Ultrason Tetiklenen İlaç Salınımı için Floresan Etiketli Mikrobubbles'ın Karakterizasyonu için Çok Zamanlı Mikroskopi Yöntemleri

Bu protokol, aktivasyon mekanizmalarını ve biyoeffectleri içeren ultrason tetiklenmiş ilaç dağıtım uygulamaları için tasarlanmış floresan etiketli mikrobubbles yanıtını karakterize etmek için kullanılabilir. Anahtar, ultrasonla tetiklenen ilaç dağıtımının çok ölçekli sorununu hem farklı mekansal ölçeklerde hem de farklı zaman ölçeklerinde kabarcıklarla çözmemizi sağlayan görüntüleme tekniklerinin kombinasyonunda yatmaktadır. Brightfield mikroskopisi ile tek kabarcık görüntüleme için, 19 kalibrelik bir havalandırma iğnesi yerleştirin ve bir sonraki adımda daha kolay pipetleme için cam şişeden küçük bir miktar mikrobubble süspansiyonunu küçük bir tüpe çıkarmak için 19 kalibrelik bir iğne ile donatılmış bir mililitre şırınga kullanın.

Bir pipet kullanarak, mikrobubble çözeltisini filtrelenmiş fosfat tamponlu salin ile seyreltin. Numuneyi, hava kabarcıkları oluşturmadan, gerekirse numunenin daha fazlasını enjekte edene kadar numune tutucunun bir çıkışına enjekte etmek için 10 mililitrelik bir şırınna kullanın. Numune tutucunun her iki vanasını da kapatın ve numune tutucuyu mikroskobun optik eksenine dik olarak yerleştirin.

Örnek analizinden önce, rastgele dalga biçimi jeneratörü üzerinde istenen ultrason sürüş frekansını ve akustik basıncı ayarlayın ve numune tutucunun bir köşesindeki görüş alanından başlayarak, mikroskobun görüş alanındaki tek mikrobubbles'ı bulmak için tutucuyu hareket ettirmek için XYZ aşamasını kullanın, ardından bir su banyosuna bağlı optik bir fiberi bir flaş ışığına takın ve kaydı başlatın. Görüntülemeyi ultrason ayarı başına istediğiniz kadar tekrarlayın, numune tutucuyu her analiz için en az iki milimetrelik bir görüş alanına taşıyın. Mikrobubbles floresan mikroskobik görüntüleme için, gösterildiği gibi fosfat tamponlu salin içinde mikrobubble çözeltisini seyrelttikten sonra, keyfi dalga biçimi jeneratörü üzerinde istenen ultrason sürüş frekansını ve akustik basıncı ayarlayın ve nanopartiküllerin mikrobubbles'tan floresan uyarılması için nabız gecikme jeneratörü üzerindeki lazerin tetik gecikmesini ayarlayın, ardından XYZ aşamasını kullanarak numune tutucuyu hareket ettirerek tek mikrobubbles'ı bulun ve odak noktasına getirin hedefi, sonra kaydı tetikleyin.

Ultrason ayarlarını değiştirerek ve numune tutucuyu gösterildiği gibi yeni görüş alanına taşıyarak görüntülemeyi istediğiniz gibi tekrarlayın. İntravital mikroskopi ile görüntüleme için, önce ısıtılmış bir hayvan tutucuyu XY konumlandırma aşamasına dalga kılavuzu ile amaç arasında yerleştirin ve dalga kılavuzuna kavrama jeli ekleyin. Anestezi edilmiş tümör taşıyan bir farenin kuyruk damarına bir kuyruk damarı kateteri yerleştirin ve pencere haznesi ile donatılmış fareyi ısıtılmış tutucuya yerleştirin.

Kapak kılıfı içine bir su damlası ekleyin. Tümör dokusu vaskülatını görselleştirmek için, kuyruk damar kateterine mililitre floresan olarak etiketlenmiş mililitre başına dört miligramdan oluşan 30 mikrolitre enjekte edin ve uygun kan damarlarına sahip bir görüş alanı bulunana kadar fareyi hareket ettirmek için XY çeviri aşamasını kullanın. Denemenin parametrelerine göre kaydın kare hızını, görüş alanını ve uzunluğunu ayarlayın ve gemilerin temel görüntülerini kaydedin.

Taban çizgisi görüntüleri elde edildiğinde, ultrason sürüş frekansını, darbe uzunluğunu ve akustik basınç genliğini rastgele dalga biçimi jeneratörüne ayarlayın ve kuyruk damarına intravenöz olarak 50 mikrobubble örneği enjekte edin. Sonra gösterildiği gibi vaskülat görüntü. Mikrobubblelerin konfokal floresan mikroskopi ile analizi, mikrobubble kabuğunun homojen olmayan parçacık dağılımını ortaya koymaktadır.

Elektron mikroskopisi taranarak mikrobubbles'ın genel yapısı daha da görselleştirilebilir. Brightfield mikroskopisi ile inzomuzlaştırılmış mikrobubblenin radyal dinamiklerinin ve fenomenolojik davranışlarının analizi, mikrobubble yarıçapındaki göreceli değişimin zaman içinde değerlenmesine olanak tanır. Burada, floresan etiketli nanopartiküllerin tipik başarılı bir şekilde teslim edildiğini gösteren bir görüntü dizisi gösterilmiştir.

Mikrobubble kabuğuna gömülü nanopartiküllerin lazer ışığı balona ulaştığında floresan olduğu gözlenebilir. Bununla birlikte, bu başarısız doğumda gözlemlendiği gibi, floresan nanopartiküller ultrason maruziyeti sırasında bozulmadan kalan mikrobubble kabuğuna ışık tutar. Ultrason aracılı nanopartikül teslimatının altında yatan mekanizmaları anlamak ve optimize etmek için yararlı olabilecek ultrason maruziyeti sırasında nanopartiküllerin mekansal ve zamansal ekstravazasyonunu belirlemek için intravital çoklu foton görüntüleme kullanılabilir.

Optik ve akustik yolların tüm uzunluk ve zaman ölçeklerinde mükemmel hizalanmasıyla, ultrasonla tetiklenen ilaç teslimatı hakkında kapsamlı bir içgörü sağlanır. Çok ölçekli deneylerimiz tarafından sunulan cevaplar artık klinik uygulamaya çevrilecek. Sonuçlar, kanser tedavisi de dahil olmak üzere bir dizi terapötik uygulama için değerli bilgiler sağlayacaktır.