Cas9/sgRNA Ribonucleoprotein Kompleksinin Virüs Benzeri Parçacıklar ("Nanoblades") aracılığıyla Ölümsüzleştirilmiş ve Birincil Hücrelerde Teslimi

Nanoblades, Cas9 ve kılavuz RNA kompleksinin hem ölümsüzleştirilmiş hem de birincil hücrelerde ve anti-transgene yokluğunda hızlı, verimli ve doza bağımlı olarak teslimine izin verdi. Bu yöntemin ana avantajı, nanoblades'in hazırlanması kolay ve nispeten ucuz olmasıdır. Cas9'u teslim edebilir ve RNA kompleksini doza bağımlı ve geçici bir şekilde yönlendirebilir, böylece hedef dışı etkileri sınırlayabilir ve verimli genom düzenlemesine izin verebilirler.

Nanoblades için hazırlık protokolü çok basittir. Bununla birlikte, üretici hücrelerin kalitesi, kökenleri ve transfeksiyondan önce tohumlamaları, virüs benzeri parçacıkların yüksek verimini elde etmek için gereklidir. Prosedürü gösteren laura Guiguettaz olacak, laboratuvarımdan bir mühendis.

İlk gün, 10 mililitre değiştirilmiş DMEM ve penisilin streptomisinin tohum 3,5 ila 4 milyon HEK 293T hücresi 10 santimetrelik hücre kültürü çanağı içinde. 24 saat sonra, hücreler% 70 izdihama ulaştığında, ortamı taze DMEM ile değiştirin ve transfeksiyon reaktif çözeltisini damla açısından eklemek için bir P-1000 pipet kullanın. 10 mililitrelik pipet ile kültür orta supernatant toplayarak dördüncü günde nanoblades toplamaya başlayın.

Bu aşamada kültür ortamının renginin sarıya dönmesi normaldir. Toplanan süpernatantı hücresel kalıntıları gidermek için beş dakika boyunca 500 G'de santrifüjleyin ve hücre peletini bozmadan süpernatantın dokuz mililitresini kurtarın. Nanoblades'i 209,490 G'de bir ultracentrifuge'da 75 dakika boyunca dört santigrat derecede peletleyin.

Santrifüjlemeden sonra, ortamı yavaşça emiş edin ve beyaz peleti 100 mikrolitre soğuk PBS ile yeniden depolayın. Tüpü parafilm ile örtün ve hafif ajitasyonla dört santigrat derecede bir saat kuluçkaya yaslanın. Daha sonra, yukarı ve aşağı pipetleme yaparak peletin tekrar yeniden ıslatın.

PBS'de %10 sakkaroz çözeltisi hazırlayın ve 0,2 mikrometre şırınga filtresinden filtreleyin. %10 sakkarozun 2,5 mililitreini ultrasantrifüj tüpüne yerleştirin. Tüpü eğin ve tüpü kademeli olarak dikey konuma yükseltirken, düşük hızlı bir pipetle dokuz mililitre VLP içeren numuneyi yavaşça ekleyin.

Tüpleri rotor kovalarına yerleştirin, ardından numuneleri 209, 490 G'de dört santigrat derecede 90 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı dikkatlice çıkarın ve kalan sıvıyı çıkarmak için tüpü kağıt mendilin üzerine baş aşağı yerleştirin. Didaktik amaçlar ve viral peletin daha iyi görselleştirilmesi için, floresan protein mCherry ile yüklü nanoblades hazırlanabilir.

Bir dakika sonra 100 mikrolitre PBS ekleyin. Parafilm kapaklı tüpü bir ajitasyon masasında bir saat boyunca dört santigrat derecede bir tüp tutucusuna yerleştirin ve yukarı ve aşağı pipetleyarak peleti yeniden dirildirin. Dört birim PBS'de iyonik olmayan bir yüzey aktif madde içeren bir birim lizis arabelleği ekleyerek seyreltme arabelleğini hazırlayın.

50 mikrolitre seyreltme tamponu ve girdapta iki mikrolitre konsantre nanoblades kısaca seyreltin. Karışımın 25 mikrolitresini 25 mikrolitre seyreltme tamponu içeren yeni bir tüpe aktarın ve altı tüp nanoblade seyreltme olması için prosedürü tekrarlayın. 50 mikrolitre seyreltme tamponuna iki mikrolitre rekombinant Cas9 çekirdeği ekleyerek standart kontrolü yapın, kısaca girdap yapın ve sekiz seri seyreltme yapın.

Her VLP seyreltmenin 2,5 mikrolitresi ve her standardın 2,5 mikrolitresi nitroselüloz membran üzerine çok kanallı pipetle dikkatlice yer edin. Parçacıklar emildikten sonra, membranı oda sıcaklığında 45 dakika boyunca% 5 yağsız kuru sütle desteklenmiş TBST ile tıkayın. TBST'yi atın ve membranı Cas9 yaban turpu peroksidaz antikoru ile dört santigrat derecede bir gecede kuluçkaya yatırın.

Membranı TBST ile üç kez yıkayın ve gelişmiş bir kemümünsan substrat kiti kullanarak sinyali görselleştirin. Hedef hücrelerin nanoblades ile transdüksiyon için, hücre kültürü ortamını saflaştırılmış nanoblades içeren ortamın 500 mikrolitresi ile değiştirin. Dört ila altı saat hücre inkübasyonundan sonra, ortamı normal taze ortam miktarına değiştirin.

Protokolde, hücreler transfeksiyon gününde% 70 ila 80 izdiham ile homojen dağılım için tohumlandı ve 24 saat sonra birden fazla çekirdekle daha büyük hücrelere yol açan senktiya oluşturdu. Transfeksiyondan 40 saat sonra, çoğu hücre senksitia oluşturdu ve plakadan ayırmaya başladı. Nanoblades içinde yüklenen Cas9 miktarı, referans rekombinant Cas9'a kıyasla gelişmiş chemiluminescence gösteren bir nitroselüloz membran üzerinde bir nokta lekesi kullanılarak ölçüldü.

Bilinen Cas9 miktarına karşı rekombinant Cas9 seyreltmeleri için nicel chemiluminescence sinyali için bir kalibrasyon eğrisi çizildi. Daha sonra, her nanoblade preparatında Cas9 protein konsantrasyonu haritalandı ve topludan topluluğa farklı Cas9 konsantrasyonları ortaya çıktı. T7 endonuclease tahlil, nanobladelerin verimliliğinin partiden topluya farklılık gösterebileceğini göstermiştir.

Örneğin, bir toplu işlemin %20 genel düzenleme verimliliğine sahip olduğu gözlenirken, diğer toplu iş %60 verimlilik gösterdi. Flag-DDX3 proteinleri anti-bayrak agarose boncukları kullanılarak immün çöküntüye maruz kaldı ve ardından anti-bayrak antikoru kullanılarak geri kazanılan proteinlerin Batı blot analizi yapıldı. DDX3 lokusunda bayrak etiketinin siteye yönlendirilmiş olarak eklenmesi, ekleme alanını kuşatırken astarlar veya bayrak ekleme alanının aşağı akıştaki DDX3 lokus'a özgü ileri ve ters astarlar kullanılarak PCR tarafından da test edildi.

Hücreleri doğru bir izdihama yerleştirmek ve hücrelerin eşit bir dağılımını elde etmek önemlidir. Nanoblade santrifüjleme üzerine, peletin yeniden canlanması ve konsantre viral parçacıkların homojen bir örneğinin elde edilmesi de önemlidir. Nanoblades, bilim adamlarının Cas9'u teslim ederek çift iplikli DNA kırılması onarım mekanizmasını incelemelerini ve RNA kompleksini belirli genomik locilere hızlı ve koordineli bir şekilde yönlendirmelerini sağladı.

Ayrıca, rollerini incelemek için doğuştan gelen bağışıklık sisteminin birincil hücrelerinde uzun kodlamayan RNA'ları devre dışı bırakmayı mümkün kıldılar.