübatörüne ve sallanan kova santrifüjüne veya ultracentrifuge'a erişimin yanı sıra basit laboratuvar ekipmanı gerektirir. Bununla birlikte, bazı adımlar, üretici hücrelerin kaynağı ve işlenmesi ve transdüksiyon koşulları gibi özellikle dikkat gerektirir. Şekil 1A'da gösterildiği gibi, hücrelerin plakaya homojen bir şekilde dağıtılması ve transfeksiyon gününde ~% 70-80 izdihama ulaşması için tohumlanması önemlidir (hücre kümelerine sahip olmaktan kaçının). Transfectiondan yirmi dört saat sonra (Şekil 1B,C), üretici hücreler birden fazla çekirdekle daha büyük boyutlu hücrelere yol açan senksitia oluşturacaktır. Transfectiondan kırk saat sonra (Şekil 1D), plakadaki çoğu hücre senksitia oluşturmuş ve plakadan ayırmaya başlayacaktır.
Bu son derece normaldir ve komşu hücreler arasında füzyona neden olan zarf glikoproteinin ifadesinden kaynaklanır. Santrifüjleme ile konsantrasyon üzerine (hatta doğrudan üretici hücrelerin üstnatanından), Nanoblades içinde yüklenen Cas9 miktarı, referans olarak rekombinant Cas9 kullanılarak bir nitroselüloz membranındaki nokta lekesi ile mutlak bir şekilde ölçülebilir (Şekil 2). Bu adım, hedef hücrelerin transdüksiyon için kullanılacak doğru nanoblades miktarını belirlemek için önemlidir. Nokta-blot testini gerçekleştirirken, yalnızca standart eğrinin doğrusal aralığına giren okumaları göz önünde bulundurmak önemlidir. Bununla birlikte, Nanoblades'te bulunan Cas9 miktarından bağımsız olarak, T7 endonuclease testi (Şekil 3) veya Sanger dizilimini kullanarak genom düzenleme verimliliğini doğrudan hedef hücreler üzerinde test etmek önemlidir.
Şekil 3'te gösterildiği gibi, Nanoblades'in verimliliği toplu işlemden toplu işleme farklılık gösterebilir, ancak genellikle Cas9 miktarıyla ilişkilidir. Şekil 3'te gösterilen örnekte, şerit 1'den gelen toplu iş genel düzenleme verimliliğine , şerit 3'ten gelen toplu iş ise ` verimliliğe yol açar. Bu durumda, toplu iş 3'tekine benzer bir düzenleme verimliliği elde etmek için toplu iş 1'den kullanılan Nanoblades'in hacmini artırmak mümkündür. Şekil 4, farklı birincil hücre türlerinde Nanoblades kullanılarak elde edilen maksimum düzenleme verimliliğini gösterir. Verimliliğin, kullanılan sgRNA'nın sırasına ve hedef erişilebilirliğe bağlı olarak değişebileceğini unutmayın.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62245/62245fig01.jpg"> Şekil 1: Nanoblade üretimi sırasında üretici hücrelerin morfolojisi. (A) HEK293T hücreleri% 70-80 birleştiğinde 24 saat kaplama. (B ve C) HEK293T hücre morfolojisi transfeksiyondan sonra 24 saat. (D) Hek293T hücre morfolojisi transfeksiyondan 40 saat sonra. Ölçek çubukları = 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62245/62245fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62245/62245fig02.jpg"> Şekil 2: Nanoblades içindeki Cas9 yüklemesinin nokta-blot ile ölçülmesi. (A) Rekombinant Cas9 veya 100x konsantre (ultracentrifugation ile) Nanoblade örnekleri (#1, #2 ve #3) 2 kat ardışık olarak seyreltilir ve anti-Cas9 HRP bağlantılı antikorlarla inkübasyondan önce bir nitroselüloz zar üzerinde tespit edilir. Sinyal gelişmiş kemimuminesans ile ortaya çıkardı. (B) Kemimuminesans sinyali, nitroselüloz membranda tespit edilen bilinen Cas9 miktarına göre çizilen rekombinant Cas9 seyreltmeleri ve sinyal yoğunluğu için elde edilir ve ölçülür. Doğrusal aralık içinde olan seyreltmeler için bir regresyon eğrisi hesaplanır (bkz. mavi haçlar), doğrusal aralığın dışındaki tüm konsantrasyonlar hariç (bkz. kırmızı haçlar). (C) Her Nanoblade preparatında cas9 konsantrasyonu (nM), (B) içinde elde edilen doğrusal regresyon denklemi kullanılarak tahmin edildi. Bunun için, sadece regresyon eğrisinin doğrusal aralığına giren Nanoblade seyreltmelerinden gelen nicel sinyali kullanmak önemlidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62245/62245fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62245/62245fig03.jpg"> Şekil 3: Transdüksiyon üzerine düzenleme verimliliğinin izlenmesi. (A) Nanoblade ile işlenmiş hücrelerde bölünme verimliliğini ölçen T7 endonuclease tahlil. EMX1 genini hedef alan Nanoblades ile transdüklenen hücreler T7 endonuclease tahlili ile analiz edildi. Şerit 1: Nanoblade hazırlama grubu #1 ( bölünme verimliliği); Şerit 2: Kontrol hücreleri; Şerit 3: Nanoblade hazırlama grubu #2 (` bölünme verimliliği). (B) DDX3 açık okuma çerçevesinde bayrak etiketi sırasının çalınması. DDX3 lokusu hedefleyen bir sgRNA ile programlanmış konsantre Nanoblades, farklı HEK293T klonlarından (#1, #2) üretildi ve bir Flag-DDX3 ssODN şablonunun artan dozları ve HEK293T hedef hücrelerinin transdüksiyon için kullanılan elde edilen komplekslerle karmaşık hale getirildi. Transdüksiyon üzerine, hücreler genomik DNA ve toplam proteinleri çıkarmak için toplanmadan önce üç gün boyunca yetiştirildi. Flag-DDX3 proteinleri anti-Flag agarose boncukları kullanılarak immün özürlü hale getirildi ve ardından geri kazanılan proteinlerin anti-Flag antikoru (üst panel) kullanılarak batı lekesi analizi yapıldı. Bayrak etiketinin Ddx3 lokusunda siteye yönlendirilmiş olarak eklenmesi, ekleme alanını (orta panel) kuşaten astarlar kullanılarak veya Bayrak etiketi sırasını tanıyan bir ileri astar ve Bayrak ekleme sitesinin Ddx3 lokus aşağı akışına özgü bir ters astar (alt panel) kullanılarak PCR tarafından da test edildi. Kısaltmalar: EMX1 = Boş Spiracles Homeobox 1; DDX3 = DEAD-box RNA helicase 3; PCR = polimeraz zincir reaksiyonu; ODN = oligodeoksinükleotid; ssODN = şarkılı ODN; sgRNA = tek kılavuzlu RNA; IP = immün önksepitasyon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62245/62245fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62245/62245fig04.jpg"> Şekil 4: Nanoblades kullanılarak farklı birincil hücre tiplerinde elde edilen verimliliği düzenleme. Kısaltmalar: PBL = periferik kan lenfosit; IL = interleukin; CD = farklılaşma kümesi; iPSC = indüklenmiş pluripotent kök hücre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62245/62245fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Cas9/tek kılavuzlu RNA (sgRNA) ribonucleoprotein komplekslerini virüs benzeri parçacıklar içine yüklemek için basit ve ucuz bir protokol geliştirdik. "Nanoblades" adı verilen bu parçacıklar, Cas9/sgRNA kompleksinin ölümsüzleştirilmiş ve birincil hücrelerin yanı sıra in vivo olarak verimli bir şekilde teslimini sağlar.

Cas9/sgRNA Ribonucleoprotein Kompleksinin Virüs Benzeri Parçacıklar ("Nanoblades") aracılığıyla Ölümsüzleştirilmiş ve Birincil Hücrelerde Teslimi

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas system has democratized genome-editing in eukaryotic cells and led to the ...

Nanoblades, Cas9 ve kılavuz RNA kompleksinin hem ölümsüzleştirilmiş hem de birincil hücrelerde ve anti-transgene yokluğunda hızlı, verimli ve doza bağımlı olarak teslimine izin verdi. Bu yöntemin ana avantajı, nanoblades'in hazırlanması kolay ve nispeten ucuz olmasıdır. Cas9'u teslim edebilir ve RNA kompleksini doza bağımlı ve geçici bir şekilde yönlendirebilir, böylece hedef dışı etkileri sınırlayabilir ve verimli genom düzenlemesine izin verebilirler.Nanoblades için hazırlık protokolü çok basittir. Bununla birlikte, üretici hücrelerin kalitesi, kökenleri ve transfeksiyondan önce tohumlamaları, virüs benzeri parçacıkların yüksek verimini elde etmek için gereklidir. Prosedürü gösteren laura Guiguettaz olacak, laboratuvarımdan bir mühendis.İlk gün, 10 mililitre değiştirilmiş DMEM ve penisilin streptomisinin tohum 3,5 ila 4 milyon HEK 293T hücresi 10 santimetrelik hücre kültürü çanağı içinde. 24 saat sonra, hücreler% 70 izdihama ulaştığında, ortamı taze DMEM ile değiştirin ve transfeksiyon reaktif çözeltisini damla açısından eklemek için bir P-1000 pipet kullanın. 10 mililitrelik pipet ile kültür orta supernatant toplayarak dördüncü günde nanoblades toplamaya başlayın.Bu aşamada kültür ortamının renginin sarıya dönmesi normaldir. Toplanan süpernatantı hücresel kalıntıları gidermek için beş dakika boyunca 500 G'de santrifüjleyin ve hücre peletini bozmadan süpernatantın dokuz mililitresini kurtarın. Nanoblades'i 209,490 G'de bir ultracentrifuge'da 75 dakika boyunca dört santigrat derecede peletleyin.Santrifüjlemeden sonra, ortamı yavaşça emiş edin ve beyaz peleti 100 mikrolitre soğuk PBS ile yeniden depolayın. Tüpü parafilm ile örtün ve hafif ajitasyonla dört santigrat derecede bir saat kuluçkaya yaslanın. Daha sonra, yukarı ve aşağı pipetleme yaparak peletin tekrar yeniden ıslatın.PBS'de %10 sakkaroz çözeltisi hazırlayın ve 0,2 mikrometre şırınga filtresinden filtreleyin. %10 sakkarozun 2,5 mililitreini ultrasantrifüj tüpüne yerleştirin. Tüpü eğin ve tüpü kademeli olarak dikey konuma yükseltirken, düşük hızlı bir pipetle dokuz mililitre VLP içeren numuneyi yavaşça ekleyin.Tüpleri rotor kovalarına yerleştirin, ardından numuneleri 209, 490 G'de dört santigrat derecede 90 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı dikkatlice çıkarın ve kalan sıvıyı çıkarmak için tüpü kağıt mendilin üzerine baş aşağı yerleştirin. Didaktik amaçlar ve viral peletin daha iyi görselleştirilmesi için, floresan protein mCherry ile yüklü nanoblades hazırlanabilir.Bir dakika sonra 100 mikrolitre PBS ekleyin. Parafilm kapaklı tüpü bir ajitasyon masasında bir saat boyunca dört santigrat derecede bir tüp tutucusuna yerleştirin ve yukarı ve aşağı pipetleyarak peleti yeniden dirildirin. Dört birim PBS'de iyonik olmayan bir yüzey aktif madde içeren bir birim lizis arabelleği ekleyerek seyreltme arabelleğini hazırlayın.50 mikrolitre seyreltme tamponu ve girdapta iki mikrolitre konsantre nanoblades kısaca seyreltin. Karışımın 25 mikrolitresini 25 mikrolitre seyreltme tamponu içeren yeni bir tüpe aktarın ve altı tüp nanoblade seyreltme olması için prosedürü tekrarlayın. 50 mikrolitre seyreltme tamponuna iki mikrolitre rekombinant Cas9 çekirdeği ekleyerek standart kontrolü yapın, kısaca girdap yapın ve sekiz seri seyreltme yapın.Her VLP seyreltmenin 2,5 mikrolitresi ve her standardın 2,5 mikrolitresi nitroselüloz membran üzerine çok kanallı pipetle dikkatlice yer edin. Parçacıklar emildikten sonra, membranı oda sıcaklığında 45 dakika boyunca% 5 yağsız kuru sütle desteklenmiş TBST ile tıkayın. TBST'yi atın ve membranı Cas9 yaban turpu peroksidaz antikoru ile dört santigrat derecede bir gecede kuluçkaya yatırın.Membranı TBST ile üç kez yıkayın ve gelişmiş bir kemümünsan substrat kiti kullanarak sinyali görselleştirin. Hedef hücrelerin nanoblades ile transdüksiyon için, hücre kültürü ortamını saflaştırılmış nanoblades içeren ortamın 500 mikrolitresi ile değiştirin. Dört ila altı saat hücre inkübasyonundan sonra, ortamı normal taze ortam miktarına değiştirin.Protokolde, hücreler transfeksiyon gününde% 70 ila 80 izdiham ile homojen dağılım için tohumlandı ve 24 saat sonra birden fazla çekirdekle daha büyük hücrelere yol açan senktiya oluşturdu. Transfeksiyondan 40 saat sonra, çoğu hücre senksitia oluşturdu ve plakadan ayırmaya başladı. Nanoblades içinde yüklenen Cas9 miktarı, referans rekombinant Cas9'a kıyasla gelişmiş chemiluminescence gösteren bir nitroselüloz membran üzerinde bir nokta lekesi kullanılarak ölçüldü.Bilinen Cas9 miktarına karşı rekombinant Cas9 seyreltmeleri için nicel chemiluminescence sinyali için bir kalibrasyon eğrisi çizildi. Daha sonra, her nanoblade preparatında Cas9 protein konsantrasyonu haritalandı ve topludan topluluğa farklı Cas9 konsantrasyonları ortaya çıktı. T7 endonuclease tahlil, nanobladelerin verimliliğinin partiden topluya farklılık gösterebileceğini göstermiştir.Örneğin, bir toplu işlemin %20 genel düzenleme verimliliğine sahip olduğu gözlenirken, diğer toplu iş %60 verimlilik gösterdi. Flag-DDX3 proteinleri anti-bayrak agarose boncukları kullanılarak immün çöküntüye maruz kaldı ve ardından anti-bayrak antikoru kullanılarak geri kazanılan proteinlerin Batı blot analizi yapıldı. DDX3 lokusunda bayrak etiketinin siteye yönlendirilmiş olarak eklenmesi, ekleme alanını kuşatırken astarlar veya bayrak ekleme alanının aşağı akıştaki DDX3 lokus'a özgü ileri ve ters astarlar kullanılarak PCR tarafından da test edildi.Hücreleri doğru bir izdihama yerleştirmek ve hücrelerin eşit bir dağılımını elde etmek önemlidir. Nanoblade santrifüjleme üzerine, peletin yeniden canlanması ve konsantre viral parçacıkların homojen bir örneğinin elde edilmesi de önemlidir. Nanoblades, bilim adamlarının Cas9'u teslim ederek çift iplikli DNA kırılması onarım mekanizmasını incelemelerini ve RNA kompleksini belirli genomik locilere hızlı ve koordineli bir şekilde yönlendirmelerini sağladı.Ayrıca, rollerini incelemek için doğuştan gelen bağışıklık sisteminin birincil hücrelerinde uzun kodlamayan RNA'ları devre dışı bırakmayı mümkün kıldılar.

delivery-cas9sgrna-ribonucleoprotein-complex-immortalized-primary

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Source: Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the procedure for generating recombinant viral particles by transfecting embryonic kidney cells with plasmids encoding viral proteins and a gene of interest.

Generation of Recombinant Viral Particles Using Embryonic Kidney Cells

Bu video, genom düzenleme için hedef hücrelerin içine Cas9-sgRNA ribonükleoprotein kompleksinin nanoblade tabanlı iletimi için bir tekniği göstermektedir. Nanoblade'ler, komşu hücreleri çoğaltma ve enfekte etme yeteneğinden yoksun virüs benzeri parçacıklardır, bu nedenle biyo ve nanomalzemelerin hızlı ve doza bağlı taşınması için çok faydalıdır.

Nükleik Asit Kargosunun Nanoblade Tabanlı Dağıtımı: Cas9-sgRNA Kompleksini Virüs Benzeri Parçacıklar Yoluyla Hedef Hücrelere Ulaştırmak İçin Bir Teknik

CRISPR / Cas9 sistemi bilimsel topluluk hedeflenen genom düzenleme erişilebilir ve uygun fiyatlı hale getirmek için potansiyel sunmaktadır. Bu protokol CRISPR / Cas9 sistemi kullanılarak ilgilenilen geni nakavt, sonra yetişkin fare beyninin içine stereotaxically onları enjekte edecektir virüsleri oluşturmak için nasıl göstermek için tasarlanmıştır.

Tasarımı, Ambalaj ve Yüksek Titre CRISPR Retro ve Lentivirüslerden teslimi Stereotaksik enjeksiyon yoluyla

İntegrase-eksik lentiviral vektörler (IDLVs) üretim stratejisinin CRISPR/Cas9 hücrelere teslim etmek için Araçlar açıklanmaktadır. Hücrelerde hızlı ve sağlam gen düzenleme arabuluculuk için bir yetenek ile IDLVs bir daha güvenli sunmak ve eşit derecede etkili vektör platformu'gen dır integrase yetkili vektörlerinin karşılaştırıldığında.

Integrase-eksik Lentiviral vektörler üretimi için CRISPR/Cas9-aracılı Gene hücre bölünmesi içinde nakavt için bir iletişim kuralı

Preassembled Cas9 kullanan karmaşık Ribonükleoprotein (RNP) kesin, verimli genom düzenleme için güçlü bir yöntemdir. Burada, biz yararını hücreleri ve organizmalar, geniş aralığında birincil insan hücreleri ve her iki klasik de dahil olmak üzere ve model organizmalar gelişmekte olan vurgulayın.

Gelişmiş genom Cas9 Ribonükleoprotein yılında çeşitli ile hücreleri ve organizmaların düzenleme

Burada, genetik olarak Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs) kullanarak birincil veya genişletilmiş insan doğal öldürücü (NK) hücreleri değiştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralını kullanarak, biz insan NK hücreleri dönüştürme büyüme faktörü-b reseptör 2 (TGFBR2) ve hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) için eksik oluşturulan.

Cas9 Ribonucleoproteins kullanarak Knock-out birincil ve genişletilmiş insan NK hücre üretimi

Geleneksel overexpression cDNA tabanlı teknikleri sınırlı uygulanabilirliği için potansiyel işlevselliği ile birden çok ek yeri formlarını nedeniyle uzun kodlamayan RNA'ların overexpression var. Bu inceleme birden çok ek yeri değişik-in uzun kodlamayan RNA overexpress için CRISPR teknolojisini kullanan bir iletişim kuralı bildirir.

Gene aktive CRISPR kullanarak uzun kodlamayan RNA'ların overexpressing

DNA epigenome temsil düzenleme güçlü bir tedavi yaklaşımı hedef. Bu iletişim kuralı üretim, arıtma ve toplama tüm-içinde-bir lentiviral vektörlerin İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücre (hiPSC)'epigenome düzenleme uygulamaları için CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene yataklık açıklar-nöronlar türetilmiş.

Pluripotent kök hücre kaynaklı hastalık modelleri lentiviral vektör platformu için Epigenome düzenleme araçları verimli bir şekilde teslim insan içine indüklenen

Burada sunulan verimli CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein aracılı gen düzenleme meme hücrelerinde tüp Elektroporasyon kullanarak bir protokoldür.

CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-boru Elektroporasyon tarafından aracılı hassas gen düzenleme

Influenza A virüsünün genomu sekiz ayrı kompleksleri, RNA ve protein olarak adlandırılan viral ribonükleoprotein kompleksleri (vRNPs) oluşur. Bu yazıda, gliserol degrade arıtma ve influenza A vRNPs transmisyon elektron mikroskobu görselleştirme açıklamaktadır.

İnfluenza A Viral ribonükleoprotein Kompleksleri saflaştırılması ve Görselleştirme

Keşfedin, Nanoblades ile ölümsüzleştirilmiş ve birincil hücrelerde Cas9/sgRNA kompleksinin hızlı, doza bağımlı ve geçici teslimatını. Bu yöntem, off-target etkileri azaltarak verimli genom düzenlemesi sağlar.

Cas9/sgRNA Ribonucleoprotein Kompleksinin Virüs Benzeri Parçacıklar (Nanoblades) aracılığıyla Ölümsüzleştirilmiş ve Birincil Hücrelerde Teslimi (Video) | JoVE Journal

Cas9/sgRNA Ribonucleoprotein Kompleksinin Virüs Benzeri Parçacıklar ("Nanoblades") aracılığıyla Ölümsüzleştirilmiş ve Birincil Hücrelerde Teslimi

Daha fazla video keşfet